用于脂质定量的系统和方法

摘要

本公开涉及用于筛选脂质的方法、系统和装置。该技术包括：选择一组标准品以鉴定至少一种期望类型的脂质，将标准品掺入生物样品中以形成样品基质，从样品基质中提取脂质，以及将样品基质引入色谱系统中以分离期望类型的脂质。一旦使用HILIC色谱法将脂质分离成不同的脂质类型，就将它们引导至检测器，并且基于所测量的检测器响应与用已知浓度的所选组标准品生成的校准曲线之间的比较来定量分离的脂质。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月21日提交的标题为“SYSTEM AND METHOD FOR LIPIDQUANTIFICATION”的美国临时专利申请号62/734,410的权益和优先权，该美国临时专利申请的全部内容据此全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开整体涉及用于鉴定和定量脂质的系统和方法。具体地讲，本公开涉及使用联接到质谱仪的色谱系统鉴定和定量脂质的系统和方法。

背景技术

色谱法涉及流动相在固定相上方流动以实现分离，并且通常与检测器诸如质谱仪组合。MS的进步已允许更深入地分析脂质；然而，已证明明确的鉴定和定量是困难的，因为脂质表现出大量的同分异构和同量异位脂质物质。此外，MS谱通常包含来自多个化合物的峰和片段，使得特定分子物质的置信度鉴定和相对定量困难且耗时。因此，脂质数据在实验室之间的传输受到严重阻碍，从而使得利用多位点研究得出生物学解释成为问题。

发明内容

由于大量同分异构和同量异位脂质物质，对脂质的鉴定和定量提出了许多挑战。用于明确且有效地鉴定和定量脂质的技术将是有益的和高度期望的。

在一个方面，本技术涉及用于筛选脂质的方法。该方法包括选择一组标准品以鉴定至少一类脂质；将所述标准品与生物样品组合以形成样品基质；将所述样品基质引入色谱系统中以分离所述至少一类脂质；将所述分离的脂质引导至检测器；以及基于检测器数据与用已知浓度的该组标准品生成的校准曲线之间的比较来定量分离的脂质。在一个示例性实施方案中，检测器被配置成使用多反应监测(MRM)转变执行分离的脂质的靶向定量。在另一个示例性实施方案中，MRM转变以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个示例性实施方案中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段、或中性丢失片段。在另一个示例性实施方案中，脂质的类型包括单取代基甘油糖脂(monoradylglycerolipids)(MG)、二取代基甘油糖脂(diradylglycerolipids)(DG)、三取代基甘油糖脂(triradylglycerolipids)(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、胆固醇酯、己异辛基神经酰胺、双己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。在另一个示例性实施方案中，色谱系统是亲水相互作用色谱(HILIC)系统。

在另一方面，本技术涉及一种用于鉴定潜在生物标志物的方法。该方法包括选择一组标准品以鉴定至少一类脂质；将该组标准品与多个与医学病症相关联的生物样品组合以形成样品基质；将所述样品基质引入色谱系统中以分离所述至少一类脂质；将所述分离的脂质引导至检测器；基于检测器数据与用已知浓度的该组标准品生成的校准曲线之间的比较来定量分离的脂质；以及确定所述分离的脂质与所述医学病症之间的关系。在一个示例性实施方案中，检测器被配置成使用多反应监测(MRM)转变执行分离的脂质的靶向定量。在另一个示例性实施方案中，MRM转变以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个示例性实施方案中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段、或中性丢失片段。在另一个示例性实施方案中，脂质的类型包括单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、胆固醇酯、己异辛基神经酰胺、双己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。在另一个示例性实施方案中，色谱系统是亲水相互作用色谱(HILIC)系统。

在另一方面，本技术涉及用于诊断筛选的方法。该方法包括选择一组标准品以鉴定至少一类脂质，其中该至少一类脂质的增加或减少的存在指示医学病症。该方法还包括将该组标准品与生物样品组合以形成样品基质；将所述样品基质引入色谱系统中以分离所述至少一类脂质；以及将所述分离的脂质引导至检测器以确定来自所述生物样品的所述至少一类脂质的量。在一个示例性实施方案中，检测器被配置成使用多反应监测(MRM)转变执行分离的脂质的靶向定量。在另一个示例性实施方案中，MRM转变以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个示例性实施方案中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段、或中性丢失片段。在另一个示例性实施方案中，脂质的类型包括单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、胆固醇酯、己异辛基神经酰胺、双己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。在另一个示例性实施方案中，色谱系统是亲水相互作用色谱(HILIC)系统。

本技术的上述方面提供了许多优点。具体地讲，本文所述技术的示例提供对血浆和血清中的106种含胆碱磷脂(61种PC、24种SM和21中LPC)、24种神经酰胺、23种己糖基神经酰胺、24种FFA和鞘氨醇的快速定量。本文所公开的示例性实施方案还提供了用于分析血浆中极性和非极性脂质类型的高通量(低至8分钟)、定量和全面的LC/MS/MS方法。示例性实施方案还可提供用于快速分离16种极性脂质类型和非极性脂质类型，以及从血浆样品定量504种脂质物质(250种正离子模式进样和254种负离子模式进样)的方法。本文所公开的示例性实施方案还可使用MRM转变来改善磷脂酰胆碱(PC)的鉴定和特异性。

应当理解，以下更详细讨论的前述概念和附加概念的所有组合(前提条件是此类概念不相互矛盾)被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地，出现在本公开末尾的受权利要求保护的主题的所有组合被设想为本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，也可出现在以引用方式并入的任何公开中的本文明确采用的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

附图说明

本领域普通技术人员将理解，附图主要是出于说明性目的并且不旨在限制本文描述的发明主题的范围。附图未必按比例绘制；在一些情况下，本文公开的主题的各个方面可能在附图中被夸大或放大以便于理解不同的特征。在附图中，相同的附图标记通常表示相同的特征(例如功能相似和/或结构相似的元件)。

图1示出了根据本公开的实施方案，与非靶向方法相比，基于示例性HILIC的全面且高通量非极性脂质类型和极性脂质类型分离和定量方法的概述。

图2A为示出根据本公开的实施方案的用于筛选脂质的示例性方法的流程图。

图2B为示出根据本公开的实施方案的用于鉴定潜在生物标志物的示例性方法的流程图。

图2C为示出根据本公开的实施方案的用于筛选脂质的示例性方法的流程图。

图3为示出根据本公开的实施方案的使用来自单独批次的五根柱的150次不同脂质标准品进样的保留时间再现性的图。

图4为根据本公开的实施方案的示例性脂质标准混合物的色谱图。

图5A-5D是根据本公开的实施方案的用于正等离子体筛选和负等离子体筛选的示例性脂质物质和转变的图表。

图6示出了根据本公开的实施方案的表示以正离子模式从标准混合物中HILIC分离PC、SM和LPC的色谱图。

图7示出了SM和PC的结构表示。

图8是示出根据本公开的实施方案的血浆中内源性SM和LPC的类型分离，从而使可能的同量异位效应最小化的色谱图。

图9A示出了根据本公开的实施方案的SIL标准品LPC(18:1)(d7)的示例性校准曲线。

图9B示出了根据本公开的实施方案的SM(18:1)(d9)的示例性校准曲线。

图9C-9D示出了根据本公开的实施方案，分别表示处于正离子模式和负离子模式的PC的示例性校准曲线。

图10示出了鞘脂(SL)、神经酰胺(Cer)、鞘氨醇1-磷酸酯(S1P)、鞘磷脂(SM)和己糖基神经酰胺(HexCer)的结构，以及长链碱基(LCB)离子m/z 264(由SL生成的特征性产物离子)。

图11A示出了根据本公开的实施方案的表示神经酰胺和鞘氨醇的重叠色谱图。

图11B示出了根据本公开的实施方案的表示己糖基神经酰胺物质的重叠正离子模式色谱图。

图12为示出根据本公开的实施方案的与Cer、HexCer和SPH峰相比的TG和SM保留时间的色谱图。

图13A示出了根据本公开的实施方案的SM(18:1)(d9)(3-1500ng/mL)的校准曲线。

图13B示出了根据本公开的实施方案的TG(15:0/18:1/15:0)(d7)(5.5-2750ng/mL)的校准曲线。

图14是表示根据本公开的实施方案的脂质标准品的混合物的示例性HILIC分离的正离子模式色谱图。

图15A-15B示出了根据本公开的实施方案的从血浆样品以正离子模式进行的HILIC脂质类型分离的代表性色谱图。

图16-19示出了根据本公开的实施方案的以负离子模式进行的HILIC脂质类型分离的代表性色谱图。

图20示出了根据本公开的实施方案的处于正离子模式的15:0/18:1(d7)PC的代表性校准曲线。

图21示出了根据本公开实施方案的来自血浆样品的处于负离子模式的15:0/18:1(d7)PG的代表性校准曲线。

图22示出了不同直链脂肪酸的结构和命名。

图23示出了根据本公开的实施方案的表示血浆中内源性FFA脂质的HILIC分离的重叠色谱图。

图24示出了根据本公开的实施方案的PG(15:0/18:1)(d7)(16-8000ng/mL)的代表性校准曲线。

图25示出了根据本公开的实施方案的PC(15:0/18:1)(d7)(16-8000ng/mL)的代表性校准曲线。

图26A-26D示出了根据本公开的示例性实施方案的示出胆碱头基的色谱图。

图27A-图27C示出了根据本公开的示例性实施方案的示出胆碱头基的色谱图。

当结合附图时，通过下面阐述的具体实施方式，本公开的特征和优点将变得更加显而易见。

具体实施方式

下面更详细地描述与用于鉴定和定量脂质的方法、装置和系统相关的各种概念以及它们的实施方案。应当理解，上面介绍并在下面更详细讨论的各种概念可能以多种方式中的任一种来实现，因为所公开的概念不限于任何特定的实现方式。主要为了进行示意性的说明而提供了特定具体实施和应用的示例。

如本文所用，术语“包括”意指包括但不限于，术语“包含”意指包括但不限于。术语“基于”意指至少部分地基于。

语言“生物样品”是指包含分子或分子混合物的任何溶液或提取物，所述分子或分子混合物包含至少一种来源于生物来源(诸如，人和动物)的经历提取或分析的生物分子。生物样品旨在包括粗制或纯化的(例如，分离的或商购获得的)样品。具体示例包括但不限于包涵体、生物流体、生物组织、生物基质、包埋的组织样品、细胞(例如，一种或多种类型的细胞)和细胞培养上清液。

除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括端值在内。

脂质是维持细胞结构所必需的，并且在能量储存和细胞信号转导中起重要作用。还已知脂质在疾病诸如癌症、神经退行性疾病、感染、糖尿病等的病理生理学中是重要的。因此，脂质组学领域已经在致力于鉴定疾病生物标志物和探测疾病机制时出现。

脂质构成一组天然存在的分子，其包括脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素(诸如维生素A、D、E和K)、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂等。主要脂质类别包括，诸如脂肪酸、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇脂质、异戊烯醇脂、脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)、以及其他含甾醇代谢物诸如胆固醇。

还应理解，脂质可归类为以下组，包括例如，单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)以及赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。

含胆碱脂质诸如磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)是细胞膜的主要组分。PC可占真核细胞膜中磷脂的多于50％。SM通过将磷脂酰胆碱基团从PC转移到神经酰胺来合成，从而在细胞膜中形成唯一的非甘油磷脂。对测量这些脂质物质的关注已增加，因为它们已被鉴定为涉及多种疾病，包括例如多发性硬化症和尼曼-皮克疾病。

鞘脂(SL)是一类包含神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和更复杂的鞘糖脂的脂质。所有SL中常见的组分是“长链”或“鞘氨醇”碱。这些碱基是有机脂族氨基醇，诸如鞘氨醇(SPH)或结构上类似的化合物。它们是细胞膜的基本组分，并且涉及多种生物学功能，包括细胞信号转导和细胞凋亡。SL可诱导肿瘤细胞增殖并且可对化学疗法具有抗性；已发现Cer和己糖基神经酰胺(HexCer)在帕金森病患者中表现出升高的水平。SL的快速代谢互变以及具有类似功能的大量衍生物在产生单个鞘脂的功能特征方面提出了挑战。

传统上，脂质仅与涉及能量储存的细胞作用相关联，并且用作结构构件。随着质谱方法的进步，生物医学脂质研究的最新进展已确定脂质在包括癌症、炎症和心血管疾病的不同疾病或状态中的重要作用。

真实生物样品中脂质的极端结构多样性对于用于脂质组学分析的分析技术是具有挑战性的，这是由于各个脂质物质的物理化学性质(诸如酸度、碱度、中性、极性和非极性)的巨大差异。目前，用于脂质组学的两种主要分析策略是直接输注MS和高性能反相LC/MS。直接输注MS提供高通量分析，但由于可能的离子抑制，对于同量异位物质的分离和拆分以及低丰度物质的鉴定可能不太方便。反相(RP)-LC基于脂质分子物质的亲脂性而广泛用于各个脂质分子物质的分离，所述亲脂性由碳链长度和双键数决定。因此，来自不同类型的脂质物质可共洗脱。正相方法也用于使用溶剂诸如己烷和氯仿分离脂质类型，但是它们冗长的洗脱、有限的分析物溶解度和缺乏与质谱仪检测的溶剂相容性可使该技术不太有吸引力。

亲水相互作用色谱(HILIC)是一种类型的正相色谱，其可用于用反相溶剂体系分离脂质类型以克服这些潜在的挑战。使用HILIC的脂质类型分离便于LC/MS定量，因为脂质类型稳定的同位素标记的(SIL)标准品在相同的流动相和基质组成下与特定脂质类型内的脂质物质共洗脱。这为SIL标准品和测定的脂质类型提供了相同的电离条件。按类型分离脂质物质的附加有益效果导致定量所需的SIL标准品较少，从而节约了成本。本公开包括基于HILIC的全面和高通量非极性和极性脂质类型分离和定量的示例。

基于亲水相互作用色谱(HILIC)的方法可提供多种有益效果。例如，基于HILIC的方法可使用通常用于反相分离的溶剂，其与电喷雾电离(ESI)相容。即，可使用溶剂，诸如乙腈、甲醇和水。此外，在HILIC方法中，可使用高度有机的流动相(例如，>80％乙腈)，这继而通过有效的流动相去溶剂化和化合物电离导致改善的电喷雾离子化。

脂肪酸(FA)是由羧基(-COOH)和甲基官能团组成的烃链。传统命名法将羧基基团旁边的碳原子命名为α，并将后续的一个碳命名为β碳，其中甲基碳被命名为ω。脂肪酸链可在特定位置处包含一个或多个双键(具有顺式(Z)或反式(E)构型的不饱和的和多不饱和的)，或者它们可为完全饱和的。在碳链上具有多个甲基支链中的一个的支链脂肪酸更常见地存在于原核生物中，但是据报道存在于牛乳脂和新生儿胃肠道中。

虽然游离的(非酯化的)脂肪酸(FFA或NEFA)仅代表血浆中总脂肪酸的一小部分，但它们代表高代谢活性的脂质类型。血浆中最丰富的FFA由油酸(18:1)、棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)组成，并且这些一起构成所有FFA的78％。不饱和家族中的一些FA物质是长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，它们被称为必需的，因为它们不能从头合成。示例包括主要PUFA，诸如亚油酸(18:2(n-6))、花生四烯酸(20:4(n-6))、α-亚麻酸(18:3(n-3))、γ-亚麻酸(18:3(n-6))、二十碳五烯酸(20:5(n-6),EPA)和二十二碳六烯酸(22:6(n-3),DHA)。类二十烷酸是来源于花生四烯酸和相关多不饱和脂肪酸(PUFA)的局部作用的生物活性信号传导脂质，其调节与多种疾病(包括代谢综合征障碍和癌症)相关的各式各样的稳态和炎性过程。

图1示出了根据本公开的实施方案，基于示例性HILIC的全面且高通量非极性脂质类型和极性脂质类型分离和定量方法的概述。在该非限制性示例中，该方法包括样品制备101、MS分析103和数据处理105的更高级别步骤。在该示例中，样品制备101包括对照样品107以及包括疾病109或一些感兴趣的医学病症的生物样品的制备。对样品107、109两者执行提取方法111。一旦样品制备步骤101完成，就执行MS分析103。传统的开放表达谱113可包括输注、LC-MS分析和/或离子迁移率(IM)-MS。在一些实施方案中，本公开中描述的技术包括靶向分析115，该靶向分析可包括LC-MS/MS分析、多反应监测(MRM)转变和脂质类型筛选。一旦完成MS分析103，就可执行数据处理105。在非限制性示例中，数据处理105包括以下步骤：数据采集117、数据处理119和生物学解释121。在各种实施方案中，本文所述的技术可应用于筛选或鉴定脂质，鉴定与疾病或医学病症相关联的生物标志物，或作为诊断筛选的方法。

图2A为示出根据本公开的实施方案的用于筛选脂质的示例性方法的流程图。在步骤201中，选择一组标准品以鉴定至少一类脂质。如上所述，脂质的类型可包括例如，单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。

在步骤203中，将该组标准品与生物样品组合以形成样品基质。一旦形成样品基质，就在步骤205中将样品基质引入色谱系统中以分离脂质。在非限制性示例中，色谱系统可包括基于HILIC的系统。在一些示例性实施方案中，在引入色谱系统之前，从样品基质中提取脂质。在一些实施方案中，该步骤可在步骤203和205之间执行。

在步骤207中，将分离的脂质引导至检测器。在一个非限制性示例中，检测器被配置成使用MRM转变执行脂质的靶向定量。在一些实施方案中，MRM转变可以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个非限制性示例中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段或中性丢失片段，这取决于脂质类型。

如本文所用，“酰基”基团是指通过从含氧酸中去除一个或多个羟基基团而衍生的官能团。酰基基团通常衍生自羧酸。因此，它通常具有式RCO—，其中R表示用单键附接到CO基团的烷基基团。

在步骤209中，基于检测器数据与用已知浓度的该组标准品生成的校准曲线之间的比较来定量分离的脂质。在一些实施方案中，校准曲线可在之前生成，或者校准曲线数据可从数据库或库中检索。在目标浓度范围内制备一组标准品，并且检测器响应在y轴上相对于已知浓度的脂质内标在x轴上绘制。使用TargetLynx或Skyline来处理数据，并将最小二乘线性回归计算用于确定与数据最佳拟合的直线的方程。然后使用该公式将生物样品的测量的检测器响应转换为生物样品的预测浓度。

图2B为示出根据本公开的实施方案的用于鉴定潜在生物标志物的示例性方法的流程图。在步骤221中，选择一组标准品以鉴定至少一类脂质。如上所述，脂质的类型可包括例如，单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。

在步骤223中，将该组标准品与多个与医学病症或特定疾病相关联的生物样品组合以形成样品基质。一旦形成样品基质，就在步骤225中将样品基质引入色谱系统中以分离脂质。在非限制性示例中，色谱系统可包括基于HILIC的系统。在一些示例性实施方案中，在引入色谱系统之前，从样品基质中提取脂质。在一些实施方案中，该步骤可在步骤223和225之间执行。

在步骤227中，将分离的脂质引导至检测器。在一个非限制性示例中，检测器被配置成使用MRM转变执行脂质的靶向定量。在一些实施方案中，MRM转变可以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个非限制性示例中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段或中性丢失片段，这取决于脂质类型。

在步骤229中，基于检测器数据与用已知浓度的该组标准品生成的校准曲线之间的比较来定量分离的脂质。在一些实施方案中，校准曲线可在之前生成，或者校准曲线数据可从数据库或库中检索。

在步骤231中，可确定分离的脂质与医学病症之间的关系。例如，如果在步骤223中形成的样品基质包括与特定疾病或感染相关联的生物样品，并且如果在步骤221中选择的该标准品被选择用于鉴定一种特定类型的脂质，如果以显著高的速率检测和定量该特定类型的脂质，则可确定所检测类型的脂质与生物样品中的特定疾病或感染之间存在关系。此类技术可用于鉴定与大量医学病症相关联的各种脂质生物标志物。

图2C是示出根据本公开的实施方案的用于诊断筛选的示例性方法的流程图。在步骤241中，选择一组标准品以鉴定至少一类脂质，其中该类脂质的增加或减少的存在指示医学病症。如上所述，脂质的类型可包括例如，单取代基甘油糖脂(MG)、二取代基甘油糖脂(DG)、三取代基甘油糖脂(TG)、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇、己异辛基神经酰胺、脂蛋白(a)(LPA)、脂多糖(LPS)或赖氨酰-磷脂酰甘油(LPG)。

在步骤243中，将该组标准品与生物样品组合以形成样品基质。在非限制性示例中，生物样品可包括来自患者的血浆样品，并且图2C中所述的技术可用作针对特定医学病症筛选患者的方法。一旦形成样品基质，就在步骤245中将样品基质引入色谱系统中以分离脂质。在非限制性示例中，色谱系统可包括基于HILIC的系统。在一些示例性实施方案中，在引入色谱系统之前，从样品基质中提取脂质。在一些实施方案中，该步骤可在步骤243和245之间执行。

在步骤247中，将分离的脂质引导至检测器以确定生物样品中的该类脂质的量。在非限制性示例中，生物样品可以为来自患者的生物样品，并且在步骤247中检测到的特定类型的脂质的任何增加或减少可以指示医学病症。如上所述，检测器可被配置成使用MRM转变来执行脂质的靶向定量。在一些实施方案中，MRM转变可以正离子模式和负离子模式两者执行。在另一个非限制性示例中，MRM转变可为脂肪酰链片段、头基片段或中性丢失片段，这取决于脂质类型。

图3为示出根据本公开的实施方案的使用来自单独批次的五根柱的150次不同脂质标准品进样的保留时间再现性的图。在该示例性实验中，所测试的脂质包括LPC、LPE、PC、PE、PG、SM、PI、PS和PA，并且示出小于1％的保留时间RSD(PG(d7)除外，其小于2％)。

图4为根据本公开的实施方案的示例性脂质标准混合物的色谱图。该色谱图的LC条件包括在45℃下95:5乙腈/水+10mM乙酸铵和50:50乙腈/水+10mM乙酸铵的流动相。用于不同脂质类型的示例性MRM转变在下表1中示出。

图5A-5D是根据本公开的实施方案的用于表1中所述的正等离子体筛选和负等离子体筛选的示例性脂质物质和转变的图表。图5A示出了利用正等离子体筛选鉴定的脂质物质(250)的饼图，并且图5B示出了正等离子体筛选的转变(326)总数。类似地，图5C示出了利用负等离子体筛选鉴定的脂质物质(254)的饼图，并且图5D示出了负等离子体筛选的转变456)的总数。

实施例1包括示例性的基于HILIC的LC-MS/MS高通量靶向磷脂筛选(PC、LPC、SM)。该实施例示出了血浆和血清中106种含胆碱的磷脂(61种PC、24种SM和21种LPC)的快速定量，以及使用来自两个脂肪酰链片段的MRM转化改善的PC鉴定和特异性。用于在MS分析之前按类型分离脂质的基于HILIC的方法可减少鉴定歧义。按类型分离脂质物质的附加有益效果导致定量所需的SIL标准品较少，从而节约了成本。

在本实施例实验中，用9种浓度水平的SIL(SPLASH LIPIDOMIX

采用样品制备程序，其使用利用异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀并温育2小时。将提取的样品离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中进行LC/MS分析。用于分析的LC条件在下表2中描述，并且用于分析的MS条件在下表3中描述。

在该实施例中，生成包含LC条件、MS方法和相关处理方法(包括保留时间)的文库。可使用例如TargetLynx或Skyline(MacCoss Lab Software，University of Washington)处理所得数据。

开发了快速特异性LC-MS方法，用于采用基于HILIC的色谱分离和正离子模式和负离子模式两者下的MRM MS检测来分析人血浆中的PC、LPC和SM脂质。HILIC方法有利于洗脱离散类型的脂质。所得方法能够在8分钟内以超过4个数量级的线性动态范围测量61种PC、21种LPC和24种SM。该方法的灵敏度容易有利于以正常循环水平从50μL血浆中检测人血浆中的这些脂质。

图6示出了根据本公开的实施方案的表示以正离子模式从标准混合物中HILIC分离PC、SM和LPC的色谱图。如在该色谱图中可见，HILIC方法有利于洗脱离散类型的脂质，其中PC首先洗脱(～1.52分钟)，然后洗脱SM(～1.92分钟)和LPC(～2.15分钟)。

图7示出了SM和PC的结构表示。两种物质均为产生特征性磷酸胆碱头基片段(m/z184)的含胆碱磷脂。PC、SM和LPC脂质类型的产物离子扫描示出正离子模式下的特征性184m/z胆碱头基片段，如果在MRM转变中采用，则这将导致明确的脂质分配。为了解决这个问题，开发了高度特异性MRM转变，其含有106种PC(正离子)和278种PC(负离子)的脂肪酰链片段，从而改善了鉴定和特异性。

图8是示出根据本公开的实施方案的血浆中内源性SM和LPC的类型分离，从而使可能的同量异位效应最小化的色谱图。虽然LPC和SM物质的MRM转变采用胆碱头基片段，但基于类型的色谱分离减少了同分异构和同量异位干扰。另外，同量异位效应进一步最小化，因为LPC和SM前体分别具有440-608Da和648-776Da的质量范围，因此不重叠。

上述文库的开发允许简单下载表示PC、LPC和SM的MRM转变和色谱条件，从而消除LC-MS方法的手动输入并减少可能的转录误差。

在该示例性实施方案中，使用在提取之前掺杂有已知浓度的SIL标准品的血浆校准曲线来实现定量，从而提供用于定量相同类型内的内源性脂质的替代标准品。通过使用在与内源性脂质相同的条件下制备和分析的替代标准品，可显著降低大型研究的成本。SIL标准品LPC(18:1)(d7)和SM(18:1)(d9)的示例性校准曲线示于图9A-9B中，其可用于定量内源性LPC和SM。表示正离子和负离子中的PC的附加示例性曲线也在图9C-9D中提供。常规地实现0.95或更大的典型R

在该实施例中，该方法在4个数量级内显示为线性的并且具有足够的灵敏度，以允许分析人血浆中全身水平的脂质。采用基于HILIC的色谱法允许脂质根据类型洗脱，从而减少潜在的同分异构/同量异位干扰以及定量所需的稳定标记同位素的数量(即，成本降低)。

从该实施例测量的内源性LPC脂质的浓度在表4中示出。CV<30％的读数被认为是可接受的。包含反向计算的掺入SIL结果以示出准确性。掺入血浆中的LPC(18:1)(d7)的实际浓度为1250ng/mL。

从该实施例测量的内源性PC脂质的浓度示于表5中。CV<30％的读数被认为是可接受的。包含反向计算的掺入SIL结果以示出准确性。掺入血浆中的PC(15:0-18:1)(d7)的实际浓度为8000ng/mL。

从该实施例测量的内源性SM脂质的浓度在表6中示出。CV<30％的读数被认为是可接受的。包含反向计算的掺入SIL结果以示出准确性。掺入血浆中的SM(18:1)(d9)的实际浓度为1500ng/mL。

实施例2包括示例性基于HILIC的LC-MS/MS高通量靶向神经酰胺和己糖基神经酰胺筛选。该实施例示出了血浆和血清中24种神经酰胺、23种己糖基神经酰胺和鞘氨醇的快速定量。如上所述，用于在MS分析之前按类型分离脂质的基于HILIC的方法可减少鉴定歧义。按类型分离脂质物质的附加有益效果导致定量所需的SIL标准品较少，从而节约了成本。该实施例描述了使用基于HILIC的方法来执行Cer、HexCer和SPH的靶向筛选。

汇集的健康对照血浆掺杂9种浓度水平的SIL(SPLASH LIPIDOMIX

采用简单的样品制备程序，其使用利用异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀并温育2小时。将提取的样品离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中用于LC-MS分析。用于分析的LC条件在下表7中描述，并且用于分析的MS条件在下表8中描述。

在该实施例中，生成包含LC条件、MS方法和相关处理方法(包括保留时间)的文库。所得数据利用TargetLynx或Skyline(MacCoss Lab Software，University ofWashington)。

图10示出了鞘脂(SL)、神经酰胺(Cer)、鞘氨醇1-磷酸酯(S1P)、鞘磷脂(SM)和己糖基神经酰胺(HexCer)的结构。插入物示出了长链碱基(LCB)离子m/z 264(由SL生成的特征性产物离子)。

图11A示出了表示神经酰胺和鞘氨醇的重叠色谱图。图11B示出了表示己糖基神经酰胺物质(正离子模式)的重叠色谱图。图12为示出根据本公开的实施方案的与Cer、HexCer和SPH峰相比的TG和SM保留时间的色谱图。

该实施例实验采用正离子模式的MRM来鉴定和定量人血浆中包含的Cer和HexCer物质，同时分析若干其它脂质类型，诸如TG、PC和SM。Cer、HexCer和SPH脂质在基于HILIC的条件下以离散带形式(～0.9-1.0分钟)洗脱。分析总共24种Cer、23种HexCer和SPH。该方法的灵敏度容易有利于以正常循环水平从50μL血浆中检测人血浆中的这些脂质，同时展示出超过4个数量级的线性动态范围。

此处讨论的Cer和HexCer脂质转变使用脂质前体离子和特征性长链碱基(LCB)产物离子(m/z 264)。虽然Cer和HexCer物质的峰在这些色谱条件下共洗脱，但是同量异位效应的风险是最小的，因为Cer和HexCer前体分别具有482.5-610.5Da和644.5-772.6Da的质量范围。含胆碱SM产生特征性184m/z头基片段并在～1.92分钟时洗脱，使得它们能够与其他SL一起分析，并具有同分异构/同量异位干扰的最小风险。内源性SM的定量在包括其他含胆碱脂质(LPC和PC)的单独申请注释[8]中讨论。

图13A示出了SM(18:1)(d9)(3-1500ng/mL)的校准曲线。图13B示出了TG(15:0/18:1/15:0)(d7)(5.5-2750ng/mL)的校准曲线。>0.95的典型R

上述文库的开发允许简单下载表示Cer和HexCer脂质物质的MRM转变和色谱条件，从而消除LC-MS方法的手动输入并减少可能的转录误差。

表9示出

表10示出

在该示例性实验中，展示出用于与其他脂质类型结合对血浆和血清的SL进行分析的快速定量方法。该方法允许在8分钟内分析24种神经酰胺、23种己糖基神经酰胺和SPH。该方法在4个数量级内显示为线性的并且具有足够的灵敏度，以允许分析人血浆中全身水平的脂质。

实施例3包括用于分析血浆中极性和非极性脂质类型的示例性基于HILIC的LC-MS/MS高通量(低至8分钟或更少)靶向脂质定量平台。该实施例示出了来自血浆样品的504种脂质物质的快速定量(250种正离子模式进样和254种负离子模式进样)。

在该实施例中，汇集的健康对照血浆掺杂有9种浓度水平的SIL标准品(

采用简单的样品制备程序，其使用利用异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀并温育2小时。将提取的样品离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中进行LC/MS分析。用于分析的LC条件在下表11中描述，并且用于分析的MS条件在下表12中描述。

在该实施例中，生成包含LC条件、MS方法和相关处理方法(包括保留时间)的文库。所得数据利用TargetLynx或Skyline(MacCoss Lab Software，University ofWashington)处理。

Lipidomics涉及大规模样品集的分析，因此期望高通量方法。开发了快速且全面的LC-MS方法，用于采用基于HILIC的脂质类型分离和正离子模式和负离子模式两者下的MRM MS定量来分析人血浆中的极性和非极性脂质类型。表13示出了掺杂到NIST 1950血浆提取物中的SIL标准品的列表以及正离子和负离子模式下的校准参数。测量的不同脂质类型与它们的对应MRM保留时间窗口、所用的采集模式和MRM转变总数在上表1中示出。可从16种极性和非极性脂质类型测量总共2041次脂质物质MRM转变，其中547次处于正离子模式，1494次处于负离子模式。代表不同脂质类型的SIL脂质标准品的混合物用于展示出脂质类型的分离。

图14是表示根据本公开的实施方案的脂质标准品的混合物的示例性HILIC分离的正离子模式色谱图。如图14所示，脂质主要根据其极性在8分钟内分离成脂质类型，这适用于大样品集的脂质分析。保留时间随着脂质极性的增加而增加。

上述文库的开发允许简单下载具有总共2041次MRM转变的代表不同脂质类型的所有MRM转变和色谱条件，从而消除LC-MS方法的手动输入并降低方法开发培训成本和可能的转录误差。

对于每个脂质类型，将开发的方法用于对脂质物质的定量分析，其使用SIL标准品。在提取之前将已知浓度的SIL标准品添加到血浆样品中。图15A-15B示出了根据本公开的实施方案的以正离子模式进行的HILIC脂质类型分离的代表性色谱图。图15B的色谱图示出了不同脂质类型的缩放。图16-19示出了根据本公开的实施方案的以负离子模式进行的HILIC脂质类型分离的代表性色谱图。从NIST血浆中鉴定并定量总共504种脂质物质(250种正离子模式进样和254种负离子模式进样)。该平台还可用于更深入地靶向特定类型的感兴趣脂质。表1示出了使用正离子模式和负离子模式掺入NIST血浆提取物中的SIL标准品的校准参数。

图20示出了处于正离子模式的15:0/18:1(d7)PC的代表性校准曲线，然而图21示出了根据本公开实施方案的来自血浆样品的处于负离子模式的15:0/18:1(d7)PG的代表性校准曲线。针对每个SIL标准品构建校准曲线，并且该校准曲线在测试的校准范围内是线性的，其中平均相关系数大于0.988(正离子模式)和0.964(负离子模式)。具有0.993的相关系数的处于正离子模式的SIL标准品15:0/18:1(d7)PC和具有0.985相关系数的处于负离子模式的15:0/18:1(d7)PG的代表性校准曲线分别示于图20和图21中。

在该示例性实施方案中，开发了高通量定量和全面的HILIC方法以用于分析血浆中的极性和非极性脂质类型。该方法使得16种极性和非极性脂质类型能够在8分钟内快速分离，其适用于大样品集的脂质分析。该方法在4个数量级内显示为线性的并且具有足够的灵敏度，以允许分析人血浆中全身水平的脂质。

实施例4包括示例性基于HILIC的LC-MS/MS高通量靶向游离脂肪酸(FFA)筛选。该实施例示出了血浆和血清中24种FFA的快速定量。如上所述，用于在MS分析之前按类型分离脂质的基于HILIC的方法可减少鉴定歧义。该实施例描述了使用基于HILIC的方法来执行FFA的靶向筛选，而不需要复杂的样品制备和长色谱分离。

图22示出了不同直链脂肪酸的结构和命名。在本实施例实验中，用9种浓度水平的SIL(SPLASH LIPIDOMIX

采用简单的样品制备程序，其使用利用异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀并温育2小时。将提取的样品离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中用于LC-MS分析。

用于分析的LC条件在下表14中描述，并且用于分析的MS条件在下表15中描述。

在该实施例中，生成包含LC条件、MS方法和相关处理方法(包括保留时间)的文库。所得数据利用TargetLynx或Skyline(MacCoss Lab Software，University ofWashington)处理。

图23示出了根据本公开的实施方案的表示血浆中内源性FFA脂质的HILIC分离的重叠色谱图。FFA的测量通常使用GC-MS进行。在分析之前，通常使用固相或液-液提取技术对样品进行分馏，然后利用衍生剂进行水解以形成脂肪酸甲酯(FAME)。该方案是耗时的，存在衍生完整复合脂质的风险，并且对于长链FA(>C24)并不总是表现良好，因为这些物质挥发性较低。

另选地，反相(RP)LC-MS也可适用于分析FFA，但这也需要耗时的样品制备以及使用购买和处置昂贵的毒性有机溶剂。反相色谱法根据链长和不饱和度分离脂质。反相分离的双重性质(脂肪酰链中的双键减少保留时间而脂肪酰链长度增加保留时间)可妨碍对真实样品的分析；由于共洗脱，组分的数量通常如此之多以至于难以鉴定。

该实施例方法采用负离子模式下的伪MRM来鉴定和定量人血浆中包含的24种FFA物质，同时由同一进样分析若干其他脂质类型。FFA在基于HILIC的条件下以离散带形式洗脱(～0.5分钟)，如图23可见。该方法的灵敏度容易有利于以正常循环水平从50μL血浆中检测人血浆中的这些脂质，同时展示出超过4个数量级的线性动态范围。

图24示出了根据本公开的实施方案的PG(15:0/18:1)(d7)(16-8000ng/mL)的代表性校准曲线。图25示出了根据本公开的实施方案的PC(15:0/18:1)(d7)(16-8000ng/mL)的代表性校准曲线。表16示出了CV<30％(24种中的17种)的脂质物质的峰面积响应。使用可从SPLASH LIPIDOMIX

基于亲水相互作用色谱(HILIC)的方法避免了与FAME GC-MS相关联的衍生化和复杂样品制备的需要。另外，由于脂质按类型分离，因此与RP LC-MS相关联的共洗脱的风险也被最小化。上述文库的开发允许简单下载表示FFA的MRM转变和色谱条件，从而消除LC-MS方法的手动输入并减少可能的转录误差。

采用样品制备程序，其使用利用预冷异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀。将样品涡旋混合一分钟并置于-20℃下10分钟。将样品再次涡旋混合一分钟并置于4℃下两小时以确保蛋白质完全沉淀。将提取的样品在10,300g下于4℃离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中用于LC-MS/MS分析。对于正电离模式和负电离模式，一式两份分析制备的样品。

用于分析的LC条件在下表17中描述，并且用于分析的MS条件在下表18中描述。

分析来自不同表型的三种生物状态的血浆样品(健康对照、COPD患者和哮喘患者)。在正离子和负离子电喷雾模式下获取靶向LC-MS/MS数据之前，使用利用冷却IPA的简单蛋白质沉淀来制备样品。将样品随机化，并且每个样品获得两个技术平行试样。从包含高度特异性脂肪酰转变和头基片段的基于HILIC的定量方法MRM文库中鉴定大量脂质，以增加鉴定置信度和增加特异性。此类文库的示例可包括LipidQuan

基于HILIC的定量方法MRM文库的功效在图26A-26D和图27A-27C中示出。在该实施例中，磷脂酰胆碱(PC)(其具有来自相同前体物质的两种潜在的鉴定)通过特定的脂肪酰链片段进行区分。在图26A和图26C中，胆碱头基可在约1.75分钟时鉴定。在图26B中，胆碱头基可在约1.74分钟时鉴定，而在图26D中，胆碱头基可在约1.90分钟时鉴定。在图27A中，胆碱头基可在约1.75分钟时鉴定；在图27B中，胆碱头基可在约1.84分钟时鉴定；并且在图27C中，胆碱头基可在约1.91分钟时鉴定。在图26A和图27A中，第二胆碱头基也可在约1.82分钟时鉴定。

采用样品制备程序，其使用利用预冷异丙醇(IPA)(1:5，血浆:IPA)的蛋白质沉淀。将样品涡旋混合一分钟并置于-20℃下10分钟。将样品再次涡旋混合一分钟并置于4℃下两小时以确保蛋白质完全沉淀。将提取的样品在10,300g下于4℃离心10分钟，然后将上清液转移到玻璃小瓶中用于LC-MS/MS分析。该实施例与上文实施例4中所述的实施例之间的差异在于，分析样品的正电离模式和负电离模式两者。如下所示，该实施例在与实施例5中所述的进样体积不同的进样体积下进行。

用于分析的LC条件在下表19中描述，并且用于分析的MS条件在下表20中描述。

在该实施例中，开发了快速且全面的LC-MS/MS方法，用于采用基于HILIC的脂质类型分离和正离子模式和负离子模式两者下的MRM MS定量来分析人血浆中的极性和非极性脂质类型。表21示出了掺杂到NIST 1950血浆提取物中的SIL标准品的列表以及正离子模式和负离子模式下的校准参数。

下表22示出了根据该实例性实施方案的测量的不同脂质类型与它们的对应MRM保留时间窗口、所用的采集模式和MRM转变总数。脂质主要根据其极性在约8分钟内分成脂质类型，从而产生适用于大样品集的脂质分析的定量方法。在该示例性实施方案中，保留时间随着脂质极性的增加而增加。

根据该实施例，基于HILIC的定量方法文件的开发允许简单下载具有总共2,041次MRM转变的代表不同脂质类型的所有MRM转变和色谱条件，从而消除LC-MS方法的手动输入并降低方法开发培训成本和可能的转录误差。对于每个脂质类型，将开发的方法用于对

甘油磷脂(GPL)通常由两条脂肪酰链和与甘油主链酯化的磷酸酯头基组成，其中头基限定GPL。溶血磷脂是磷脂的衍生物，其中脂肪酰链中的一者或两者已被移除。在生物学上，GPL是所有生物膜的化合物，其充当具有选择性渗透特性的保护性屏障以实现细胞代谢。近年来，由于已知它们涉及多种疾病，因此对测量这些脂质物质的研究关注已增加。PE是第二丰富的甘油磷脂(磷脂酰胆碱之后)，并且占哺乳动物细胞中总GPL含量的约15％-25％。PE代谢中的障碍与慢性疾病(阿尔茨海默病和帕金森病)和感染性疾病(念珠菌病)两者有关。在真核线粒体膜中仅观察到PG的少量组分。然而，PG是心磷脂的生物合成前体，其代表线粒体膜的主要组分并且在维持这些膜的潜能方面是重要的。PI在膜结构中起很小的作用，但在膜结合信号传导过程和囊泡活性中起主要作用。

虽然MS的进步已允许更深度的脂质分析，但已证明明确的鉴定和定量是困难的，因为脂质具有大量的同分异构和同量异位的脂质物质。MS谱通常包含来自各种化合物的多个峰和片段，使得特定分子物质的置信度鉴定和相对定量困难或具有挑战性。因此，在多位点研究期间产生的脂质数据可能不是可交换的，并且所得的数据的生物学解释是有问题的。该实施例描述了使用本文所讨论的基于HILIC的定量方法来执行对LPE、PE、PG和PI的靶向筛选。

用于分析的LC条件在下表23中描述，并且用于分析的MS条件在下表24中描述。

在该实施例中，开发了快速且全面的LC-MS/MS方法，用于采用基于HILIC的色谱分离和MRM MS检测来分析人血浆中的LPE、PE、PG和PI脂质。在该实施例中，PES、PG和PI以负离子模式分析，而LPE脂质以正离子模式分析。HILIC方法有利于洗脱离散类型的脂质，其中PG首先洗脱(～1.21分钟)，然后洗脱PE(～1.62分钟)、LPE(～2.34分钟)和PI(～2.40分钟)。使用该方法，在八分钟内以超过四个数量级的线性动态范围定量地鉴定11种PPE、47种PE、21种PG和33种PI。该方法的灵敏度容易有利于以正常循环水平从50uL血浆中检测人血浆中的这些脂质。

基于HILIC的定量方法文件的开发允许LPE、PE、PG和PI的MRM转变和色谱条件的简单下载和导入，并且消除LC-MS/MS方法的手动输入，从而减少可能的转录误差。所述方法文件的特征在于包含在219种PG、279种PE和90种PI中的脂肪酰链片段的高度特异性MRM转变，从而增强了所述方法的特异性并改善了脂质鉴定。虽然LPE和PE物质共享共同的头基，但是该方法在色谱方面基于类型来分离这些脂质，从而减少潜在的同分异构和同量异位干扰。同量异位效应被进一步最小化，因为分别为398-476Da和686-851Da的LPE前体和PE前体的质量范围不重叠。

在该实施例中，使用在提取前掺有已知浓度的SIL标准品的血浆的校准曲线来实现定量。这些SIL用作相同类型内的内源性脂质定量的替代标准品。通过对于每个内源性脂质类型使用一种替代标准品，而不是对于每种测量的内源性脂质使用SIL标准品，可显著降低大型研究的成本。

表25示出了掺入SIL的反向计算浓度，以及掺入NIST血浆中的SIL的实际浓度，以ng/mL为单位。下表26示出了

表27示出了该示例性实施方案中内源性PE脂质、PI脂质和PG脂质的MRM转变。PE(15:0-18:1)(d7)的校准范围为0.5-250ng/mL；PI(15:0-18:1)(d7)的校准范围为1-500ng/mL；并且PG(15:0-18:1)(d7)的校准范围为3-1500ng/mL。

如该实施例所展示的，使用本文所讨论的基于HILIC的定量方法提供了对LPE脂质、PE脂质、PG脂质和PI脂质进行靶向筛选的优点。

在该实施例中，开发了快速特异性LC-MS/MS方法，用于采用基于HILIC的色谱分离和正离子模式和负离子模式两者下的MRM MS检测来分析人血浆中的PC、LPC和SM脂质。HILIC方法有利于洗脱离散类型的脂质，其中PC首先洗脱(～1.52分钟)，然后洗脱SM(～1.92分钟)和LPC(～2.15分钟)。所得方法能够在八分钟内以超过四个数量级的线性动态范围测量61种PC、21种LPC和24种SM。该方法的灵敏度容易有利于以正常循环水平从50uL血浆中检测人血浆中的这些脂质。这三种脂质类型的产物离子扫描示出正离子模式下的特征性184m/z胆碱头基片段，如果在MRM转变中采用，则这将导致明确的脂质分配。为了改善鉴定和特异性，对于106种PC(正离子)和278种PC(负离子)开发了含有脂肪酰链片段的高度特异性MRM转变。虽然LPC和SM物质的MRM转变采用胆碱头基片段，但基于类型的色谱分离减少了同分异构和同量异位干扰。另外，同量异位效应可进一步最小化，因为LPC和SM前体分别具有440-608Da和648-776Da的质量范围，并且因此不重叠。

用于分析的LC条件在下表28中描述，并且用于分析的MS条件在下表29中描述。

在该示例性实施方案中，表30示出内源性LPC脂质的MRM转变，表31示出PC脂质的MRM转变，并且表32示出SM脂质的MRM转变。LPC(18:1)(d7)的校准范围为2.5-1250ng/mL；PC(15:0-18:1)(d7)的校准范围为16-8000ng/mL；并且SM(18:1)(d7)的校准范围为3-1500ng/mL。

如该实施例所展示的，使用本文所讨论的基于HILIC的定量方法提供了对LPC脂质、PC脂质和SM脂质进行靶向筛选的优点。

在描述示例性实施方案时，为了清楚起见使用特定术语。出于描述的目的，每个特定术语旨在至少包括以相似方式操作以实现相似目的的所有技术和功能等同物。另外，在特定示例性实施方案包括多个系统元件、装置部件或方法步骤的一些情况下，那些元件、部件或步骤可以用单个元件、部件或步骤来代替。同样，单个元件、部件或步骤可以被用于相同目的的多个元件、部件或步骤代替。此外，尽管已经参考示例性实施方案的特定实施方案示出和描述了示例性实施方案，但是本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离本公开的范围的情况下在本发明中在形式和细节上进行各种替换和变更。此外，其他方面、功能和优点也在本公开的范围内。

示例性流程图是为了示意性目的在本文中提供并且是方法的非限制性示例。本领域的普通技术人员将认识到，示例性方法可包括比示例性流程图中所示的步骤更多或更少的步骤，并且示例性流程图中的步骤可能以与示例性流程图中所示的顺序不同的顺序执行。