一种PBMC的CFSE染色方法及其应用

摘要

本发明公开了一种PBMC的CFSE染色方法所述方法包括以下步骤：S1，冻存PBMC的复苏：将PBMC冻存管融化、离心，弃去上清液，加入培养液重悬PBMC并计数；S2，PBMC的CFSE染色：调整PBMC的细胞浓度，量取一定体积的细胞悬液，加入CFSE染色液，染色5‑10min，再加入预冷的染色终止液，离心、弃去上清液、加入的完全培养基重悬。在本发明中利用CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中这一特性，对细胞进行标记，可准确检测出细胞增殖情况。采用本发明中所述的PBMC的CFSE染色方法，对细胞增殖影响小，有利于后续的共培养过程。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，尤其涉及一种PBMC的CFSE染色方法及其应用。

背景技术

间充质干细胞是一种多功能干细胞，免疫调节是评价间充质干细胞功能的重要指标之一。T淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成，T淋巴细胞在经抗原刺激等条件激活后，可分化为多种细胞亚群，探究间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响，有助于更好的理解间充质干细胞对机体免疫系统的调节作用，为未来干细胞临床应用提供更加全面的临床前研究证据。现有检测间充质干细胞对淋巴细胞分化的方法不够全面，存在数据波动大、不稳定等问题。

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester，CFSE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。

本发明意在提供一种PBMC的CFSE染色方法，该染色方法可有效减少染色剂对细胞分化的影响，提高细胞在共培养过程的分化增值率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种PBMC的CFSE染色方法，所述方法包括以下步骤：

S1，冻存PBMC的复苏：将PBMC冻存管放入水浴锅中，摇晃至其完全融化，将融化后的PBMC转移至含有完全培养基的离心管中，进行离心，弃去上清液，加入适量的培养液重悬PBMC并计数；

S2，PBMC的CFSE染色：调整PBMC的细胞浓度，量取一定体积的细胞悬液，加入CFSE染色液，染色5-10min，再加入预冷的染色终止液，离心、弃去上清液、加入适量的完全培养基重悬。

作为一种优选的技术方案，所述方法具体包括以下步骤：

S1，冻存PBMC的复苏：将PBMC冻存管放入水浴锅中，摇晃至其完全融化，将融化后的PBMC转移至含有完全培养基的离心管中，进行离心，弃去上清液，加入适量的培养液重悬PBMC并计数；

S2，PBMC的CFSE染色：加入磷酸缓冲盐溶液调整PBMC的细胞浓度，量取5-10ml的细胞悬液，加入CFSE染色液，室温避光染色5-10min，每隔2-3min颠倒混匀一次，再加入预冷的染色终止液，离心、弃去上清液、加入适量的完全培养基重悬。

作为一种优选的技术方案，在步骤S1中，所述PBMC冻存管放入水浴锅时，水浴锅的温度为36-38℃。

作为一种优选的技术方案，步骤S1中，所述完全培养基中含有10wt％的胎牛血清。

作为一种优选的技术方案，步骤S1中，所述离心时的离心力为300-500g，离心时间为5-10min。

作为一种优选的技术方案，步骤S2中，加入磷酸缓冲盐溶液调整PBMC的细胞浓度后，所述细胞浓度为2×10

作为一种优选的技术方案，步骤S2中，所述CFSE染色液的终浓度为＜2.5μmol/L。

作为一种优选的技术方案，步骤S2中，所述染色终止液的预冷温度为4～8℃。

作为一种优选的技术方案，步骤S2中，所述染色终止液为胎牛血清、小牛血清、人血清中的一种。

本发明的第二方面还提供了一种如上所述的PBMC的CFSE染色方法的应用，所述染色方法可用于间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制率的检测方法中。

1、在本发明中利用CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中这一特性，对细胞进行标记，可准确检测出细胞增殖情况。

2、在本发明中，结合本体系培养液、完全培养基的生物特性，将CFSE染色液的终浓度选择为＜2.5μmol/L，一方面是为了减少高浓度染色液对细胞增殖的影响，另一方面染色完成后，有助于及时停止染色。

3、采用本发明中所述的PBMC的CFSE染色方法，对细胞增殖影响小，有利于后续的共培养过程。

附图说明

图1为实施例1中CL组、空白对照组细胞培养三天增殖情况。

图2为实施例1中CL组、空白对照组细胞培养五天增殖情况。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

为了解决上述问题，本发明第一方面提供一种PBMC的CFSE染色方法，所述方法具体包括以下步骤：

S1，冻存PBMC的复苏：将PBMC冻存管放入36-38℃的水浴锅中，摇晃至其完全融化，将融化后的PBMC转移至含有完全培养基的15ml的离心管中，完全培养基的添加量为3～4ml，进行离心，300-500g离心5-10min，弃去上清液，加入PBMC体积的2～3倍的培养液重悬PBMC并计数；

S2，PBMC的CFSE染色：加入PBS调整PBMC的细胞浓度至2×10

在一些优选的实施方式中，步骤S1中，所述完全培养基中含有10wt％的胎牛血清。

在一些优选的实施方式中，步骤S1、S2中所述完全培养基均为RPMI 1640培养基(品牌：Gibco)。

在一些优选的实施方式中，步骤S1中，所述培养液为磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

在一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述染色终止液为胎牛血清(FBS)、小牛血清、人血清中的一种。

在一些更优选的实施方式中，步骤S2中，所述染色终止液为胎牛血清(FBS)。

在本发明中

PBMC为：外周血单个核细胞，特别的为淋巴细胞。

CFSE为：羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester，CFSE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料。

PBS为：磷酸缓冲盐溶液。

FBS为：胎牛血清。

本发明的第二方面还提供了一种如上所述的PBMC的CFSE染色方法的应用，所述染色方法可用于间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制率的检测方法中。

实施例

以下通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。如无特殊说明，本发明中的原料的均为市售。

实施例1

实施例1提供了一种PBMC的CFSE染色方法，所述方法具体包括以下步骤：

S1，将PBMC冻存管放入37℃的水浴锅中，摇晃至其完全融化，将融化后的PBMC转移至含有完全培养基的15ml的离心管中，完全培养基的添加量为4ml，进行离心，500g离心5min，弃去上清液，加入PBMC体积的2倍的PBS重悬PBMC并计数；

S2，用PBS将PBMC重悬为2×10

S3，取250μl步骤S2后的重悬细胞液加入到48孔培养板中即1×10

S4，取250μl步骤S2后的重悬细胞液加入到48孔培养板中即1×10

S5，对上述培养基在37℃，5％CO

步骤S1中，所述完全培养基中含有10wt％的胎牛血清。

步骤S1-5中所述完全培养基均为RPMI 1640培养基(品牌：Gibco)。

结果：

从图1可以看出，CL组在CFSE浓度为0与1μmol/L的时候可在视野内观察到明显的克隆团，当CFSE浓度高于2.5μmol/L时增殖克隆团消失，说明CFSE浓度对PBMC增殖有很大的影响；空白组无明显增殖，随CFSE浓度增高视野内可见的细胞碎片逐渐增多。

从图2可以看出，在细胞增殖第五天时，CL组在CFSE浓度较低的情况下(＜2.5μmol/L)，在视野内可见明显的增值团，空白组无明显增殖。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。