挥发油复配增溶剂及挥发油酪氨酸酶活性抑制的测定方法

摘要

本发明公开了挥发油复配增溶剂及挥发油酪氨酸酶活性抑制的测定方法；复配增溶剂应用于挥发油对酪氨酸酶活性抑制测定中的将非水溶性挥发油助溶于水溶性体系中；复配增溶剂包括二甲基亚砜、氢化蓖麻油、吐温20、乙醇；复配增溶剂与挥发油按照一定比例添加，按照挥发油使用量的质量百分数二甲基亚砜不超过20％；氢化蓖麻油不超过1％；吐温20不超过1％；乙醇不超过10％。本发明的复配增溶剂对酪氨酸酶的抑制作用低，同时满足既能溶解挥发油使体系澄清透明且对酪氨酸酶的活性影响控制在10％以下的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种挥发油复配增溶剂及挥发油酪氨酸酶活性抑制的 测定方法。

背景技术

酪氨酸酶抑制剂可以作为食品中的保鲜剂，或者农业中的抗虫剂，或者在医学和化妆品 中可作为皮肤脱色剂和增白美容化妆品等。

常见的酪氨酸酶抑制剂包括从动物中提取的多肽类化合物，植物中提取的黄酮类、糖苷 类、多酚类化合物以及微生物的代谢产物和化学合成物等。在这些抑制剂中，大部分为水溶 性成分。而近几年的研究报道中，存在着一类非水溶性物质——芳香植物挥发油(例如薰衣 草精油、柠檬精油或柠檬醛等)，其对酪氨酸酶活性抑制作用显著，是一类具有潜在应用价值 的活性化合物。

在现有技术中对于溶于挥发油中酪氨酸酶活性的测定，通常是将酪氨酸酶溶于挥发油中， 再使用单一的增溶剂将溶液溶于水溶性体系中进行测定，但是对于增溶剂本身对酪氨酸酶活 性的影响没有考虑，或是不能避免增溶剂对酪氨酸酶活性的影响。

例如在张青等在甜橙精油抑制酪氨酸酶的实验中，采用10％乙醇磷酸盐缓冲溶液配制甜 橙精油，实验中没有考虑乙醇本身对酪氨酸酶活性的抑制作用；南京师范大学姜洪芳等采用 二甲基亚砜作为薰衣草精油的溶剂溶解稀释薰衣草精油并进行酪氨酸酶抑制活性测定，实验 中没有考虑二甲基亚砜本身对酪氨酸酶活性的抑制作用；再如中国热带农业科学院廖良坤等 采用甲醇配置并稀释斜叶黄檀精油，并对酪氨酸酶活性进行抑制测定，甲醇容易引起蛋白质 变性，而酪氨酸酶是一种含铜蛋白，因此将一定程度上引起酪氨酸酶的失活；另外还有胡君 姣等将柠檬精油或柠檬醛等挥发性成分以一定比例加入0.5M pH6.86的PBS缓冲溶液中，然后 加入水溶性的体系进行酪氨酸酶活性抑制实验，但是由于柠檬精油或柠檬醛的非水溶特点， 在此体系下并不能真实反映柠檬精油或柠檬醛等对酪氨酸酶活性的抑制作用；上述对挥发油 中酪氨酸酶活性的测定中增溶剂对酪氨酸酶活性的影响都不低，这将影响芳香植物挥发油溶 液作为酪氨酸酶抑制剂的研究进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种挥发油复配增溶剂，可以解决上述技术问题中的一个或是多个。

为了达到上述目的，本发明提出的技术方案如下：

挥发油复配增溶剂，所述复配增溶剂应用于挥发油对酪氨酸酶活性抑制测定中的将挥发 油助溶于水溶性体系中；

所述复配增溶剂包括二甲基亚砜、氢化蓖麻油、吐温20、乙醇；

所述复配增溶剂在挥发油溶于水溶性体系时，所述复配增溶剂与所述挥发油按照一定比 例添加，按照挥发油使用量的质量百分数所述二甲基亚砜不超过20％；所述氢化蓖麻油不超 过1％；所述吐温20不超过1％；所述乙醇不超过10％。

进一步的：二甲基亚砜20％、乙醇10％、吐温201％、氢化蓖麻油1％。

进一步的：二甲基亚砜10％、乙醇5％、吐温201％、氢化蓖麻油0.5％。

进一步的：二甲基亚砜10％、乙醇5％、吐温201％、氢化蓖麻油1％。

进一步的：二甲基亚砜10％、乙醇10％、吐温200.5％、氢化蓖麻油1％。

进一步的：二甲基亚砜20％、乙醇5％、吐温200.5％、氢化蓖麻油1％。

进一步的：二甲基亚砜20％、乙醇10％、吐温200.5％、氢化蓖麻油0.5％。

进一步的：所述挥发油是非水溶性芳香植物挥发油。

进一步的：所述挥发油与水溶性体系(例如PBS缓冲液)的使用比例范围为 1uL/mL-500uL/mL。

一种挥发油酪氨酸酶活性抑制的测定方法，包括如下步骤：

(1)准备PBS缓冲溶液待用；所述PBS缓冲溶液是pH6.86的磷酸盐缓冲液；

(2)应用步骤(1)中的PBS缓冲溶液配制酪氨酸酶液待用；

所述酪氨酸酶液是称取0.0036g的L-酪氨酸酶，用pH6.86的PBS缓冲溶液溶解后，用25ml 容量瓶定容所获得的；

(3)应用步骤(1)中的PBS缓冲溶液配制L-酪氨酸溶液待用；所述L-酪氨酸溶液是称取 0.0181g L-酪氨酸，用pH6.86的PBS缓冲溶液溶解后，用100ml容量瓶定容，摇匀所获得；

(4)准备挥发油待用；所述挥发油为非水溶性芳香植物挥发油；

(5)准备复配增溶剂各试剂、所述复配增溶剂包括上述任意一项所述的复配增溶剂；

(6)将氢化蓖麻油在50-60℃隔水加热融化后，加入步骤(5)中的挥发油，搅拌均匀至澄清；

(7)在步骤(6)的溶液中依次加入吐温20，继而依次加入乙醇、吐温20(TW20)和 二甲基亚砜(DMSO)，搅拌至溶液均匀澄清；

(8)将步骤(7)所获得的澄清溶液加入到步骤(2)的PBS缓冲溶液中，搅拌至澄清；

(9)在步骤(8)所获得的澄清溶液中加入步骤(3)中的酪氨酸酶液，于30℃水浴10min；

(10)然后在步骤(9)的混合溶液中加入步骤(4)中的L-酪氨酸溶液,立即开始计时； 测定反应20min时475nm波长下的吸光值以测定挥发油对。

本发明的技术效果是：

本发明的复配增溶剂在配合挥发油使用时，与现有技术中单一成分的增溶剂相比不但对 酪氨酸酶的抑制作用低，同时满足既能溶解挥发油使体系澄清透明且对酪氨酸酶的活性影响 控制在10％以下的要求；让酪氨酸酶抑制剂发挥最大作用。

附图说明

图1是乙醇和DMSO的结果对比示意图；

图2是不同浓度的乙醇溶液作用于酪氨酸酶结果对比示意图；

图3是不同浓度的DMSO作用于酪氨酸酶结果对比示意图；

图4是氢化蓖麻油和TW20的结果结果对比示意图；

图5的氢化蓖麻油对酪氨酸酶存在影响结果对比示意图；

图6是以TW-20为作用溶剂加入到测定酪氨酸酶的反应体系中的结果对比示意图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说明仅用 来解释本发明，但并不作为对本发明的不当限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申 请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图 包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时， 其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明采用的挥发油对酪氨酸酶活性抑制的测定方法，

包括准备步骤如下：

准备步骤一：磷酸盐缓冲液的配制：称取磷酸二氢钾6.803g用蒸馏水定容至1000ml，称 取磷酸氢二钾7.099g用蒸馏水定容至1000ml。取配置好的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液各 50ml，混匀即为pH为6.86的磷酸盐缓冲液。

准备步骤二：酪氨酸酶液的配制：称取0.0036g L-酪氨酸酶，用步骤一配置的pH为6.86 的磷酸盐缓冲液溶解，并定容至25ml容量瓶中。现用现配。

准备步骤三：L-酪氨酸溶液的配制：称取0.0181g L-酪氨酸，用步骤一配置的PH为6.86 的磷酸盐缓冲液溶解后，用100ml容量瓶定容，摇匀，密封保存于4℃冰箱待用。

准备步骤四：选择一种挥发油(在本实施例中选择的是柠檬精油)，同时准备复配增溶剂 组分中的各种试剂。所述挥发油与水溶性体系(缓冲液)的使用比例范围为1uL/mL-500uL/mL。

酪氨酸酶活性的测定方法：总反应体系为5mL。具体见表1:

注:用分光光度计测量吸光值时,“受试液(挥发油，在这里是薰衣草精油、玫瑰精油、 柠檬精油任意一种或几种)”以“阴性对照1”调零；“标准对照”以“阴性对照2”调零。

在实验过程中，5ml液体中；受试液与酶液的体积比是0.5:1；酶液与L-酪氨酸体积比是 1:2.5；5ml液体中余下液体是PBS缓冲液。

整个测定的过程如下：

测定步骤一，将氢化蓖麻油在50-60℃隔水加热融化后，加入挥发油，搅拌均匀至澄清；

测定步骤二，在测定步骤一的溶液中依次加入吐温20，继而依次加入乙醇、TW 20和DMSO， 搅拌至溶液均匀澄清；

测定步骤三：将测定步骤二所获得的澄清溶液加入到磷酸盐缓冲液中，搅拌至澄清；

测定步骤四：将测定步骤三的澄清溶液加入到酪氨酸酶液中，于30℃水浴10min；

测定步骤五：在测定步骤四的溶液中加入L-酪氨酸溶液(底物),立即开始计时；测定反 应20min时475nm波长下的吸光值以测定挥发油对。

测定时以相应的阴性对照为参比，根据公式(1)计算受试液对酪氨酸酶的抑制率。

其中，“A”为标准对照的吸光值,“B”为受试液的吸光值。

通常来说每一实验做3个平行。抑制率以“均数×(1±标准差的百分比)”，即“X(1± S％)”表示。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。不能作为非水溶性成分对酪氨酸 酶的溶剂。

本发明的复配溶增剂对酪氨酸酶活性抑制的影响；复配实验设计见表2，将溶剂与一定浓 度的挥发油混合后配制成受试液，并测定所得受试液是否完全溶解均匀，澄清透明。如不透 明，即使完全溶解也将影响酪氨酸酶活性的判定时读取的数据，因此需选择澄清透明的复配 比例，做第一步的复配增溶剂的筛选。

选择确定澄清透明的溶剂体系(复配增溶剂)以后，不加精油，采用(1)的方法测定体 系对酪氨酸酶活性的影响，以低酪氨酸酶抑制率为指标选择溶剂(挥发油与本增溶剂混合) 配比方案。结果见表3

注：“-”表示因为精油未溶解，或者溶解后不澄清的，不进行酪氨酸酶活性抑制测定。

本实验过程中，在不加入精油的情况下各复配增溶剂在PBS溶液中都是澄清的溶液，当 加入100ul精油后，而单独配置浓度的DMSO和乙醇溶液并不能够把精油完全溶解，会出现溶 液浑浊的状态；在增加了TW20和氢化蓖麻油进行四种溶剂按比例复配时，不同的配比实现了 对精油的溶解，让溶剂本身对酪氨酸酶的抑制作用也有所降低，更真实的反应了精油对酪氨 酸酶的抑制作用。

根据复配实验结果，六组配比能满足既能溶解挥发油使体系澄清透明且对酪氨酸酶的活 性影响控制在10％以下，六组配比分别为：

A

A

A

A

A

A

对比例1：南京师范大学姜洪芳等采用二甲基亚砜稀释薰衣草精油来测定对酪氨酸酶活 性的影响，而实际中100％DMSO本身对酪氨酸酶活性抑制率为75.77％，因此DMSO本身不宜作 为挥发油类非水溶性成分的助溶剂。

对比例2：张青等采用的10％的乙醇磷酸盐溶液，对酪氨酸酶活性的抑制率为17.86％； 因此乙醇本身同样不宜作为挥发油类非水溶性成分的助溶剂。

另外，为了证明本复配增溶剂对挥发油的影响降低显著，本发明还做了不同浓度的DMSO、 乙醇、氢化蓖麻油、TW20作为单一溶剂对酪氨酸酶活性的影响。如下表4所示。

同时考察上述单一溶剂在不同时间内对酪氨酸酶活性的影响规律，抽取几个浓度分别测 定了1-6min内对酪氨酸酶活性的影响。测定过程是在475nm下读取的吸光度值越高说明酪氨 酸酶活性越高，反之亦然。

其中乙醇浓度依次为10％，20％，40％，60％，80％，100％；

DMSO浓度依次为10％，20％，40％，60％，80％，100％；

氢化蓖麻油浓度0.1％，0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％；

TW20浓度分别为0.1％，0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％。

对于乙醇和DMSO的结果如柱状图1所示，根据实验结果，除10％的DMSO对酪氨酸酶活 性抑制在10％以下以外，其他均高于10％，DMSO呈现明显的剂量依赖性，而乙醇在60％时达到 最高，为90.46％。

如图2所示，当不同浓度的乙醇溶液作用于酪氨酸酶时，除5％乙醇溶液对酪氨酸酶活性 影响不显著之外，其他浓度乙醇溶液对酪氨酸酶活性的影响均比DMSO显著。

10％的乙醇溶液和20％的乙醇溶液对酪氨酸酶活性影响相接近，但30％的乙醇溶液对酪氨 酸酶活性的影响比10％和20％的乙醇溶液显著。

如图3所示，当不同浓度的DMSO作用于酪氨酸酶时，发现随着DMSO浓度的升高，酪氨 酸酶活性逐渐降低，且随着时间延长降低越明显。当DMSO的浓度为10％时，其对酪氨酸酶活 性的影响不显著，时间-吸光度变化的曲线也几乎与PBS空白对照组接近。

如图4所示，对于氢化蓖麻油和TW20的结果如柱状图4所示，根据实验结果，氢化蓖麻 油和TW 20在设定的浓度范围内，对酪氨酸酶活性的抑制作用低于DMSO和乙醇，但呈现出剂 量依赖性。

如图5所示，氢化蓖麻油对酪氨酸酶存在影响，加入不同量的氢化蓖麻油对酪氨酸酶均 呈现出抑制作用，且对酪氨酸酶的抑制作用有剂量效应。

如图6所示，以TW-20为作用溶剂加入到测定酪氨酸酶的反应体系中，可以看出TW-20 对酪氨酸酶也存在抑制作用，其抑制能力比同样用作增溶剂的氢化蓖麻油要强。

理论上来说，DMSO和乙醇同样对酪氨酸酶具有抑制效果，在叠加之后抑制效果应该增加， 但是本发明中复配了同样对酪氨酸酶具有抑制效果对氢化蓖麻油和TW-20之后，增溶剂对酪 氨酸酶对抑制效果反而下降了；但是增溶效果并没有衰减，用量也变小了。而在现有技术中， 氢化蓖麻油和TW-20在挥发油溶解测定酪氨酸酶的反应体系中是没有报道的。

通过上述对比结果，在现有技术中均是采用单一成分的溶剂作为增溶剂、在研究挥发油 溶解酪氨酸酶抑制效果；此时挥发油溶解酪氨酸酶抑制率并没有反应挥发油真实的抑制率； 但是本发明通过调整增溶剂的配方，使本发明的复配增溶剂在研究挥发油溶解酪氨酸酶抑制 效果时对挥发油的影响最低；因此更能真实的反应挥发油溶解酪氨酸酶抑制效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。