一种促进脂肪干细胞成骨分化的组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种促进脂肪干细胞成骨分化的组合物及其应用。本发明制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种促进脂肪干细胞向成骨分化的方法及其组合物和应用。

背景技术

脂肪干细胞主要位于机体脂肪组织中，属于一种中胚层来源间充质干细胞，经胶原酶消化、离心、培养后所得。ADSCs在人类和动物体内获取方式不一样，人ADSCs可由脂肪抽吸或外科手术切取的方式获取，动物ADSCs可由腹股沟脂肪、内脏脂肪等部位获取。研究表明ADSCs在低血清或者无血清的条件下也能生长，并且其诱导潜能不受影响。在低糖、低氧和低谷氨酸等条件下，ADSCs的浓度是骨髓中干细胞的100～300倍。ADSCs的传代培养平均倍增时间需要两天，在10代左右仍然能保持稳定的倍增率，且衰老和死亡的细胞比例出现的较少。以上说明ADSCs是间充质干细胞中易于培养和大量应用的种子细胞。

基于脂肪干细胞的优势，脂肪干细胞不仅具有多向分化潜能和细胞因子分泌能力，更因其储量丰富，获取方便，免疫排斥反应弱，无伦理限制等特性，干细胞移植治疗展现了较好的临床应用前景。

骨相关疾病是近年来发病率升高较快的病种。而骨组织工程的进步为骨缺损修复提供了新的思路，在一定程度上克服了传统骨缺损修复所存在的缺点，如免疫排斥反应、二次损伤、可移植部位及数量有限等。骨组织工程的关键之一是选择合适的种子细胞。脂肪干细胞因其具有来源丰富、取材简便、多向分化能力等特点，是骨组织工程理想的种子细胞之一。目前，关于脂肪干细胞成骨分化的研究已比较多。脂肪干细胞分化为成熟的骨组织需要经历两个阶段，第一阶段大致为脂肪干细胞先后经历成骨干细胞、成骨前体细胞、过渡性成骨细胞3个过程直到成骨细胞成熟，第二阶段为成熟的成骨细胞增殖，分泌骨基质，骨基质钙化，即钙结节的出现，钙结节的生成是脂肪干细胞能够分化为成骨细胞的有力证据。脂肪干细胞在向成骨细胞分化的过程中细胞形态也发生了相应的变化，体外诱导5d左右，少量细胞的形态由长梭形变为多角形、类圆形或者不规则形；而后随着诱导时间的增加，可见细胞呈明显的簇状生长；14d左右细胞行茜素红染色，即可见到深红色的矿化钙结节。

化学诱导法是目前最常用的成骨分化方法。比如已有将含有适宜浓度β甘油磷酸钠、抗坏血酸、维生素D、地塞米松的培养液作为脂肪干细胞的成骨诱导液。还有细胞共培养法。细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共培养于同一种环境中，此法的优点在于能够更好地反映体内微环境中细胞间的相互作用关系。自发成骨法即在不添加成骨诱导相关因子的前提下，脂肪干细胞能够分化为成骨细胞，茜素红染色为阳性并表达成骨细胞相关的基因。

此前研究表明，骨硬化蛋白可通过与Wnt通路中Lrp5/6结合，抑制Wnt/β-catenin通路的活化，对骨形成起负性调控作用。动物实验证明拮抗骨硬化蛋白在增加骨量，改善骨强度和骨折愈合都有很好的效果,通过骨硬化蛋白单链抗体作用与骨髓间充质干细胞，发现对细胞增殖作用不明显，但可以促进成骨分化，为拮抗骨硬化蛋白治疗骨质疏松症的临床应用提供了新的思路。但是目前，还有拮抗骨硬化蛋白来研究其他干细胞向成骨分化的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速促进干细胞增殖的同时还能促进其诱导分化为成骨细胞的方法。

具体的本发明针对骨硬化蛋白，筛选获得了特异性的单克隆抗体。

更具体的，所述单克隆抗体的序列为：

轻链可变区(SEQ ID NO:1)

DIVITQSPALRAASPGEKSTITCAVRAYISRRYLDWYQQKSGSSPKPWIYSTPNLAAGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMETEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK

重链可变区(SEQ ID NO:2)

EVQLEEAGTELARPGAGVKLSCKAAGYIFSQYWAEWIKQRPGRGLEWIGSIYPSQGDTSQTRKFSGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEQSAVYYCAGSNFCADSWGLGTTLAVSS。

本发明提出了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了一种表达载体，该表达载体包含前面所述的多核苷酸。

根据本发明的具体实施例，上述表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操纵地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。

在本发明的另外一个方面，本发明还提出了前面所述的多核苷酸、表达载体、或重组细胞在制备抗体或其抗原结合片段的用途，所述抗体与骨硬化蛋白特异性结合。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、表达载体、重组细胞或前面所述的抗体在制备促进干细胞成骨分化中的用途。

进一步的，所述干细胞为脂肪干细胞或者脐带血干细胞，或者其他合适的干细胞。

本发明还提供一种促进干细胞增殖以及成骨分化的方法，具体为如下步骤：取分离纯化的干细胞加入成骨诱导液，每3d换液，诱导10-20d即可。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，该药物联合包括：(1)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、前面的表达载体、前面的重组细胞或前面所述的单克隆抗体；以及(2)与(1)不同的干细胞成骨分化诱导增强药物。

有益效果

本发明制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前景。

附图说明

图1单抗对干细胞成骨基因表达的影响结果图

图2单抗对干细胞增殖的影响结果图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1骨硬化蛋白的制备

以人DNA为模板，以引物：5’-ACAGGATCCATGCAGCTCCCACTGGCC-3’,

5’-ATCCTCGAGCTAGTAGGCGTFCTCCAG-3’，进行PCR扩增：PCR反应缓冲液5μl，模板DNA 1μl，10mmol/L dNTP 2μl，25μmol/L引物各1μl，Taq酶1μl，补水至50μl。PCR反应条件为：94℃变性3min后，3O个循环(94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s)，最后72℃充分延伸10min，4℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段大小。将PCR产物与pET-28a质粒载体双酶切后，通过T4连接酶连接，转化E.coli DH5α克隆菌株，提取重组质粒进行BamH I和XhoI双酶切检测，并对重组质粒进行测序检测，最后转化重组质粒入E.coli BL21(DE3)表达菌株。选取经鉴定的重组菌株过夜培养，以1：100倍转接人新鲜的LB培养基中，待0D约0.5时，加入终浓度0.5mmol/L IPTG，37℃诱导培养6h，收集菌体，并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法，对骨硬化蛋白进行纯化，并采用骨硬化蛋白检测试剂盒(百奥莱博，货号ZN2401)进行检测发现，表达的重组蛋白可以被试剂盒特异性阳性检测，并且蛋白的浓度达到了1mg/mL，保存备用。

实施例2单克隆抗体的制备

选择7周龄雌性Balb/c小鼠3只进行免疫，免疫共分3次，间隔14d，具体步聚：第1次免疫为弗氏佐剂与实施例1制备的蛋白按1:1比例混合物100μL腹部皮下注射，抗原计量100μg；14d后第2次免疫，不完全弗氏佐剂与实施例1重组蛋白1:1比例混合100μL腹部皮下注射，抗原计量100μg；再过14d后进行第3次免疫，不完全弗氏佐剂与实施例1重组蛋白1:1比例混合200μL腹腔注射，抗原计量100μg。14d后尾静脉采血，测定血清效价。使用血清效价大于1:10000的Balb/c鼠进行尾静脉加强免疫，抗原量100μg，3d后可进行细胞融合。

取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的比列，融合剂为PEG6000，按常规方法进行融合。将融合后的细胞低速离心后弃上清，用HAT的1640培养液重悬，加到含有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，置37℃、体积分数为5％的CO

表1单克隆抗体的间接ELISA结果

将3株单抗腹水离心后收集上清，纯化后置-20℃保存备用。

实施例3单抗特异性鉴定

分别用实施例1制备的纯化的骨硬化蛋白和BSA分别包被酶标板，评价两者OD值的差异，单克隆抗体和纯化的骨硬化蛋白的OD值与单克隆抗体与BSA的OD值之比＞1.5，则认为有单抗特异性。结果显示，3株单克隆抗体的骨硬化蛋白包被原OD值与BSA包被原OD值之比＞1.5，认为具有单抗特异性。

实施例4 GYH-17抗体序列鉴定

GYH-17杂交瘤细胞株进行离心收集杂交瘤细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cFNA。采用如下引物进行扩增。引物序列为：重链：上游引物：5’

-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGAGGTGCAACTGCAGCAGTCAGG-3’，下游引物为5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’(S/M/R是碱基兼并码)。轻链：上游引物：5’-GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC-3’，下游引物：5’--GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’。扩增产物经过克隆后进行测序。结果如下所示。

轻链可变区(SEQ ID NO:1)

DIVITQSPALRAASPGEKSTITCAVRAYISRRYLDWYQQKSGSSPKPWIYSTPNLAAGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMETEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK

重链可变区(SEQ ID NO:2)

EVQLEEAGTELARPGAGVKLSCKAAGYIFSQYWAEWIKQRPGRGLEWIGSIYPSQGDTSQTRKFSGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEQSAVYYCAGSNFCADSWGLGTTLAVSS。

实施例5检测抗体与S蛋白的亲和力

抗体与S蛋白和实施例1重组蛋白的结合动力学使用基于表面等离振子共振(SRP)技术的BIAcore 8K仪器测量。通过GE anti-Human-IgG-Fc氨基偶联试剂盒，将anti-humanIgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将实施例1制备的重组蛋白用HBS-EP缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。Startup 3次。抗体：2μg/ml，进样时间100s，流速10μL/min；抗原蛋白：结合120s，流速30μL/min，解离600s；再生：用3M MgCl2buffer再生30s，流速30μL/min。使用1:1binding结合模型或Two state reaction结合模型计算平衡解离常数(KD)。结果显示抗体能与相应抗原结合，亲和力为0.28nM。

实施例6脂肪干细胞的制备

无菌条件下取脂肪组织，投入4℃预冷PBS中(青霉素120mU/L，链霉素120ng/L)，反复冲洗，剪去肉眼可见的血管及结缔组织，在培养皿中剪成1mmx1mm大小的小块，0.2％I型胶原蛋白酶消化后加入等体积培养基，200目筛网过滤，收集滤液并离心，弃上清后加入3mL红细胞裂解液吹打5min，离心弃上清，PBS反复冲洗后在DMEM培养液(体积分数为10％胎牛血清、1％青链霉素)中重悬细胞，接种至25mm培养皿中，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养。48h后首次半量换液，细胞生长至85％融合时传代，每3d更换培养液。收集对数生长期第3代脂肪干细胞即为脂肪干细胞。干细胞鉴定：流式细胞仪分析第3代的人脂肪干细胞六种表面抗原,结果表明使用无血清培养基培养出的细胞具有人脂肪干细胞特性。HLA.DR阴性，排除该类细胞是成纤维细胞，流式细胞仪分析结果见表2。

表2细胞表面抗原鉴定结果

从表2的结果可以看出，分离得到了脂肪干细胞。

实施例7脂肪干细胞的成骨诱导实验

第3代脂肪干细胞加入成骨诱导液，每3d换液，第19天倒置相差显微镜观察细胞形态变化，第19天行茜素红染色：脂肪干细胞用PBS冲洗，100g/L多聚甲醛固定后，蒸馏水冲洗，加入1％茜素红-Tris-HCl(PH 8.3)，染色后蒸馏水反复冲洗，镜下观察成骨诱导后细胞形态变化。

其中，阳性对照组成骨诱导液：a-MEM完全培养基中加入终浓度分别为10mmol/Lβ-磷酸甘油钠，0.1umol/L地塞米松，50umol/L维生素C；

实验组：加终浓度为50ug/mL GYH-17抗体的a-MEM完全培养基；

对照组：加等量的a-MEM完全培养基；

成骨诱导19d后，在阳性对照组和实验组均可见着橘红色的典型钙化结节，对照组没有相应的橘红色的典型钙化结节，其中，实验组与阳性对照组相比，钙化结节的数量要高11.2％，这说明所述的抗体能够促进脂肪干细胞向成骨细胞诱导。

实施例8单抗对干细胞成骨基因表达的影响

分别取实施例7中诱导第10天的细胞样品少量，用Trizol裂解细胞，提取细胞RNA,反转录为cDNA,釆用实时定量PCR检测成骨基因Col1,ALP,RUNX2,OPN的表达,GAPDH作为内参，结果采用2

Coll上游(5’-3’)AACTTTGCTTCCCAGATGTCCT

下游(5’-3’)CTTCCCCATCATCTCCATTCTT

ALP上游(5’-3’)TCGGGACTGGTACTCGGATAA

下游(5’-3’)TTCAGTGCGGTTCCAGACATAG

OPN上游(5’-3’)CAGTGATTTGCTTTTGCCTGTTTG

下游(5’-3’)GGTCTCATCAGACTCATCCGAATG

RUNX2上游(5’-3’)GACTGTGGTTACCGTCATGGC

下游(5’-3’)ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA

GAPDH上游(5’-3’)AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

下游(5’-3’)TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。结果如图1所示。

从图1可以看出，在抗体的作用下，本发明实验组与阳性对照组相比都能够显著的促进成骨相关基因的表达，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)，见图1。特别是针对OPN基因的增强效果最显著。

实施例9单抗对脂肪干细胞增殖的影响

取生长良好的第3代干细胞，调整细胞浓度为1X10

结果如图2所示，在第9d，实验组的吸光度值比对照组的吸光度值稍有提高，这说明，单抗的加入能够促进干细胞分化时期的增殖，促进率达到了4％。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于发明的保护范围。

序列表

<110> 天津汉青生物科技有限公司

<120> 一种促进脂肪干细胞成骨分化的组合物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Arg Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ser Thr Ile Thr Cys Ala Val Arg Ala Tyr Ile Ser Arg Arg

20 25 30

Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Pro Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Gly Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Ile Phe Ser Gln Tyr

20 25 30

Trp Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Ser Gln Gly Asp Thr Ser Gln Thr Arg Lys Phe

50 55 60

Ser Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Gln Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Asn Phe Cys Ala Asp Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115