用于在与暴露于致命辐射相关症状的治疗中使用的咪唑基乙酰胺戊二酸

摘要

本发明涉及咪唑基乙酰胺戊二酸用于预防或治疗辐射诱发的损伤的用途。本发明进一步涉及用于在治疗或预防辐射诱发的损伤中使用的组合药物，其包含咪唑基乙酰胺戊二酸以及G‑CSF或GM‑CSF。

说明书

技术领域

本发明涉及咪唑基乙酰胺戊二酸用于治疗或预防辐射诱发的损伤的用途。

背景技术

人和动物极易受到辐射诱发的损伤，从而导致细胞、组织、器官和全身性损伤。在诸如核辐射或灾情等意外辐射暴露中，许多受害者将在不同程度上遭受急性放射综合症(ARS)的折磨。辐射灾难现场的近期目标与癌症的放射治疗有很大不同。在这种灾难情况下，尽早的努力包括使尽可能多的患难者获得可延长寿命的治疗，从而使受害者能够成功地分诊并根据他们的病情而接受后续的深入医疗护理。辐射灾难管理的另一个方面是，辐射灾难发生后，必须在拖延的时间点提供任何挽救生命的药物或治疗。这项要求是由于需要时间来动员医务人员、药物/治疗和设备前往灾难现场，以便可以向受害者施用挽救生命的药物/治疗。FDA要求在放射暴露后不迟于24小时施用的医疗对策必须有效。

除了灾难引起的偶然辐射暴露外，辐射诱发的对细胞、组织、器官和全身的损伤可能是在疾病(例如癌症)的治疗过程中暴露于辐射的结果。超过40％的癌症患者在疾病管理期间需要放身疗法。尽管放射疗法可改善许多癌症患者的存活率，但急性放射毒性(在临床放射疗法过程中或此后不久即表现出来)和晚期毒性(在放射疗法完成后数月至数年内发展)均会影响成功治疗的癌症患者的总体预后。

当前，有一些试剂可以保护细胞和组织免受癌症中使用的放射治疗的影响，例如集落刺激因子(CSF)。对于意外或有意的辐射暴露，FDA批准了三种医学对策，这些对策显示，全身照射后小鼠和NHP的存活率增加。然而，所有这三种药物都是通过皮下注射给药的，这在发生大量人员伤亡的情况下可能不方便。

基于上述现有技术，本发明的目的是在人类受试者中提供治疗或预防辐射诱发的损伤的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。

发明内容

在本说明书的上下文中，术语“咪唑基乙酰胺戊二酸”涉及5–{[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]氨基}-5-氧代-戊酸(CAS号219694-63-0)。术语“Myelo001”是咪唑基乙酰胺戊二酸的同义词。

在本说明书上下文中，术语“G-CSF”涉及粒细胞集落刺激因子。

在本说明书上下文中，术语“GM-CSF”涉及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

在本说明书上下文中，术语“peg-G-CSF”或“peg-GM-CSF”涉及聚乙二醇化的G-CSF或GM-CSF。聚乙二醇化涉及用聚乙二醇的修饰。

在本说明书上下文中，术语“lipeg-G-CSF”涉及通过由甘氨酸、N-乙酰神经氨酸和N-乙酰半乳糖胺组成的碳水化合物接头与单个甲氧基PEG分子共价连接的粒细胞集落刺激因子。

如本文所用，术语“治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)”在一个实施方式中是指改善所述疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方式中，“治疗(treating,treatment)”是指缓解或改善至少一种身体参数，包括患者可能无法辨别的那些参数。在另一个实施方式中，“治疗”是指在身体上(例如可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如身体参数的稳定化)或两者上调节疾病或病症。“治疗”还指在疾病、病症或损伤的触发事件之后施用。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的。

本领域技术人员了解任何具体提及的药物均可以作为所述药物的药学上可接受的盐而存在。药学上可接受的盐包含离子化的药物和带相反电荷的抗衡离子。药学上可接受的阴离子盐形式的非限制性实例包括乙酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、双羟萘酸盐、依托酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、水杨酸盐、双水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物和戊酸盐。药学上可接受的阳离子盐形式的非限制性实例包括铝、苄星、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、氨丁三醇和锌。

剂型可以是用于肠内给药，例如经鼻、经颊、经直肠、经皮或口服施用，或作为吸入形式或栓剂。或者，可以使用肠胃外给药，例如皮下、静脉内、肝内或肌内注射形式。任选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的第一方面涉及咪唑基乙酰胺戊二酸用于治疗或预防辐射诱发的损伤。

在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以0.4mg/kg至12mg/kg体重(b.w.)的剂量施用于人类患者。在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以1.2mg/kg至12mg/kg体重的剂量施用于人类患者。在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以4mg/kg至12mg/kg体重的剂量施用于人类患者。

在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以0.5mg/kg至3.75mg/kg体重的剂量施用于2至16岁的患者。在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以1.25mg/kg至3.25mg/kg体重的剂量施用于2至16岁的患者。在某些实施方式中，将咪唑基乙酰胺戊二酸以1.25mg/kg体重的剂量每天两次施用于2至16岁的患者。

在某些实施方式中，在辐射暴露之前1小时至120小时施用咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露之前1小时至120小时施用咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露之前1小时至72小时施用咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露之前6小时至48小时施用咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露之前12小时至24小时施用咪唑基乙酰胺戊二酸。

在某些实施方式中，在辐射暴露后24小时至120小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露后24小时至72小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露后24小时至48小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。

在某些实施方式中，在辐射暴露后6小时至72小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露后8小时至48小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。在某些实施方式中，在辐射暴露后12小时至24小时施用第一剂量的咪唑基乙酰胺戊二酸。

在某些实施方式中，辐射剂量为0.2Gy至35Gy的全身照射。在某些实施方式中，辐射剂量为0.2Gy至13.5Gy的全身照射。

在某些实施方式中，辐射剂量为0.2Gy至4.0Gy的每日全身辐射。

在某些实施方式中，辐射剂量为20Gy至80Gy的焦点辐射。

在某些实施方式中，辐射剂量为1.8Gy至30Gy的每日焦点辐射。在某些实施方式中，辐射剂量为1.8Gy至2.0Gy的每日焦点辐射。

在某些实施方式中，2至17岁(特别是2至16岁，更特别是3至16岁)的患者的辐射剂量为1.5Gy至30Gy的每日焦点辐射(儿科放射治疗)。在某些实施方式中，2至17岁(特别是2至16岁，更特别是3至16岁)的患者的辐射剂量为1.5至1.8Gy的每日焦点辐射(儿科放射疗法)。

在某些实施方式中，以足以产生与急性辐射综合征(ARS)相关的症状的急性致死剂量或接近致死剂量接受辐射。在某些实施方式中，辐射产生急性辐射暴露的延迟效应(DEARE)，其包括影响多器官系统的多种慢性疾病。

在某些实施方式中，辐射诱发的损伤由放射疗法、放射性同位素污染(例如核反应堆的意外泄漏)、慢性低剂量宇宙辐射或核武器的辐射引起。在某些实施方式中，辐射诱发的损伤由癌症治疗中的放射疗法引起。

在某些实施方式中，放射疗法包括X射线、γ或中子放射。在某些实施方式中，放射疗法使用Co60、137Cs、碘-131、镥-177、钇-90、镭-223、锶-89、钐(153Sm)或来昔屈南(lexidronam)作为其发射源。

在某些实施方式中，咪唑基乙酰胺戊二酸经口、腹膜内和静脉内给药，特别是经口给药。

在某些实施方式中，咪唑基乙酰胺戊二酸每天给药，持续至少三天。在某些实施方式中，咪唑基乙酰胺戊二酸每天给药，持续五至十天。

在某些实施方式中，在辐射暴露后，每天给药咪唑基乙酰胺戊二酸，持续至少三天。在某些实施方式中，在辐射暴露后，每天给药咪唑基乙酰胺戊二酸，持续五至十天。

在某些实施方式中，辐射诱发的损伤由电离辐射引起。在某些实施方式中，辐射诱发的损伤由光子辐射引起。

在某些实施方式中，治疗模式包括外束放射疗法，特别地，外束放射疗法选自强度调制放射疗法(IMRT)、图像引导放射疗法(IGRT)、断层放疗、立体定向放射外科手术、立体定向身体放射疗法、光子束、电子束以及质子或中子疗法。

在某些实施方式中，放射疗法包括内部放射疗法。在某些实施方式中，放射疗法包括近距离放射疗法。在某些实施方式中，放射疗法包括全身性放射疗法。在某些实施方式中，放射疗法包括治疗性意外放射过度暴露(例如医源性用药过量或处置事故)。

在某些实施方式中，咪唑基乙酰胺戊二酸与G-CSF、GM-CSF、lipeg-G-CSF、peg-G-CSF或peg-GM-CSF组合给药。在某些实施方式中，G-CSF、GM-CSF、lipeg-G-CSF、peg-G-CSF或peg-GM-CSF以2μg/kg体重/天到30μg/kg体重/天的剂量给药。在某些实施方式中，G-CSF、GM-CSF、lipeg-G-CSF、peg-G-CSF或peg-GM-CSF以2.8μg/kg体重/天到10μg/kg体重/天的剂量给药。

本发明的第二方面涉及一种用于治疗或预防辐射诱发的损伤的组合药物。该组合药物包含：

-咪唑基乙酰胺戊二酸和

-G-CSF、GM-CSF、lipeg-G-CSF、peg-G-CSF或peg-GM-CSF。

无论在本文中任何地方将单一可分离特征(例如给药方案或医学适应症)的替代方案作为“实施方式”进行阐述，都应理解为此类替代方案可自由组合以形成本文所公开的本发明的离散实施方式。因此，给药方案的任何替代实施方式可以与本文提及的医学适应症的任何替代实施方式组合。

通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图中可以得到进一步的实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明，而不是限制其范围。

附图说明

图1：未治疗组、载体组和在5.8Gy辐射剂量之前接受预防性治疗的三组中的Kaplan-Meier生存函数。

图2：未治疗组、载体组和在5.8Gy辐射剂量后接受治疗性治疗的两组中的Kaplan-Meier生存函数。

图3：未治疗组、载体组和在6Gy辐射剂量后接受治疗性治疗的单一组中的Kaplan-Meier生存函数。

图4：(A)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的姿势分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(B)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的姿势分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(C)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的姿势分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。

图5：(A)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的皮毛分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(B)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的皮毛分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(C)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的皮毛分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。

图6：(A)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的行为分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(B)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的行为分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。(C)：在第0、3、9、15、21和30天(AM)，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的行为分级类别(ARS评分的一部分)中动物的百分比。

图7：(A)：在组8(VH(POx1)；8)中，随时间的推移，辐射对体重的影响(体重相对于基线体重随时间的变化)。(B)：在第3天和第30天之间，在组9(MH(POx1)；9)中，随时间的失衡，治疗对体重的影响(相对于对照组8(VH(POx1)；8)，体重随时间的变化)。(C)：在未治疗组(U；1)、载体组8(VH(POx1)；8)和Myelo001治疗组9(MH(POx1)；9)中，从第0天至第30天，随时间测量的个体动物(蓝色)的体重分布。显示了每个治疗组中LOWESS平滑的平均重量(红色)。

图8：白细胞计数。(A)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的白细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(B)：在第0、7、14和30天，在组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的白细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(C)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的白细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。

图9：绝对中性粒细胞计数。(A)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的ANC(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(B)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的ANC(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(C)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的ANC(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。

图10：绝对淋巴细胞计数。(A)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的绝对淋巴细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(B)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的绝对淋巴细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(C)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的绝对淋巴细胞计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。

图11：绝对血小板计数。(A)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的绝对血小板计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(B)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的绝对血小板计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(C)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的绝对血小板计数(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。

图12：血红蛋白。(A)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)的血红蛋白(g/dL)(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(B)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)的血红蛋白(g/dL)(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。(C)：在第0、7、14和30天，组1(U；1)、组8(VH(POx1)；8)和组9(MH：(POx1)；9)的血红蛋白(g/dL)(箱形图：中值，25％-75％，下/上相邻值，外部值)。

图13：睾丸。(A)：组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)中根据四个类别(最小、轻度、中度和显著)的睾丸变性严重程度的百分比。(B)：组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中根据四个类别(最小、轻度、中度和显著)的睾丸变性的严重程度的百分比。(C)：组8(VH(POx1)；8)和组9(MH(POx1)；9)中根据四个类别(最小、轻度、中度和显著)的睾丸变性的严重程度的百分比。

图14：骨髓细胞性。(A)：组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)中根据四个类别(最小、轻度、中度和显著)的骨髓细胞性降低百分比。(B)：组2(VL(POx1)；2)、组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中按照四个类别(最小、轻度、中度和显著)的骨髓细胞性降低百分比。(C)：组8(VH(POx1)；8)和组9(MH(POx1)；9)中按照四个类别(最小、轻度、中度和显著)的骨髓细胞性降低百分比。

实施例

协议和研究执行

本研究符合协议和SNBL USA(当前为Altasciences)标准操作程序(SOP)。影响数据的质量或完整性的偏差和事件已经在可应用的报告部分中另外描述。

将照射的初始日指定为第0天，后续天数连续编号。将照射前的研究日连续编号，将适应环境的最后一天指定为第-1天。

辐射与剂量学

基于先前报道的研究(Williams et al.2010,Plett et al.2012,Chua etal.2014,Singh et al.,2015)，开发了小鼠模型以研究LD 25和LD 50。全身照射和选择的剂量用作模仿在核事件后对人的可能辐射暴露的平移体内模型。

辐射

物质

测试品

阳性对照品

载体(阴性对照)

动物

SNBL USA,Ltd(以下称SNBL USA)获得了实验动物护理评估鉴定协会(AAALAC)认可，具有实验动物福利部(OLAW)发布的动物福利担保，在美国农业部(USDA)注册，并具有机构动物护理和使用委员会(IACUC)，其负责SNBL USA遵守关于实验动物人道和使用的适用法律和规定。

动物(C57BL/6小鼠)由Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME Facility)提供。在研究任务之前，将动物维持在SNBL USA(Everett，WA Facility)作为储备，并在用于研究之前由兽医人员筛选健康。将205只动物分配到治疗组。

定量给药

口服Myelo001将有益于核或其它辐射事件，并被选择用于本研究。选择在照射前3天，给药50mg/kg的剂量。基于异速计算，人类等效剂量评估为4mg/kg。

表1：定量给药

NA＝不适用；Conc.＝浓度；OG＝口胃；IP＝腹腔注射；

SC＝皮下；SID＝每天一次；LD＝致死剂量

x＝给药的总次数(12小时，间隔±1小时)；

a＝基于最近的体重计算总剂量体积(mL)。

b＝在第0天尸体剖检

c＝在第7天尸体剖检

d＝在第14天尸体剖检

e＝在第30天尸体剖检

表2：组的命名和缩写

ARS评分

本研究的主要结果是死亡率，次要结果是血液学(外周和骨髓)的变化。选择终点以遵循动物规则要求，其规定动物研究终点明确地与临床益处(通常是提高存活或预防重大发病)相关。选择次要终点以潜在地有助于理解疾病或病情和表征治疗效果。

对于姿势、皮毛和行为，从第-3天开始，除了在计划尸体剖检当天仅进行一次评分之外，依照SNBL SOP，在1至4的等级(最小、轻度、中度和严重)上每天记录两次评分。在研究过程中由5个个体进行观察。

在第0天之后，第一次ARS评分从早晨开始，第二次ARS评分在早晨ARS评分完成后4至6小时开始。在计划尸体剖检当天，ARS评分在早晨在尸体剖检前进行。

基于ARS评分SNBL SOP，如果三个参数得分的总和总计为8或更高，则认为该动物垂死，并根据垂死动物SOP进行不定期的尸体剖检安乐死。

在第-3天后，根据SOP检查笼侧死亡率，每天两次。早晨和下午在完成相应ARS评分后2至3小时开始检查。仅对通过重新评分显示明显垂死动物记录单独评估，或仅对通过移除发现的死动物记录单独评估。

在适应环境期间(包括第-3天)评价体重两次，在照射前(第0天)评估一次，此后每3天评估一次。除动物4012外，还收集了最终体重。

统计分析

使用Kaplan-Meier方法描述性地和图解地总结了存活数据。此外，死亡率通过处理进行列表。用对数秩检验检验了两个或更多个存活曲线的相等性。此外，使用Cox回归模型评估危险比、p值和95％置信区间(95％CI)。

存活分析的焦点是第0天和第30天的照射之间的辐射相关死亡。因此，第7天和第14天的计划尸体剖检或与辐射无关的死亡(动物2041、9012和9021)被认为是审查事件。

将Stata 14(Stata Corp.,4905Lakeway Drive,College Station,TX 77845,USA)用于所有其它计算。

通过响应分布图分析(Fitzmaurice et al.,Wiley 2004,p 103-140.)考虑每组随时间的平均重量和重复测量之间的协方差来分析纵向数据。将分析指定为具有非结构化协方差的回归模型，以考虑相同小鼠的重复体重与治疗组和时间的指示变量之间的相关性，其中将载体治疗用作参照组，并且将第0天作为时间参照。

响应分布分析提供了由限制最大似然(REML)方法评估的以下回归系数：

截距-第0天，参照组VL(POx1)；2和VH(POx1)；8中的平均体重

治疗-第0天，治疗组和载体组中平均体重之间的差

时间-对照组中从基线的体重变化

治疗x时间-通过比较治疗组和对照组中从基线的变化来评估每天的治疗效果

对于所有回归系数，提供p值和95％置信区间。该方法提供了可解释的评估，如果治疗组在基线处不同则该方法是有效的，允许随时间变化的平均体重的任意模式(没有特定的时间趋势，例如假定的线性曲线)和协方差的任意模式。由于模型误定所引起的潜在风险最小，因此该分析具有一定的鲁棒性。

动物死亡率数据汇总包括在表3至表4中，Kaplan-Meier图包括在图1至图3中，动物2041和9021在第3天被安乐死，动物9012在第4天被安乐死。基于SNBL的历史数据，辐射相关症状的发作通常不早于第7天发生。因此，对于这三只动物，照射作用不被认为是垂死状态的原因。另外，3只动物中有2只的胸腔积液的总体病理观察表明，垂死状态可能与剂量给药有关。因此，将这些动物从死亡率评估和所有存活计算中排除。

表3列出了照射相关死亡率的概述，死亡数除以危险时间。达到10％死亡的时间列于表4。对于载体组2(VL(POx1)；2)和8(VH(POx1)；8)，在5.8和6Gy的辐射剂量下观察到每100天0.65和1.48的死亡率。对于预防组，发现死亡率为每100天0.44至1.30。对于使用G-CSF的治疗性治疗(组6)，在低辐射剂量下观察到每100天0.42的死亡率，而在使用组合治疗的组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中，在30天内没有发生死亡。组9(MH(POx1)；9)的死亡率低于相应的对照组8(VH(POx1)；8)(分别为每100天0.48和1.48)。

在下文中，分别呈现了预防性和治疗性治疗的存活。在载体组中，达到10％死亡的时间为17天，对于预防性治疗，评估范围为13至21天。对数秩检验没有显示出组2(VL(POx1)；2)、组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)的存活曲线之间的统计学显著差异(p＝0.337)。用控制治疗效果的Cox回归的进一步分析没有显示出显著的预防效果(表5)。

对于使用G-CSF的治疗性治疗，达到10％死亡的时间为12天，在使用组合治疗的组M/GL(PO/SCx1)；7中，直至第30天仍未观察到死亡。对数秩检验未显示出VL(POx1)；2、GL(SCx1)；6和M/GL(PO/SCx1)；7的存活曲线之间的显著差异(p＝0.469)。控制治疗效果的附加Cox回归没有显示出GL(SCx1)；6的显著治疗效果(表6)。

在6Gy的高辐射剂量后，在载体组中达到10％死亡的时间是16天(95％CI，12至29)，而用Myelo001治疗性治疗是23天(95％CI，12至n.a.)。尽管对数秩检验在VH(POx1)；8和(p＝0.066)的存活曲线之间没有达到显著差异，但描述性数据表明了有利于MH(POx1)；9的积极效果。用控制治疗效果的Cox回归的进一步分析证实了这一发现。危险比为0.32(p＝0.085；95％CI，0.09至1.17)(表7)。

剂量减少因子(DRF)计算为30天后在载体组中的存活率与相应预防性和治疗性治疗的存活率的比率，其值最高为1.5。在6Gy高剂量下使用Myelo001的治疗性治疗观察到了1.5的最大DRF(表8)。

在第15天观察到治疗动物的姿势评分分布的显著差异。在组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)中观察到的频率最高的等级(模式)与对照组2(VL(POx1)；2)(轻度)相比是正常的。治疗性治疗组6(GL(SCx1)；6)和7(M/GL(PO/SCx1)；7)也显示在姿势评分中的模式为正常，而对照组2(VL(POx1)；2)主要(65％)显示为轻度。在第30天，与对照组8(VH(POx1)；8)相比，在组9(MH(POx1)；9)中观察到正常姿势得分的频率增加的趋势(图4A-C，表10)。

总之，在第15天，与对照组相比，用Myelo001进行的预防性治疗(组4、5)以及用单独的Myelo001和Myelo001+优保津进行的治疗性治疗(组6、7)导致正常姿势得分的频率增加。腹膜内给药低剂量Myelo001(组3(ML(IPx2)；

3))的治疗没有导致这种变化(图5A，B)。

在第9天，优保津治疗组6(GL(SCx1)；6)中的皮毛ARS评分显示轻度等级的百分比增加，这与载体治疗组2(VL(POx1)；2)和优保津与Myelo001治疗组7(M/GL(PO/SCx1)；7)相反，后者皮毛是正常的(图5B，表11)。

在用高剂量6Gy照射的治疗性治疗组中，Myelo001治疗组9(MH(POx1)；9)的皮毛等级(MH(POx1)；9)在第21天大部分是正常的，而在对照组8(VH(POx1)；8)中，可以观察到轻度(20％)和中度(27％)等级(图5C，表11)。

总之，与载体治疗组8(VH(POx1)；8)中的轻度和中度模式相比，在第21天，对皮毛的评分最频繁地揭示Myelo001治疗组9(MH：(POx1)；9)为正常等级。

辐射并未在所有组(组2至组9)中诱发动物行为评分的重大变化，并且统计学检验(Kruskal Wallis或Wilcoxon秩和检验)未显示出显著性差异(图6A-C，表12)。

总之，与组8(对照)相比，Myelo001治疗组9的姿势和皮毛的ARS评分有有利但较小的趋势(＝较低的评分)。治疗性治疗组6(GL(SCx1)；6)和7(M/GL(PO/SCx1)；7)在姿势和皮毛的得分分布上显示出显著差异。

在第0、3、9、15、21和30天进行体重的统计学分析(表13A-D)。未示出第6、12、18和24天的数据。分别讨论了预防性和治疗性治疗的体重变化。未治疗组1(U；1)随时间的推移增重。

预防性治疗结果

总结了预防性治疗和随后用5.8Gy照射的体重的统计结果。截距表明载体组VL(POx1)；2中在基线时的平均体重为27.6g(p＜0.001；95％CI：26.9至28.2g)。该对照组的平均体重从第3天至第30天显著降低。在第21天(时间)，载体组从基线体重的最大降低为-3.7g，p＜0.001；(-5.1至-2.2g)。没有证据表明，相对于载体组(治疗)，用Melo001预防性治疗的组有不同的平均重量。用Myelo001进行的预防性治疗倾向于在较小程度上补偿由于照射引起的体重减轻(治疗x时间)。

对于预防组3(ML(IPx2)；3)、4(ML(POx2)；4)和5(ML(POx1)；5)，在第3天显示出较小的保护作用。例如，在第3天，载体组中的平均体重为-1.9g，p<0.001；(-1.7至-2.1g)。ML(POx2)；4组中的平均体重比载体组超出0.7g(p＜0.001；95％CI：0.4至1.0g)。

治疗性治疗结果

汇总了用G-CSF(组6，(GL(SCx1)；6))和组合治疗的治疗性治疗。在第0天，载体组的平均体重为27.6g(p＜0.001；95％CI：27.0-28.1g)。在5.8Gy水平下照射后，该对照组的平均重量在第3天和第30天(时间)之间从基线显著降低。最大失重为-4.3g(p＜0.001；95％CI：-5.6至-3.0g)。在第0天，载体组VL(POx1)；2和分别与GL(SCx1)；6和M/GL(PO/SCx1)；7(治疗)之间没有显著的重量差异。在稍后的时间点，治疗倾向于补偿在载体组中观察到的失重。在第21天，相对于载体(组2，VL(POx1))，用G-CSF的治疗性治疗(组6，GL(SCx1)；6)产生3.3g对体重的保护作用(p＝0.014；95％CI：0.7至5.9g)。类似地，在第21天，相对于载体(组2，VL(POx1))，组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中使用Myelo001和G-CSF的治疗导致体重增加2.8g(p＝0.028，95％CI：0.3至5.3g)。

汇总了高剂量照射后治疗性治疗的小鼠的体重分析。截距表示在第0天载体组组VH(POx1)；8中的平均体重为27.7g(p＜0.001；95％CI：27.0至28.3g)。如按时间所示，在载体组中，从第3天到第30天，体重从基线体重显著降低。最大失重为-6.2g(p＜0.001；95％CI：-7.7至-4.7g)。与5.8Gy照射相比，6Gy照射剂量后的这种降低更严重。对于基线第0天，在载体组和组VH(POx1)；8之间未观察到平均体重的差异(治疗)。相对于对照组8(VH(POx1)；8)，组9(MH(POx1)；9)中体重随时间的变化(治疗x时间)表明，相对于载体组8(VH(POx1)；8)，用Myelo001治疗后具有显著的体重减轻的补偿(图7A-C)。该量高达3.1g(p＝0.006；95％CI：0.9至5.2g)。

总之，用Myelo001进行的预防性治疗在第3天产生了较小的保护作用。在较低剂量的辐射下，用Myelo001和Myelo001+优保津进行的治疗性治疗导致第21天的体重相对于同一天的载体组2(VH(POx1)；2)增加。在较高剂量照射下的治疗方案中观察到Myelo001对体重的最高保护作用，在第15、21和30天，组9(MH(POx1)；9)相对于对照组8(VH(POx1)；8)显示出积极效果。

在第7和14天，在所有组(相对于未治疗/未辐射组(U；1))中外周血细胞(白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板)严重受抑制，并且血红蛋白中度受抑制。白细胞、淋巴细胞和血小板在最后的时间点(第30天)仍然很大程度上被抑制，而中性粒细胞和血红蛋白恢复到接近正常值。总体上，在用Myelo001或阳性对照G-CSF进行的预防性和治疗性治疗时，没有观察到显著差异。在辐射组之间，白细胞、中性粒细胞或淋巴细胞的数目是可比较的。在第14天，与对照组2(VL(POx1)；2)相比，组6(GL(SCx1)；6)和7(M/GL(PO/SCx1)；7)中的血红蛋白和血细胞比容、红细胞增加。类似地，在第14天和第30天，与组8(VH(POx1)；8)相比，血红蛋白、红细胞、血细胞比容倾向有利于组9(MH：(POx1)；9)(图8A-C-12A-C)。

在第30天，与对照组2(VH(POx1)；2)相比，在组6(GL(SCx1；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中观察到中值WBC和中性粒细胞计数的增加趋势。包括在阳性对照(G-CSF)中，没有鉴定出中性粒细胞计数的显著组间差异。这可能是由于选定的7天和14天的时间点在部分恢复期间出现整体抑制和缺少测量以及在第30天停止导致的。

在计划外死亡率总病理数据中没有注意到与测试品相关的变化。在这些动物中观察到典型的急性辐射综合征发现(多个器官中，主要在脑和睾丸中的红色变色)。

在14天的尸体剖检过程中，除了组6(5.8Gy，优保津，皮下，0.34mg/kg，在第1、2和3天给药)外，在所有组都观察到急性放射综合征的典型病变，即器官的红色变色，这在脑和睾丸中最为突出，而在所述组6中在脑、睾丸中没有红色变色，但观察到了脾囊肿，这不是急性放射综合征的典型病变。

在第7天或第30天尸体剖检总体病理学数据中没有注意到其它测试品相关的变化。

在器官重量数据中没有注意到与测试品相关的变化。

包括在载体治疗动物中，偶发地观察到睾丸中的出血、骨髓的骨髓增生和骨髓中的巨核细胞增生的显微镜发现，这不能与测试品相关联。

在第14天，组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)、组5(ML(POx1)；5)中睾丸退化的严重程度与组2(VL(POx1)；2)相比有所下降(p＝0.037)(图13A，表14)。在第30天，在所有组中严重性均是显著的。组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中的动物显示出较高比例的睾丸在最小类别中，但这些变化不显著(p＝0.078)(图13B)。类似地，组9中(MH(POx1)；9)用Myelo001治疗的动物显示(n.s)较高比例的睾丸在最小类别中(p＝0.264)(图13C)。

在预定的第7天尸体剖检组织病理学数据中没有注意到与测试品相关的变化。所有动物的胸骨和股骨中骨髓细胞性的降低都是显著的(4级)。睾丸是正常的(没有可见的病变)。

在第7天，在100％的辐射动物中，骨髓细胞性减少在股骨和胸骨中均处于“显著的”类别，并且在第14天恢复至中度至显著。在第30天，除了组2(VL(POx1)；2)外，没有动物的胸骨明显减少，并且组2(VL(POx1)；2)中的大多数动物处于最小类别。在股骨中，在大多数组中仍然存在细胞性的中度或显著降低，但是在所有组中都观察到细胞性的恢复(图14A-C)。

组2(VL(POx1)；2)、组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)在骨髓细胞性降低方面没有显示任何显著变化。对于组3(ML(IPx2)；3)中的所有动物，骨髓细胞性在第30天处于最小类别，并且股骨骨髓等级的差异是显著的(p＝0.001)(图14A)。

在第14天，与组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)相比，对照组2(VL(POx1)；2)显示(n.s.)更高比例的动物在显著类别中。在第30天，组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中的所有治疗动物在均胸骨方面显示为最小类别，而在股骨骨髓方面无显著类别，但这些变化不显著(图14B)。

在第14和30天，与组9(MH(POx1)；9)相比，对照组8(VH(POx1)；8)显示出在统计学上不显著更高比例的动物在中度和显著类别中(图14C，表15)。

总之，对于预定的第14天和第30天尸体剖检，与组2(VL(POx1)；2)中的载体治疗的对照相比，注意到组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中胸骨和股骨的骨髓细胞性降低的严重程度更低。在较高辐射剂量组中，与组8(VH(POx1)；8)中载体治疗的对照相比，组9(MH(POx1)；9)的胸骨和股骨骨髓细胞性降低的严重程度更低。

剂量依赖性辐射效应在死亡率的主要终点和在大多数评估的次要终点参数中是明显的，所述次要终点参数包括体重、临床体征、血液学和组织病理学。

血液学评估具有局限性，因为选择的7和14天时间点显示所有组均出现严重的骨髓抑制，直到恢复仍不完全的第30天研究结束，未安排进一步测量。

与对照组2(VH(POx1；2)相比，5.8Gy照射后的预防性治疗(LD25/30)未导致存活曲线之间的显著差异。然而，当与口服和腹膜内给药两个剂量的25mg/kg(组4(ML(POx2)；4)和组3(ML(IPx2)；3)(分别为DRF＝0.9和0.7)相比时，以50mg/kg剂量口服给药的Myelo001(组5(ML(POx1)；5))产生了更高的剂量减少因子(DRF＝1.1)。此外，在载体组中，达到10％死亡的时间为17天，而在组5(ML(POx1)；5)中为21天。

与载体对照相比，用Myelo001进行的预防性腹膜内治疗(组3(ML(IPx2)；3))导致在第30天骨髓细胞性的降低较小，并且在第14天睾丸变性降低。没有观察到对外周血液学和ARS评分的明显影响。组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)中预防性口服Myelo001导致在第14天睾丸变性降低，并且在第9天和第15天的姿势评分分布存在显著差异。与更频繁地分类为轻度的对照组2(VL(POx1)；2)相比，在两组中观察到的最频繁的姿势等级(模式)是正常的。骨髓细胞性和血液学没有因治疗而显著改变。所有预防性治疗组(组3、4、5)在第3天对体重减轻显示出较小的保护作用。

与阴性对照(VL(POx1)；2)相比，用阳性对照G-CSF治疗后(组6(GL(SCx1)；6))仅观察到存活的微小差异，而在组合治疗下(组7((M/GL(PO/SCx1))，在30天内没有发生死亡。与单独的G-CSF(GL(SCx1)；6)相比，在将Myelo001和G-CSF一起给药后(M/GL(PO/SCx1)；7)，观察到DRF的轻微增加(分别为DRF＝1.1和1.2)。

测试品相关的变化由组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中骨髓细胞性的较少降低组成。在第14天和第30天，在股骨和胸骨中都观察到了这种趋势，并且在第30天恢复更大。

在第7和14天，照射在载体治疗的动物中导致全血细胞减少症。在第14天，红细胞计数(RBC成熟细胞和未成熟网织红细胞)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)的平均值的降低在只接受G-CSF的动物(组6(GL(SCx1；6))或接受G-CSF与Myelo001的组合的动物(组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中不太显著。尽管在两组中均注意到这些细胞谱系平均数增加的趋势，但包括在阳性对照(G-CSF)中，未鉴别到WBC和中性粒细胞数目的明显组间差异。总体而言，观察到Myelo001减轻造血急性放射综合症(H-ARS)的积极趋势。

在第14天，睾丸变性的严重程度在载体对照组中最高。这可能表明，在该时间点在治疗组中存在一些保护作用；然而，所有动物在第30天的最终结果都相同，其为睾丸的显著变性。组6(GL(SCx1)；6)在第14天是唯一在睾丸中不具有作为急性放射综合征典型的明显病变的组，但其显著性尚不清楚，特别是由于组7(M/GL(PO/SCx1)；7)接受了加入有另一测试品的类似治疗。

在第21天，与对照载体组相比，两组均显示对体重增加的显著治疗效果。

对于6.0Gy辐射后的治疗性治疗(LD50/30)，组9(MH(POx1)；9)中的存活率大幅高于相应的对照组8(VH(POx1)；8)(分别为86％与56％)。组9(MH(POx1)；9)在所有治疗组中具有1.5的最高剂量减少因子。

存活率的增加得到了包括骨髓细胞性、睾丸变性以及皮毛和姿势的ARS评分在内的次要参数的多个积极趋势的支持。此外，在较高剂量照射下的治疗方案中观察到了Myelo001对体重的最高保护作用，表明相对于对照组8(VH(POx1)；8)，组9(MH(POx1)；9)在第15、21和30天具有显著作用。

没有观察到WBC计数的明显变化。然而，在治疗性口服给药Myelo001后(组9(MH(POx1)；9))，在第14天和第30天，红细胞计数(RBC成熟细胞和未成熟网织红细胞)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)的平均值的降低的不太显著。总体上，观察到Myelo001在减轻造血急性辐射综合症(H-ARS)方面的积极趋势。

总之，尤其是对于6.0Gy辐射后的治疗性治疗(LD50/30)，组9(MH(POx1)；9)中的存活率明显高于相应的对照组8(VH(POx1)；8)。这种存活率发现得到了包括骨髓细胞性、ARS评分和体重在内的次要参数的多个积极趋势的支持。

表3：与照射有关的死亡率

表4：达到10％死亡的时间

*直到研究结束时，未治疗组和组7(M/GL(PO/SCx1))中未出现死亡。因此，无法计算这些组达到10％死亡的时间。

表5：示出预防性治疗对辐射诱发死亡风险的影响的Cox比例危险回归模型

参考组为VL(POx1)；2

表6：示出治疗性治疗对辐射诱发死亡风险的影响的Cox比例危险回归模型

表7：示出治疗性治疗对辐射诱发死亡风险的影响的Cox比例危险回归模型

参考组为VH(POx1)；8

表8：基于Kaplan-Meier评估，未经治疗的、载体、预防性和治疗性治疗的30天后的存活率以及剂量减少因子。

*使用Kaplan-Meier方法分析了每组中的存活概率。治疗效果定义为治疗组在第30天的存活概率分别相对于相应5.8Gy照射的对照组VL(POx1)；2和6.0Gy照射的对照组VH(POx1)；8的比率。

表9：结果汇总

积极趋势(描述性地)+

消极趋势(描述性地)-

没有差异(描述性地)0

*组2、4、5、8和9具有更多的动物，可以进行更细致的死亡率终点评估

表10.第3、9、15、21和30天(AM)进行的不同姿势得分的统计学检验

表11.第3、9、15、21和30天(AM)进行的不同皮毛评分的统计学检验

表12.第3、9、15、21和30天(AM)进行的不同行为评分的统计学检验

表13A.载体组2(VL(POx1)；2)在第0天的体重，载体组中体重在第3、9、15、21、30天相对于基线的变化。

表13B.载体组2(VL(POx1)；2)在第0天的体重，组3(ML(IPx2)；3)、组4(ML(POx2)；4)和组5(ML(POx1)；5)中体重在第0、3、9、15、21、30天相对于载体组的变化。

表13C.载体组2(VL(POx1)；2)在第0天的体重，载体组中体重在第3、9、15、21、30天相对于基线的变化，以及组6(GL(SCx1)；6)和组7(M/GL(PO/SCx1)；7)中体重在第0、3、9、15、21、30天相对于载体组的变化。

表13D.载体组8(VH(POx1)；8)在第0天的体重，载体组中体重在3、9、15、21和30天相对于基线的变化，以及组9(MH(POx1)；9)中体重在第0、3、9、15、21和30天相对于载体组的变化。

表14.在第7、14、30天，睾丸变性的严重性统计学检验

表15.在第7、14、30天，胸骨和股骨中骨髓细胞性减少的统计学检验