灭活全颗粒流感疫苗及其制备法

摘要

本发明提供一种维持或增强抗体诱导能力、且减少了副反应的灭活全颗粒流感疫苗。本发明还提供一种利用鸡胚法的灭活全颗粒流感疫苗的制备方法，包含对含有从鸡胚回收的流感病毒全颗粒的病毒液进行低渗处理的工序。

说明书

技术领域

本发明涉及抗体诱导能力高且减少了致热原性的灭活全颗粒流感疫苗及其制备法。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科，是由于存在于病毒内部的核蛋白和基质蛋白的抗原性的差异而分为A、B、C和D型的病毒。每年出现流行的为A型和B型，有时特别是在儿童、老年人中因病毒感染而重症化。已知流感疫苗接种是对流感病毒的感染的预防方法，流感疫苗是包含A型2株和B型1株或2株的各抗原的多价疫苗。

在日本，流感疫苗虽然到1971年为止已经采用灭活全颗粒疫苗，所述灭活全颗粒疫苗是通过将疫苗株接种于孵化鸡蛋进行培养后将收集、纯化的病毒用甲醛使感染性失活而得到的，但由于局部反应和发热等副反应的问题(非专利文献1和非专利文献2)，自1972年起通过醚处理将病毒颗粒裂解而除去了包膜中的脂质的裂解疫苗开始在市场上流通。裂解疫苗是一种减少了局部反应和发热反应的安全性优异的疫苗，但在流感病毒的感染史、疫苗接种史少的儿童和免疫功能衰弱的老年人中存在抗体诱导低的问题。

与此相对，灭活全颗粒疫苗由于内含了激活自然免疫的病毒基因组，因此在儿童、老年人中与裂解疫苗相比抗体诱导能力也更高(非专利文献3和非专利文献4)，因而近年来不断对其改良进行研究。例如，专利文献1中公开了如下内容：将病毒颗粒用醛类等固定化然后进行脱脂处理后的病毒样颗粒表现出比裂解疫苗更高的免疫原性(抗体诱导)，可抑制发热反应。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/010081号

非专利文献

非专利文献1：Marine,W.M.,et al.,Reactions and serologic response inyoung children and infants after administration of inactivated monovalentinfluenza Avaccine.J.Pediatr.1976Jan；88(1):26-30

非专利文献2：Wright,P.F.,et al.,Clinical reactions and serologicresponse following inactivated monovalent influenza type B vaccine in youngchildren and infants.J.Pediatr.1976Jan；88(1):31-35

非专利文献3：Gross P.A.,Ennis F.A.,Gaerlan P.F.,Denson L.J.,DenningC.R.,Schiffman D.,Acontrolled double-blind comparison of reactogenicity,immunogenicity,and protective efficacy of whole-virus and split-productinfluenza vaccines in children.J Infect Dis.1977Nov；136(5):623-32.

非专利文献4：McElhaney J.E.,Meneilly G.S.,Lechelt K.E.,Beattie B.L.,Bleackley R.C.,Antibody response to whole-virus and split-virus influenzavaccines in successful ageing.Vaccine.1993；11(10):1055-60.

发明内容

本发明提供一种维持或增强了抗体诱导能力且减少了副反应的灭活全颗粒流感疫苗。

本申请发明人等进行深入研究，结果发现将鸡胚中增殖的流感病毒悬浮液进行浓缩、纯化所制备的灭活全颗粒疫苗包含来自鸡胚的细胞外囊泡的成分。而且，令人惊讶地发现通过在该全颗粒疫苗的制备过程中将病毒液暴露于低渗溶液中而得到细胞外囊泡的含有率减少了的灭活全颗粒疫苗，该疫苗的抗体诱导能力高，发热活性被减弱。

即，本发明为以下的1)～6)的实施方式。

1)一种利用鸡胚法的灭活全颗粒流感疫苗的制备方法，包含如下工序：对含有从鸡胚回收的流感病毒全颗粒的病毒液进行低渗处理。

2)根据1)的方法，其中，低渗处理是将上述病毒液暴露于低渗溶液中。

3)根据2)的方法，其中，低渗溶液为160mOsm/kg以下、优选110mOsm/kg以下的水溶液。

4)根据1)～3)中任一项所述的方法，其中，对失活的上述病毒液进行低渗处理。

5)一种灭活全颗粒流感疫苗，是使用1)～4)中任一项所述的方法而制备的。

6)一种疫苗，是利用鸡胚法而制备的灭活全颗粒流感疫苗，来自鸡胚的细胞外囊泡成分得到减少。

根据本发明，能够提供一种抗体诱导能力高且减少了致热原性的灭活全颗粒流感疫苗。

附图说明

图1是采取未感染的鸡胚的绒毛尿囊液并进行纯化和浓缩而得到的细胞外囊泡成分的电子显微镜观察图像。A：来自鸡胚的绒毛尿囊液的细胞外囊泡(15000倍)，B：来自鸡胚的绒毛尿囊液的细胞外囊泡(40000倍)。

图2是B/Victoria系的灭活全颗粒疫苗(B15VT－19－S151028)和低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(BV170729－10T)的电子显微镜观察图像。A：灭活全颗粒疫苗(4000倍)，B：低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(4000倍)。

图3是B/Yamagata系的灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)的电子显微镜观察图像。A：8000倍，B：40000倍。

图4是通过超滤进行低渗处理后的B/Yamagata系的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)的电子显微镜观察图像。A：8000倍，B：30000倍。

图5是对离心分离后的沉淀物进行低渗处理后的B/Yamagata系的灭活全颗粒疫苗(17BY－OST171129)的电子显微镜观察图像。A：8000倍，B：40000倍。

图6是灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)、高浓度甲醛处理后的灭活全颗粒疫苗(BYFMA170908)和低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)的兔子发热试验结果。

图7是灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)、高浓度甲醛处理后的灭活全颗粒疫苗(BYFMA170908)和低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)的免疫原性试验结果。

图8是灭活全颗粒疫苗(H3BPL170630)、高浓度甲醛处理后的灭活全颗粒疫苗(H3FMA170713)、低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPH3170913)和裂解疫苗的免疫原性试验结果。

具体实施方式

本发明中，“流感疫苗”是指至少包含A型流感病毒或B型流感病毒中的任一种抗原的疫苗。即，本发明的流感疫苗可以是仅含有A型流感病毒或B型流感病毒中的一者的单价疫苗，也可以是包含它们两者的多价疫苗。

本发明中，提到“流感病毒”时，表示A型流感病毒或B型流感病毒或其两者。另外，流感病毒还包含目前已知的全部亚型和将来被分离、鉴定的亚型。

本发明的疫苗制备中使用的流感病毒株可以是从感染动物或患者分离的毒株，也可以是利用基因工程的方法在培养细胞中构建的重组病毒。

本发明中，“流感病毒全颗粒”是指保持了培养流感病毒而得到的病毒的形态的状态下的病毒颗粒，“灭活全颗粒流感疫苗”是指由灭活的该病毒颗粒构成的疫苗。

本发明的灭活全颗粒流感疫苗的制备方法利用了鸡胚法，包含进行低渗处理的工序。

“鸡胚法”是指将病毒株接种于孵化鸡蛋进行培养后将病毒悬浮液澄清、浓缩、纯化和灭活而得到含有病毒颗粒的病毒液的方法。

这里，培养是将流感病毒株接种于孵化鸡蛋，以30～37℃进行1～7天左右，优选以33～35℃进行2天左右。培养结束后，回收病毒悬浮液(感染尿囊液)，进行离心分离或过滤而使其澄清。接着，进行超滤而使其浓缩。病毒纯化可以利用蔗糖密度梯度离心分离等超离心分离、液相色谱等方法来进行。

对纯化病毒液进行灭活处理。病毒的灭活方法，可举出福尔马林处理、紫外线照射、利用β-丙内酯、二乙烯亚胺等进行的处理。

本发明中，在直到将于鸡胚中培养、回收的流感病毒悬浮液进行澄清、浓缩、纯化、灭活而得到疫苗为止的任一时期进行低渗处理。

作为“低渗处理”，可举出在培养后将含有从鸡胚回收的流感病毒全颗粒的病毒液暴露于低渗溶液中。认为由此具有包膜的支架蛋白(M1蛋白)的流感病毒能够保持颗粒形状，但没有支架蛋白的来自鸡胚的细胞外囊泡(外泌体、微泡或凋亡小体等)的颗粒会膨胀而破裂。

作为在此使用的低渗溶液，例如可举出160mOsm/kg以下、优选110mOsm/kg以下、更优选32mOsm/kg以下的水溶液。该水溶液可以包含缓冲剂、分散剂、pH调节剂等添加剂。

作为优选的低渗溶液，例如，可举出10mM Tris-HCl缓冲液、含有0.5w/w％蔗糖的10mM Tris-HCl缓冲液、含有0.2w/w％蔗糖和1mM乙二胺四乙酸的10mM Tris-HCl缓冲液等。

将病毒液暴露于低渗溶液中的方法没有特别限定，例如，可举出在透析或超滤中将缓冲液置换为低渗溶液、将通过离心分离而沉淀的病毒液悬浮于低渗溶液等。

低渗处理可以在澄清工序的前后、浓缩工序的前后、纯化工序的前后、或灭活工序的前后进行。优选在灭活工序的前后，更优选在灭活工序之后。

由此制备的本发明的灭活全颗粒流感疫苗，所混入的来自鸡胚的细胞外囊泡成分减少(实施例1和2)。

这里，细胞外囊泡成分减少是指将由本发明的方法制备的疫苗与不进行低渗处理而同样制备的疫苗相比时，其中含有的细胞外囊泡成分的含量减少，优选减少30％以上，更优选减少50％以上，更优选减少80％以上，更优选减少90％以上。或者，将由本发明的方法制备的疫苗用透射电子显微镜进行观察时，相对于病毒颗粒的数量的细胞外囊泡的存在比例优选为55％以下，更优选为35％以下，更优选为25％以下，更优选为20％以下。

而且，本发明的灭活全颗粒流感疫苗的抗体诱导能力比裂解疫苗高，与不暴露于低渗溶液的灭活全颗粒流感疫苗相比为同等以上。另外，致热原性与不暴露于低渗溶液的灭活全颗粒流感疫苗相比减弱(实施例3－6)。

本发明的灭活全颗粒流感疫苗的流感病毒全颗粒的浓度优选为2000μg HA/mL以下，更优选为1200μg HA/mL以下。上述浓度可以利用后述参考例2所示的单向辐射免疫扩散试验进行测定。另外，本发明的灭活全颗粒流感疫苗中，疫苗所含有的抗原量可以根据病毒的种类或给药对象而适当地变更。

本发明的灭活全颗粒流感疫苗中，除了流感病毒全颗粒以外，还可以进一步含有药学上可接受的载体。作为该载体，可举出疫苗的制造中通常使用的载体，具体而言，可例示缓冲剂、乳化剂、防腐剂(例如，硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如，福尔马林或β-丙内酯)、佐剂(例如，氢氧化铝凝胶)等。

本发明的灭活全颗粒流感疫苗的剂型例如可以为液体、冻干粉末、胶囊、片剂。

本发明的灭活全颗粒流感疫苗的给药途径例如可以为皮下给药、肌内给药、皮内给药、经鼻给药、舌下给药或口服给药，其给药方法例如也可以为基于注射器、微针、带有微针的注射器、经皮贴剂或喷雾剂的给药方法。

实施例

以下，根据实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受它们任何限定。

参考例1 未感染蛋的绒毛尿囊液所含有的细胞外囊泡的分离

将11日龄的鸡胚72个在4℃冷却1小时以上，使用一次性注射针和注射器(泰尔茂公司制)从各鸡胚中回收绒毛尿囊液。集中所回收的绒毛尿囊液，以4℃、300×g离心10分钟，进一步用超离心机(日立工机公司制)将所得到的上清液以4℃、141000×g离心4小时。将超离心后的沉淀悬浮在6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，再次以4℃、141000×g离心4小时。将得到的沉淀悬浮在6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，得到细胞外囊泡悬浮液。

向带有火棉胶支持膜的TEM电子显微镜用格栅(应研商事株式会社制)上滴加0.1％聚－L－赖氨酸溶液5μL，在室温下静置1分钟。静置后，用滤纸吸收多余的聚－L－赖氨酸溶液，将如上所述制备的细胞外囊泡悬浮液滴加5μL后在室温下静置5分钟。其后，用滤纸吸收多余的细胞外囊泡悬浮液，滴加5μL的2％磷钨酸染色液进行阴性染色。利用透射电子显微镜(日本电子公司制)对染色的样本进行观察和拍摄。

由此，如图1所示，确认了在病毒未感染时鸡胚的绒毛尿囊液中也存在各种粒径的囊泡。由于该细胞外囊泡与病毒颗粒相比蛋白质的密度低，因此染色液流入到囊泡内部而观察到灰色的颗粒。

实施例1 B/Victoria系的灭活全颗粒疫苗制备和低渗处理

将B/Texas/2/2013株接种于12日龄的鸡胚的尿囊腔内，培养2天后采取绒毛尿囊液。通过过滤器过滤将所采取的绒毛尿囊液澄清后，使其吸附于硫酸钡盐，用12％柠檬酸钠溶液洗脱并回收流感病毒。回收的病毒通过进一步利用超滤而置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，缓冲液置换后利用蔗糖密度梯度离心来回收含有流感病毒的馏分而进行纯化。在该纯化流感病毒中添加作为灭活剂的β-丙内酯以使终浓度为0.05％，以4℃、24小时的反应使流感病毒的感染性失活。该灭活反应后利用超滤(MWCO：100000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为灭活全颗粒疫苗(B15VT－19－S151028)。

将如上所述制备的灭活全颗粒疫苗(B15VT－19－S151028)通过超滤(MWCO：100000)置换为10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2，17mOsm/kg)，置换后在4℃静置一晩(低渗处理)。低渗处理后，通过超滤(MWCO：100000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(BV170729－10T)。

利用前述的方法通过透射电子显微镜(日本电子公司制)对灭活全颗粒疫苗和低渗处理后的灭活全颗粒疫苗进行观察和拍摄。其结果，在灭活全颗粒疫苗中观察到与白色颗粒的病毒颗粒同等数量的作为灰色颗粒的细胞外囊泡(图2A)。与此相对，可知低渗处理后的灭活全颗粒疫苗中，相对于作为白色颗粒的病毒颗粒的数量，作为灰色颗粒的细胞外囊泡的比例变少(相对于病毒存在82％的细胞外囊泡的全颗粒病毒通过低渗处理而使细胞外囊泡的存在比例减少到51％)(图2B)。

实施例2 B/Yamagata系的灭活全颗粒疫苗制备和低渗处理

将B/Phuket/3073/2013株接种于12日龄的鸡胚的尿囊腔内，培养2天后采取绒毛尿囊液。通过过滤器过滤将所采取的绒毛尿囊液澄清后，使其吸附于硫酸钡盐，用12％柠檬酸钠溶液进行洗脱并回收流感病毒。回收的病毒通过进一步利用超滤置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，缓冲液置换后利用蔗糖密度梯度离心来回收含有流感病毒的馏分而进行纯化。在该纯化流感病毒中添加作为灭活剂的β-丙内酯以使终浓度达到0.05％，以4℃、24小时的反应使流感病毒的感染性失活。该灭活反应后利用超滤(MWCO：100000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)。

将如上所述制备的灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)通过超滤(MWCO：100000)而置换为含有0.5w/w％蔗糖的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2，32mOsm/kg)，置换后以4℃静置一晩(低渗处理)。低渗处理后，利用超滤(MWCO：300000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为通过超滤进行了低渗处理的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)。

另外，利用前述方法来制备B/Phuket/3073/2013株的灭活全颗粒疫苗，其中加入等量的含有0.2w/w％蔗糖和1mM乙二胺四乙酸的10mM Tris-HCl缓冲液，以4℃、11910×g离心分离4小时，得到病毒沉淀。在该病毒沉淀中加入含有0.2w/w％蔗糖和1mM乙二胺四乙酸的10mM Tris-HCl缓冲液(24mOsm/kg)进行悬浮，在10℃以下静置15小时(低渗处理)。低渗处理后，再次以4℃、11910×g离心分离4小时使病毒沉淀，将病毒沉淀悬浮在含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)。对该悬浮液进一步利用超滤(MWCO：300000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为通过离心分离而进行了低渗处理的灭活全颗粒疫苗(17BY－OST171129)。

对灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)和两种低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913和17BY－OST171129)利用前述方法通过透射电子显微镜(日本电子公司制)进行观察和拍摄。其结果，在低倍率下的灭活全颗粒疫苗的观察(图3A)中，观察到很多细胞外囊泡。另外，图3B为高倍率的观察图像，用箭头示出细胞外囊泡。

图4中示出通过超滤而进行了低渗处理的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)的电子显微镜观察图像，在低倍率的观察图像(图4A)中细胞外囊泡与灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)相比较少(相对于病毒存在108％的细胞外囊泡的全颗粒病毒通过低渗处理而使细胞外囊泡的存在比例减少到23％)，在高倍率的观察图像(图4B)中观察到如箭头所示的裂解的颗粒的片段。另外，通过离心分离进行了低渗处理的灭活全颗粒疫苗(17BY－OST171129)也在低倍率的观察图像(图5A)中细胞外囊泡与灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)相比较少(相对于病毒存在108％的细胞外囊泡的全颗粒病毒通过低渗处理而使细胞外囊泡的存在比例减少至16％)，也与通过超滤而进行了低渗处理的灭活全颗粒疫苗同样地在高倍率的观察图像(图5B)中观察到用箭头示出的裂解的细胞外囊泡的片段。

实施例3发热试验

将灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)、低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)和作为对照的高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗分别用6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)进行稀释以使蛋白质浓度达到134μg/mL，对体重1.50～1.99kg的兔子(日本白色种，雄性)以1mL/kg给药。对于给药，每个样本对3只兔子进行给药，将给药前15分钟的体温记为0，观察直到给药后180分钟的体温的变动。

作为对照的高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗的制备，与从鸡胚的接种到基于蔗糖密度梯度离心的纯化为止都与前述的灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)的制备相同，在得到的纯化流感病毒中添加福尔马林以使终浓度达到0.08％，在25℃通过1周的反应而使病毒的感染性失活。灭活反应后，利用超滤(MWCO：100000)将缓冲液置换为含有1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)，将其作为高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗(BYFMA170908)。

图6中示出给予各样本的兔子的体温差的平均值的推移，在高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗中没有发热，在灭活全颗粒疫苗中看到了超过1.5℃的发热反应。另一方面，可知在低渗处理后的灭活全颗粒疫苗中，尽管有发热反应但与灭活全颗粒疫苗相比发热反应减弱，比较发热显示最大值的180分钟后的体温差时，低渗处理后的灭活全颗粒疫苗降低约0.5℃。

实施例4免疫原性试验(B/Yamagata系)

使用小鼠对灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)、低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)和高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗(BYFMA170908)的抗体诱导能力进行评价。对BALB/c小鼠(雌性，5周龄)以蛋白质量计为7.5μg的给药量皮下注射各疫苗(每1组5只)。给药3周后，使小鼠安乐死，采取全血。采血后通过离心分离而得到血清，使用该血清通过ELISA测定针对B/Phuket/3073/2013毒株的特异性IgG滴度。

图7中示出IgG滴度测定的结果。比较图中标出的几何平均抗体滴度(以下，记为GMT)时，低渗处理后的灭活全颗粒疫苗给药组最高，其次为灭活全颗粒疫苗给药组，显示最低值的是高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗给药组。因此，表明通过对灭活全颗粒疫苗进行高浓度福尔马林处理而使抗体诱导能力降低，但低渗处理后的灭活全颗粒疫苗中抗体诱导能力提高。

实施例5免疫原性试验(A/H3N2亚型)

按照基于实施例2和3的方法来制备A/Hong Kong/4801/2014株(A/H3N2亚型)的灭活全颗粒疫苗(H3BPL170630)、通过超滤而进行低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPH3170913)和高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗(H3FMA170713)。对这些疫苗依据实施例4中记载的方法来评价在小鼠中的抗体产生能力。另外，本实施例中，作为对照，使用流感HA疫苗“生研”的A/Hong Kong/4801/2014毒株的原液，将其制成裂解病毒颗粒(Split virion)。

图8中示出IgG滴度测定的结果。比较图中标出的GMT时，GMT按照低渗处理后的灭活全颗粒疫苗、灭活全颗粒疫苗、裂解病毒颗粒、高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗的顺序变高，仅低渗处理后的灭活全颗粒疫苗给药组表现出相对于裂解病毒颗粒给药组显著高的抗体诱导(曼-惠特尼U检验，p＜0.05)。因此，与B/Yamagata系的免疫原性试验的结果同样地表明通过低渗处理而灭活全颗粒疫苗的抗体产生能力提高。

另外，高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗中，结果是抗体诱导低于裂解病毒颗粒。认为高浓度福尔马林处理在实施例3的发热试验中没有表现出发热反应，安全性优异，但抗体产生能力低于市售的裂解病毒颗粒，因此无法期待有效性的提高。

实施例6细胞因子产生能力的评价

从BALB/c小鼠(雌性，11周龄)摘取脾脏，回收到装满HBSS(Thermo Scientific)的培养皿中。在HBSS中将脾脏切碎，切碎后移入离心管中。静置3分钟左右后，避开沉淀物和悬浮物而回收中间层，将回收的中间层在室温以200×g离心分离10分钟。离心后废弃上清液，在沉淀中加入溶血缓冲液(含有140mM氯化铵的17mM Tris－HCl缓冲液)使红细胞破裂，以200×g离心分离10分钟。将离心后的沉淀用HBSS清洗后，将沉淀的脾细胞悬浮在含有10％FBS的RPMI－1640，将其作为小鼠脾细胞。将B/Yamagata系的灭活全颗粒疫苗(BYBPL170905)、低渗处理后的灭活全颗粒疫苗(HYPBY170913)和高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗(BYFMA170908)以蛋白质量计为1μg加入到1.0×10

表1中示出培养上清的细胞因子浓度。IL－4在任一疫苗的刺激下都没有产生，但其它细胞因子都在低渗处理后的灭活全颗粒疫苗的刺激下产生最多，其次是灭活全颗粒疫苗，产生量最低的是高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗。认为该结果是与实施例4的免疫原性试验的结果相关的结果，灭活全颗粒疫苗促进的来自免疫细胞的细胞因子的产生通过低渗处理而提高，其结果，抗体诱导能力也提高。另一方面，认为在高浓度福尔马林处理中，来自免疫细胞的细胞因子的产生降低，其结果，抗体产生能力也降低。

[表1]

参考例2单向辐射免疫扩散试验

利用单向辐射免疫扩散试验对B/Yamagata系和A/H3N2亚型的灭活全颗粒疫苗、低渗处理后的灭活全颗粒疫苗和高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗的各血凝素浓度进行测定。在各样本和标准抗原中以终浓度达到1.0％的方式添加Zwittergent(商品名，Merck Millipore公司制)使其反应30分钟。反应后，将添加有Zwittergent的各样本和标准抗原用含有0.05w/w％叠氮化钠的磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)稀释，制作稀释系列。将该稀释系列添加到加入了参照抗血清的1w/v％琼脂糖凝胶(以下，称为SRD板)的各孔中静置18小时以上。静置后，用滤纸吸收SRD板的水分，用考马斯亮蓝进行染色。染色后，测定各样本和标准抗原的环直径，通过平行线定量法算出相对于标准抗原的各样本的血凝素浓度。

将各样本的血凝素浓度、蛋白质浓度和相对于总蛋白质的血凝素含有比率示于以下的表2(B/Yamagata系)和表3(A/H3N2亚型)。应予说明，虽然每种病毒制备3种灭活全颗粒疫苗，但作为制备材料的蔗糖密度梯度离心分离后的纯化病毒使用相同的病毒。

比较血凝素含有比率时，B/Yamagata系中，相对于灭活全颗粒疫苗，低渗处理后的灭活全颗粒疫苗降低5％左右，但在高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗中进一步降低5％。另外，A/H3N2亚型中，虽然灭活全颗粒疫苗与低渗处理后的灭活全颗粒疫苗为同等的血凝素含有比率，但高浓度福尔马林处理后的灭活全颗粒疫苗中为低16～17％左右的值。因此，灭活全颗粒疫苗的血凝素浓度在低渗处理中没有很大变动，但在高浓度福尔马林处理中看到减少了10％或其以上。认为其原因在于因过量的福尔马林处理而导致蛋白质间的交联，血凝素含有率显示低值会导致生产率的降低，另外，因制剂的总蛋白质增大而使副反应的可能性提高。

[表2]

[表3]