一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的NLR信号通路及其应用

摘要

本发明涉及一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的NLR信号通路及其应用，提供一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的遗传标记，所述遗传标记为NLR信号通路。同时提供检测本发明第一方面所述的遗传标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒的应用。以及提供一种用于鉴定抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒，提供一种筛选抗禽致病性大肠杆菌的商品肉鸡的方法。通过本发明。利用与禽致病性大肠杆菌相关的标记基因进行标记辅助选择，能够有效提供家禽免疫能力。提供了NLR信号通路基因的序列及鉴定方法，通过通路基因的引物，可利用Sanger测序法建立高效准确快速的分子标记辅助育种技术，使免疫力提高，可在早期进行选育，降低育种成本，提高生产效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的NLR信号通路及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

集约化高密度家禽业的迅速发展使家禽生产面临更多细菌性感染和炎症反应。禽致病性大肠杆菌（APEC）可引起严重的呼吸系统疾病，作为初级或继发性免疫原，经不同致病机制形成禽大肠杆菌病，每年可造成数百万美元损失，且具有人畜共感染的潜力。目前，APEC 菌株多表现为耐药性且其疫苗也仅作用于同类菌株。因此进行遗传选择—筛选抗禽致病性大肠杆菌的品种是较为有效且可行的方法。但遗传选择需要大量的成本来进行表型观察、组织病理学和存活率分析等试验。利用间接性状指标或分子标记来衡量表型、改进育种策略以降低成本尤为重要。

宿主感染后对多个组织检测基因的表达反应能更好的了解基因和通路的表达模式。已在人类的研究中证明基因表达具有中等遗传性。且研究表明不同MHC的单倍型与抗艾美球虫、禽流感和马立克氏病毒相关。因此通过特定基因或通路进行抗病品种的选育是简单有效的方法，而目前家禽生产中尚未对禽致病性大肠杆菌的抗性进行选择，更无相关遗传标记的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，为解决生产中抗禽致病性大肠杆菌商品肉鸡选育方法的空白，进行了大量研究，筛选出禽致病性大肠杆菌的抗性商品鸡和易感商品鸡，并进行转录组测序分析，发现免疫通路NOD-like receptor （NLR）在抗禽致病性大肠杆菌商品肉鸡的各免疫组织中显著性高表达，其与抗禽致病性大肠杆菌密切相关，从而完成本项研究，提供一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的NLR信号通路及其应用。

本发明的目的是这样实现的，一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的遗传标记，其特征是：遗传标记为NLR信号通路，该信号通路中NOD1（420677）、RIPK2（420215）、CARD9（427756）、MAPK3（373953）和FOS（396512）为关键标记基因。

检测权利要求1所述的遗传标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒的应用。

所述试剂为能够扩增所述标记基因的引物组合。

所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成；

SEQ ID NO.1：CTGTGTCCTGCAGAAAGT

SEQ ID NO.2：CCTGCTAACTGGATCTGTATT

SEQ ID NO.3：TCGAACCAGTCCTGAGAACG

SEQ ID NO.4：CGGATGTTTCCTCTTGGGGAT

SEQ ID NO.5：CAAGGCTAGCTGAGTCAAAG

SEQ ID NO.6：CTGTTGCAGCTCTTCCTAAA

SEQ ID NO.7：GCTTTCCCTACCACACAAA

SEQ ID NO.8：CCAGATATGGATGGGCTAAAG

SEQ ID NO.9：CCGCATGGAGTTTGTCTT

SEQ ID NO.10：AGATACCCAGCACCAGTTA。

一种用于鉴定抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒，包括能够检测权利要求1所述的标记基因的试剂。

所述试剂为能够扩增所述标记基因的引物组合。

：所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成；

SEQ ID NO.1：CTGTGTCCTGCAGAAAGT

SEQ ID NO.2：CCTGCTAACTGGATCTGTATT

SEQ ID NO.3：TCGAACCAGTCCTGAGAACG

SEQ ID NO.4：CGGATGTTTCCTCTTGGGGAT

SEQ ID NO.5：CAAGGCTAGCTGAGTCAAAG

SEQ ID NO.6：CTGTTGCAGCTCTTCCTAAA

SEQ ID NO.7：GCTTTCCCTACCACACAAA

SEQ ID NO.8：CCAGATATGGATGGGCTAAAG

SEQ ID NO.9：CCGCATGGAGTTTGTCTT

SEQ ID NO.10：AGATACCCAGCACCAGTTA。

一种筛选抗禽致病性大肠杆菌的商品肉鸡的方法，包括以下步骤：

1）、获取待测鸡的总RNA；

2）、检测所述总RNA中权利要求1中所述标记基因的表达量，感染禽致病性大肠杆菌后选择高表达量NOD1（420677）、RIPK2（420215）、CARD9（427756）、MAPK3（373953）和FOS（396512）的鸡，淘汰低表达量上述基因的鸡。

步骤2）中，利用引物组合检测所述标记基因的表达量；

所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成；

SEQ ID NO.1：CTGTGTCCTGCAGAAAGT

SEQ ID NO.2：CCTGCTAACTGGATCTGTATT

SEQ ID NO.3：TCGAACCAGTCCTGAGAACG

SEQ ID NO.4：CGGATGTTTCCTCTTGGGGAT

SEQ ID NO.5：CAAGGCTAGCTGAGTCAAAG

SEQ ID NO.6：CTGTTGCAGCTCTTCCTAAA

SEQ ID NO.7：GCTTTCCCTACCACACAAA

SEQ ID NO.8：CCAGATATGGATGGGCTAAAG

SEQ ID NO.9：CCGCATGGAGTTTGTCTT

SEQ ID NO.10：AGATACCCAGCACCAGTTA。

所述抗禽致病性大肠杆菌力强是指NLR通路基因高表达；

所述NLR通路基因高表达是指NLR通路基因表达量大于参考值， NLR通路基因低表达是指NLR通路基因表达量小于参考值；

所述参考值是指特定鸡种大量样本NLR通路基因表达量的平均值或中位值；

所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本；大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。

本发明方法先进科学，本发明第一方面提供一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的遗传标记，所述遗传标记为NLR信号通路，该信号通路中NOD1（420677）、RIPK2（420215）、CARD9（427756）、MAPK3（373953）和FOS（396512）为关键标记基因。

本发明第二方面提供检测本发明第一方面所述的遗传标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述标记基因的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第三方面提供一种用于鉴定抗禽致病性大肠杆菌的试剂盒，包括能够检测本发明第一方面所述的标记基因的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述标记基因的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第四方面提供一种筛选抗禽致病性大肠杆菌的商品肉鸡的方法，包括以下步骤：

（1）获取待测鸡的总RNA；

（2）检测所述总RNA中本发明第一方面所述标记基因的表达量，感染禽致病性大肠杆菌后选择高表达量NOD1（420677）、RIPK2（420215）、CARD9（427756）、MAPK3（373953）和FOS（396512）的鸡，淘汰低表达量上述基因的鸡。在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中利用引物组合检测所述标记基因的表达量。在本发明的一些实施 方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成。在本发明中，所述抗禽致病性大肠杆菌力强是指NLR通路基因高表达。

在本发明的一些实施方案中，所述NLR通路基因高表达是指NLR通路基因表达量大于参考值，所述NLR通路基因低表达是指NLR通路基因表达量小于参考值。在本发明的一些优选实施方案中，所述参考值是指特定鸡种大量样本NLR通路基因表达量的平均值或中位值，在本发明的一些更优选实施方案中，所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中，所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施例中，所述样本量为1200只商品肉鸡。

本发明相对于现有技术具有如下的优势和效果：

（1）利用本发明的与禽致病性大肠杆菌相关的标记基因进行标记辅助选择，能够有效提供家禽免疫能力。

（2）本发明同时提供了NLR信号通路基因的序列及鉴定方法，通过通路基因的引物，可利用Sanger测序法建立高效准确快速的分子标记辅助育种技术，使免疫力提高，可在早期进行选育，降低育种成本，提高生产效益。

附图说明

图1示出了不同表型鸡中各组织的载菌量。

图2示出了抗性鸡 vs. 易感鸡时不同组织中NOD-like receptor通路变化情况。

图3示出了不同表型鸡中NLR信号通路基因的表达量；其中横坐标代表基因；纵坐标代表基因相对表达量。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例1中，总共1200只商品肉鸡，进行10次重复试验。每次重复，对4周龄100只同一批孵化商品肉鸡的气囊注射0.1ml APEC O1进行感染，20只对照组注射0.1ml磷酸盐缓冲液模拟感染。在感染后1天后两组各取一半的鸡进行屠杀，采集心脏、肝脏、脾脏、血液、肺脏、法氏囊、骨髓和胸腺。感染5天后，屠杀剩余所有试验鸡，进行样品采集。样品采集结束后根据Peighambari et al.提供的方法对感染鸡组织病理变化进行检测，划分等级，检测各组织载菌量（图1），筛选抗性鸡和易感鸡。试验在美国爱荷华州立大学刘鹏实验室进行，所有公鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。

实施例1

血液、脾脏、骨髓、胸腺和法氏囊RNAseq转录组测序分析；

（1）取50mg脾脏、法氏囊、骨髓和胸腺，以及1ml血液，利用RNA提取试剂盒(AM1839)(Applied Biosystems, Foster City, CA) 进行总RNA提取。通过Agilent 2100Bioanalyser (Agilent Technologies)对RNA质量、浓度、完整性等进行检测，最终选择OD260/280比值大于2.0，RIN值大于9.0为合格以备后续试验。

（2）按照Illumina TruSeq® RNA Sample Preparation v2试剂盒说明书制备cDNA文库。利用Illumina® HiSeq 2000对制备的cDNA文库进行高通量测序，获得数据。

（3）测序数据分析。首先利用Fastx toolkit(version 0.0.13)软件过滤低质量碱基（Sanger base quality < 20）。用FastQC（version 0.10.1）软件检测过滤后的序列质量。然后用TopHat（version 2.0.9）和Bowtie（version 2.1.0）软件将每个样本的测序序列跟Ensembl数据库中的Gallus gallus 4.0基因组进行比对。利用R语言中的软件包edgeR(version 3.0.8)筛选差异表达基因。显著性差异表达基因的阈值为差异倍数大于1.5且FDR小于0.05。GOseq（version 1.10.0）软件用来检测差异表达基因富集的显著性差异变化的信号通路。

RNAseq转录组分析结果如图2所示，五个组织中检测出变化最显著的信号通路为NLR信号通路。

实施例2

NLR信号通路基因检测方法的建立；

（1）对与抗禽致病性大肠杆菌显著相关的NLR通路标记基因的目的片段引物扩增相应的核苷酸片段，序列扩增的上下游引物为：

上游引物NOD1-F：CTGTGTCCTGCAGAAAGT(SEQ ID NO.1)

下游引物NOD1-R：CCTGCTAACTGGATCTGTATT(SEQ ID NO.2)

上游引物RIPK2-R：TCGAACCAGTCCTGAGAACG(SEQ ID NO.3)

下游引物RIPK2-R：CGGATGTTTCCTCTTGGGGAT(SEQ ID NO.4)

上游引物CARD9-R：CAAGGCTAGCTGAGTCAAAG(SEQ ID NO.5)

下游引物CARD9-R：CTGTTGCAGCTCTTCCTAAA(SEQ ID NO.6)

上游引物MAPK3-R：GCTTTCCCTACCACACAAA(SEQ ID NO.7)

下游引物MAPK3-R：CCAGATATGGATGGGCTAAAG(SEQ ID NO.8)

上游引物FOS-R：CCGCATGGAGTTTGTCTT(SEQ ID NO.9)

下游引物FOS-R：AGATACCCAGCACCAGTTA(SEQ ID NO.10)

（2）PCR扩增

本实施例中试剂是由扬州必帮生物技术公司提供，引物合成及测序由上海生工公司完成。以已筛选的抗禽致病性大肠杆菌商品肉鸡血液总RNA为模板，使用引物NOD1-F+NOD1-R、RIPK1-F+RIPK1-R、CARD9-F+CARD9-R、MAPK3-F+MAPK3-R、FOS-F+FOS-R分别进行PCR扩增。

扩增体系如下：

RNA (50ng/μL) 1μL

X-F引物 (25 pMol/ul) 1μL

X-R引物 (25 pMol/ul) 1μL

2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix 12.5μL

QuantiTect RT Mix 0.25μL

RNase-free water 9.25μL

总体积 25μL

注：X指不同基因NOD1、RIPK1、CARD9、MAPK3和FOS。

PCR反应程序如下：

①50℃ 30min

②95℃ 15min

③94℃ 15s

④59℃ 30s

⑤72℃ 30s

⑥重复 ③-⑤ 39次

⑦72℃ 10min；

（3）检测扩增序列；

PCR扩增的产物X_SEQ在上海生工公司进行Sanger测序，基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组GRCg6a Primary Assembly进行比对，得出对应的基因序列，确保真实扩增相应基因。

PCR扩增产物NOD1_SEQ如下所示(SEQ ID NO.11)：CTGTGTCCTGC AGAAAGTCACTGATGCTTACTATGAACTTCAGCCTTGGCTGGATGAAATAGGTTACCAGCCTTCAGAGAATATTTGTAGTAAACCTGTCGTGAATACAGATCCAGTTAGC AGG；

PCR扩增产物RIPK1_SEQ如下所示(SEQ ID NO.12)：TCGAACCAGTCCTGAGAACGTTTGATGAAATAGCTATCCTGGAAGCAGTAATTCTCTTAAAGAGATCAAAGTCACAGTATGAATCGCCGTGTATCCACAAGAGTGGAAAAAAAGCAATTGTGGAGAAAACACCTCTAAATATACCACTGAATCCCCAAGAGGAAACA；

PCR扩增产物CARD9_SEQ如下所示(SEQ ID NO.13)：CAAGGCTAGCTGAGTCAAAGCTGGTAAAGATCAGCTGGGAAGGTGCTGCAGAAAGCTTCACCCACTGCATTGCCCGCCCTCCCCAGGGTCACAGCAGTGCCTTTGGTGTGCTGTGAGGTGTGACTTTTCTCAGGCCCCTTTAGGAAGAGCTGCAACAG；

PCR扩增产物MAPK3_SEQ如下所示(SEQ ID NO.14)：GCTTTCCCTACCACACAAA AATAAGGTACCATGGAACAGGCTGTTTCCCAATGCTGACCCCAAAGCACTTGATCTGTTGGATAAAATGTTGACCTTTAATCCTCATAAGCGAATTGAAGTGGAGCAAGCTTTAGCCCATCCATATCTGG；

PCR扩增产物FOS_SEQ如下所示(SEQ ID NO.15)：CCGCATGGAGTTTGTCTT GTCCCCAACGGCCCATCTGTGAGAGCTGGTAGTCTGTAGCATGTCCCACATGGCTGGGTTGGTGACTCCCCCCCTCCTTAGTGTCACTAGCATTAACTAATTAATCCCTCGGTTTTAAATGATTGGAATTAACTGGTGCTGGGTATCT；

实施例3

标记基因表达量分析；

本发明提供的一种筛选抗禽致病性大肠杆菌的标记基因，高表达NLR 信号通路基因的肉鸡为抗性鸡，低表达NLR信号通路基因的肉鸡为易感鸡，如图3所示，因此在继代选育过程中选留高表达NLR 信号通路基因的个体。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种与抗禽致病性大肠杆菌相关的NLR信号通路及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctgctaact ggatctgtat t 21

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<212> DNA

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tcgaaccagt cctgagaacg 20

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<212> DNA

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cggatgtttc ctcttgggga t 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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gctttcccta ccacacaaa 19

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<212> DNA

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ccagatatgg atgggctaaa g 21

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<212> DNA

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ctgtgtcctg cagaaagtca ctgatgctta ctatgaactt cagccttggc tggatgaaat 60

aggttaccag ccttcagaga atatttgtag taaacctgtc gtgaatacag atccagttag 120

cagg 124

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcgaaccagt cctgagaacg tttgatgaaa tagctatcct ggaagcagta attctcttaa 60

agagatcaaa gtcacagtat gaatcgccgt gtatccacaa gagtggaaaa aaagcaattg 120

tggagaaaac acctctaaat ataccactga atccccaaga ggaaaca 167

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tgacttttct caggcccctt taggaagagc tgcaacag 158

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