HLA-G特异性嵌合抗原受体、其核酸、表达质体、细胞、用途及组合物

摘要

本发明公开了一种HLA‑G特异性嵌合抗原受体、其核酸、表达质体、细胞、用途及组合物，HLA‑G特异性嵌合抗原受体、单离的核酸、HLA‑G特异性嵌合抗原受体表达质体、表达HLA‑G特异性嵌合抗原受体细胞、用于治疗癌症的医药组合物以及表达HLA‑G特异性嵌合抗原受体细胞的用途。HLA‑G特异性嵌合抗原受体与人类白细胞抗原G专一性结合。表达HLA‑G特异性嵌合抗原受体细胞是将HLA‑G特异性嵌合抗原受体转导至免疫细胞中而得。用于治疗癌症的医药组合物，包含表达HLA‑G特异性嵌合抗原受体细胞和医药上可接受载剂。借此，表达HLA‑G特异性嵌合抗原受体细胞可用于诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡。

说明书

技术领域

本发明是有关于一种含有抗原或抗体的医药制品，特别是一种嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸、嵌合抗原受体表达质体、表达嵌合抗原受体细胞、治疗癌症的医药组合物以及表达嵌合抗原受体细胞的用途。

背景技术

癌症又名为恶性肿瘤，为细胞不正常增生，且这些增生的细胞可能侵犯身体的其他部分，为由控制细胞分裂增殖机制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不断增加的趋势，癌症是国人十大死因之一，且已连续二十七年为居十大死因的榜首。

常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗、化学治疗及标靶治疗等。肿瘤免疫治疗为上述治疗方法以外的另一种治疗肿瘤的方法，是透过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。

肿瘤免疫治疗主要有三大方向-肿瘤疫苗、细胞治疗和免疫检查点抑制剂，其中嵌合抗原受体免疫细胞技术为近年来发展非常迅速的细胞治疗。公知技术中，嵌合抗原受体免疫细胞是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-δ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的免疫细胞，使其表达嵌合抗原受体，其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。但目前嵌合抗原受体免疫细胞的细胞治疗因缺乏独特的肿瘤相关抗原、免疫细胞归位至肿瘤位址的效率低及无法克服实体性肿瘤的免疫抑制性微环境，使得嵌合抗原受体在实体性肿瘤的功效受到极大限制。

发明内容

本发明的目的是在提供一种HLA-G特异性嵌合抗原受体、单离的核酸、HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体、表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞、用于治疗癌症的医药组合物以及表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞的用途。HLA-G特异性嵌合抗原受体具有优异的专一性结合肿瘤细胞能力。核酸编码HLA-G特异性嵌合抗原受体。而HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体包含核酸。表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞包含HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体，其表现HLA-G特异性嵌合抗原受体，可以专一性的靶向肿瘤细胞，避免脱靶效应，进而有效地毒杀肿瘤细胞，是以可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。而用于治疗癌症的医药组合物包含表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。

依据本发明的一目的的一实施方式是提供一种HLA-G特异性嵌合抗原受体，包含抗原辨识域、跨膜域、IL2受体β链信息传递域和CD3ζ信息传递域。前述抗原辨识域包含对人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)具特异性的单株抗体片段，且抗原辨识域的胺基酸序列如序列辨识编号1所示。前述跨膜域的胺基酸序列如序列辨识编号2所示。前述IL2受体β链信息传递域的胺基酸序列如序列辨识编号3所示。前述CD3ζ信息传递域的胺基酸序列如序列辨识编号4所示。

依据前述的HLA-G特异性嵌合抗原受体，可还包含如序列辨识编号5所示的信号肽链，其是连接于抗原辨识域的N端。

依据前述的HLA-G特异性嵌合抗原受体，可还包含CD8铰链区域，其中前述CD8铰链区域连接抗原辨识域和跨膜域。

本发明的一目的的另一实施方式是提供一种单离的核酸，其是编码如前段的HLA-G特异性嵌合抗原受体。核酸包含依序排列的如序列辨识编号12所示的编码抗原辨识域片段、如序列辨识编号13所示的编码跨膜域片段、如序列辨识编号14所示的编码IL2受体β链信息传递域片段以及如序列辨识编号15所示的编码CD3ζ信息传递域片段。

依据前述的单离的核酸，可还包含如序列辨识编号16所示的编码信号肽链片段，其是连接于编码抗原辨识域片段的5’端。

依据前述的单离的核酸，可还包含编码CD8铰链区域序列，前述编码CD8铰链区域序列连接编码抗原辨识域片段及编码跨膜域片段。

本发明的一目的的再一实施方式是提供一种HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体，嵌合抗原受体表达质体包含依序排列的如序列辨识编号18所示的起动子以及如前段的核酸。

本发明的一目的的又一实施方式是提供一种表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，包含免疫细胞和如前段的HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体。

依据前述的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，其中免疫细胞可为T细胞或自然杀手细胞。较佳地，自然杀手细胞可为NK-92细胞株或初代自然杀手细胞。

本发明的一目的的又一实施方式是提供一种用于治疗癌症的医药组合物，包含如前段的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，以及医药上可接受载剂。

依据前述的用于治疗癌症的医药组合物，可还包含化疗药物。较佳地，化疗药物可为阿霉素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他滨(gemcitabine)或卡铂(carboplatin)。

本发明的另一目的的一实施方式是提供一种如前段的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞的用途，其是用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。

依据前述的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞的用途，肿瘤细胞可为乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞。

上述发明内容旨在提供本发明的简化摘要，以使阅读者对本发明具备基本的理解。此发明内容并非本发明的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，参照并结合附图说明如下：

图1绘示本发明的抗原辨识域的蛋白质结构示意图；

图2绘示本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体的构筑示意图；

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G和图3H为本发明的实施例1的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图；

图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G和图4H为本发明的实施例2的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图；以及

图5为分析肿瘤细胞接受化学治疗后HLA-G表现量的流式细胞术分析结果统计图。

具体实施方式

本说明书公开内容提出一种HLA-G特异性嵌合抗原受体、编码所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体、包含所述HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞、其用途以及包含表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞的用于治疗癌症的医药组合物。说明书中以肿瘤细胞的细胞试验，证明本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体具有优异的专一性结合肿瘤细胞能力，特别是与肿瘤细胞的细胞膜上所表现的人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)专一性结合，因而可使表现本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞专一性的靶向肿瘤细胞，避免脱靶效应，进而有效地毒杀肿瘤细胞，是以可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。而所述本发明的用于治疗癌症的医药组合物，包含本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，并可进一步的包含化疗药物，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。

本说明书中所述的“人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)”是由HLA-G基因所编码，为非典型第一类主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex,MHC)，重链大约45kDa。HLA-G在胎儿来源的胎盘细胞上表达，在免疫应答的负调节中十分活跃，其主要作用在于抑制细胞毒性免疫细胞功能。

兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域的技术人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。

[试验例]

一、本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体、单离的核酸以及HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体

本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体，包含如序列辨识编号1所示的抗原辨识域、如序列辨识编号2所示的跨膜域、如序列辨识编号3所示的IL2受体β链信息传递域和如序列辨识编号4所示的CD3ζ信息传递域。抗原辨识域包含对人类白细胞抗原G(human leukocyteantigen G,HLA-G)具特异性的单株抗体片段。较佳地，其于抗原辨识域的N端可还连接如序列辨识编号5所示的信号肽链，以及还包含如序列辨识编号11所示的CD8铰链区域连接所述抗原辨识域和跨膜域。详细地说，序列辨识编号1所示的抗原辨识域中包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列。其中重链免疫球蛋白可变域序列为如序列辨识编号6所示的CDRH1、如序列辨识编号7所示的CDRH2以及如序列辨识编号8所示的CDRH3。轻链免疫球蛋白可变域序列为如序列辨识编号9所示的CDRL1、序列为RMS的CDRL2以及如序列辨识编号10所示的CDRL3。请参照图1，绘示本发明的抗原辨识域的蛋白质结构示意图，其中洒点的环状区域表示本发明的抗原辨识域中的可变域。

本发明的单离的核酸是编码本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体。所述核酸包含依序排列的如序列辨识编号12所示的编码抗原辨识域片段、如序列辨识编号13所示的编码跨膜域片段、如序列辨识编号14所示的编码IL2受体β链信息传递域片段以及如序列辨识编号15所示的编码CD3ζ信息传递域片段。较佳地，其于编码抗原辨识域片段的5’端可还连接如序列辨识编号16所示的编码信号肽链片段，以及可还包含如序列辨识编号17所示的编码CD8铰链区域序列连接所述编码抗原辨识域片段及所述编码跨膜域片段。如序列辨识编号12所示的编码抗原辨识域片段是编码如序列辨识编号1所示的抗原辨识域，序列辨识编号13所示的编码跨膜域片段是编码如序列辨识编号2所示的跨膜域，序列辨识编号14所示的编码IL2受体β链信息传递域片段是编码如序列辨识编号3所示的IL2受体β链信息传递域，序列辨识编号15所示的编码CD3ζ信息传递域片段是编码如序列辨识编号4所示的CD3ζ信息传递域，序列辨识编号16所示的编码信号肽链片段是编码如序列辨识编号5所示的信号肽链，序列辨识编号17所示的编码CD8铰链区域是编码如序列辨识编号11所示的CD8铰链区域。

请参照图2，绘示本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体的构筑示意图。详细地说，在本试验例中所示的一实施例，HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体为Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z质体，其内插子(insert)片段包含依序排列的起动子、编码抗原辨识域片段、编码跨膜域片段、编码IL2受体β链信息传递域片段以及编码CD3ζ信息传递域片段。起动子为如序列辨识编号18所示的EF-1alpha起动子，编码抗原辨识域片段的序列如如序列辨识编号12所示，编码跨膜域片段的序列如序列辨识编号13所示，编码IL2受体β链信息传递域片段的序列如序列辨识编号14所示，编码CD3ζ信息传递域片段的序列如序列辨识编号15所示。此外，内插子上还包含如序列辨识编号16所示的编码信号肽链片段和序列辨识编号17所示的编码CD8铰链区域序列。编码信号肽链片段连接于编码抗原辨识域片段的5’端，编码CD8铰链区域序列连接所述编码抗原辨识域片段及编码跨膜域片段。再将内插子片段构筑于Creative Biolabs载体(Creative Biolabs,NY,USA)上，以得到Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z质体。所使用的载体为慢病毒(lentivirus)载体系统，因此可将构筑完成的HLA-G特异性嵌合抗原受体表达质体转染至表现细胞中生产慢病毒，后续可利用慢病毒将HLA-G特异性嵌合抗原受体转导至免疫细胞中。

二、本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞、其用途以及用于治疗癌症的医药组合物

本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞是将本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体利用慢病毒转导至免疫细胞中而得到。较佳地，所述免疫细胞可为T细胞或自然杀手细胞。更佳地，所述自然杀手细胞可为NK-92细胞株或初代自然杀手细胞。详细地说，将构筑完成的Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z质体，先利用lipofectamine 3000(Invitrogen)转染至293T细胞株中以制备带有本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体的慢病毒，再将含有制备完成的慢病毒的上清液和8μg/ml的聚凝胺(polybrene,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培养初代T细胞3天，以将本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体转导至初代T细胞中。以及将含有制备完成的慢病毒的上清液和50μg/ml的鱼精蛋白(Protamine sulfate,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培养初代自然杀手细胞7天，以将本发明的嵌合抗原受体转导至初代自然杀手细胞或NK-92细胞株中，可得本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞。所得到的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞具有诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的效果，是以可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。较佳地，肿瘤细胞可为乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞。

本发明的用于治疗癌症的医药组合物包含本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞以及医药上可接受载剂。较佳地，所述用于治疗癌症的医药组合物可还包含化疗药物。更佳地，所述化疗药物可为阿霉素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他滨(gemcitabine)或卡铂(carboplatin)。

以下的试验例将以数据证明本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞以及包含本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞的用于治疗癌症的医药组合物对于多种哺乳类动物的肿瘤细胞皆具有良好的诱导其死亡的效果。试验上所使用的肿瘤细胞分别为人类乳癌细胞株MDA-MB-231、人类恶性脑瘤细胞株DBTRG-05MG(以下简称DBTRG)、人类胰脏癌细胞株AsPC1以及人类卵巢癌细胞株SKOV3。所使用的肿瘤细胞株皆购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。人类乳癌细胞株MDA-MB-231细胞株为三阴性乳腺癌细胞株，即荷尔蒙受体(ER、PR)和HER-2受体为阴性，其培养于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养液中。人类恶性脑瘤细胞株DBTRG培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。人类胰脏癌细胞株AsPC1培养于含10％胎牛血清的RPMI培养液中。人类卵巢癌细胞株SKOV3培养于含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养液中。

2.1.实施例1

在本试验例中，将本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体转导至初代自然杀手细胞可得到本发明的实施例1的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞(以下简称为实施例1)。并进一步测试实施例1以及包含实施例1的用于治疗癌症的医药组合物诱导乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞和卵巢癌细胞死亡的效果。

先分别将人类乳癌细胞株MDA-MB-231、人类恶性脑瘤细胞株DBTRG、人类胰脏癌细胞株AsPC1以及人类卵巢癌细胞株SKOV3以1×10

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G和图3H，为实施例1诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图。其中图3A为实施例1诱导人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡的分析结果图，图3B为图3A三重复试验后的统计图。图3C为实施例1诱导人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡的分析结果图，图3D为图3C三重复试验后的统计图。图3E为实施例1诱导人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡的分析结果图，图3F为图3E三重复试验后的统计图。图3G为实施例1诱导人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡的分析结果图，图3H为图3G三重复试验后的统计图。图3B、图3D、图3F和图3H中的P表示亲代初代自然杀手细胞。

由图3A和图3B的结果显示，在未处理的控制组，仅见约5％的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡，而处理阿霉素的试验组1、处理亲代初代自然杀手细胞的试验组2和处理亲代初代自然杀手细胞和阿霉素的试验组3，虽人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理实施例1的试验组4其诱导的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率约可达70％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.001)。此外，处理实施例1和阿霉素的试验组5其诱导的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率更可高达超过80％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.001)。

由图3C和图3D的结果显示，在未处理的控制组，仅见不到5％的人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡，而处理替莫唑胺的试验组1、处理亲代初代自然杀手细胞的试验组2和处理亲代初代自然杀手细胞和替莫唑胺的试验组3，虽人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理实施例1的试验组4其诱导的人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡率可超过60％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.001)。此外，处理实施例1和替莫唑胺的试验组5所诱导人类恶性脑瘤细胞株DBTRG的死亡率更可接近90％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.01)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.001)。

由图3E和图3F的结果显示，在未处理的控制组，仅见不到5％的人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡，而处理吉西他滨的试验组1、处理亲代初代自然杀手细胞的试验组2和处理亲代初代自然杀手细胞和吉西他滨的试验组3，虽人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理实施例1的试验组4所诱导的人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡率约为50％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.01)。此外，处理实施例1和吉西他滨的试验组5其诱导的人类胰脏癌细胞株AsPC1的死亡率更达约70％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.001)。

由图3G和图3H的结果显示，在未处理的控制组，仅见不到5％的人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡，而处理卡铂的试验组1和处理亲代初代自然杀手细胞的试验组2，虽人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。处理亲代初代自然杀手细胞和卡铂的试验组3，人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡率可达接近40％，但仍不具有统计意义的差异。而处理实施例1的试验组4所诱导的人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡率约为50％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.05)。此外，处理实施例1和卡铂的试验组5所诱导的人类卵巢癌细胞株SKOV3的死亡率更可达接近70％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.01)。

由图3A至图3H的结果显示，处理实施例1对于乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞皆具有优异的毒杀作用，是以本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。此外，同时处理实施例1和化疗药物，对于乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞的毒杀作用更为显著，显示本发明的用于治疗癌症的医药组合物，较佳地可包含化疗药物，可以有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。

2.2.实施例2

在本试验例中，将本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体转导至初代T细胞可得到本发明的实施例2的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞(以下简称为实施例2)。并进一步测试实施例2以及包含实施例2的用于治疗癌症的医药组合物诱导乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞和卵巢癌细胞死亡的效果。

先分别将人类乳癌细胞株MDA-MB-231、人类恶性脑瘤细胞株DBTRG、人类胰脏癌细胞株AsPC1以及人类卵巢癌细胞株SKOV3以1×10

请参照图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G和图4H，为实施例2诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图。其中图4A为实施例2诱导人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡的分析结果图，图4B为图4A三重复试验后的统计图。图4C为实施例2诱导人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡的分析结果图，图4D为图4C三重复试验后的统计图。图4E为实施例2诱导人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡的分析结果图，图4F为图4E三重复试验后的统计图。图4G为实施例2诱导人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡的分析结果图，图4H为图4G的统计图。图4B、图4D、图4F和图4H中的P表示亲代初代T细胞。

由图4A和图4B的结果显示，在未处理的控制组，仅见约10％的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡，而处理阿霉素的试验组1、处理亲代初代T细胞的试验组2和处理亲代初代T细胞和阿霉素的试验组3，虽人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理实施例2的试验组4所诱导的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率接近70％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.01)。此外，处理实施例2和阿霉素的试验组5所诱导的人类乳癌细胞株MDA-MB-231死亡率更可达接近80％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.01)。

由图4C和图4D的结果显示，在未处理的控制组，仅见不到10％的人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡，而处理替莫唑胺的试验组1和处理亲代初代T细胞的试验组2，虽人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理亲代初代T细胞和替莫唑胺的试验组3，人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡率可提高至接近40％，但仍不具有统计意义的差异。而处理实施例2的试验组4所诱导的人类恶性脑瘤细胞株DBTRG死亡率可超过70％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.001)。此外，处理实施例2和替莫唑胺的试验组5所诱导的人类恶性脑瘤细胞株DBTRG的死亡率更可接近80％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.001)。

由图4E和图4F的结果显示，在未处理的控制组，仅约5％的人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡，而处理吉西他滨的试验组1和处理亲代初代T细胞的试验组2，虽人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理亲代初代T细胞和吉西他滨的试验组3，人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡率可提高至接近40％。而处理实施例2的试验组4所诱导的人类胰脏癌细胞株AsPC1死亡率可提高至超过30％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.01)。此外，处理实施例2和吉西他滨的试验组5所诱导的人类胰脏癌细胞株AsPC1的死亡率更超过50％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.01)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.05)。

由图4G和图4H的结果显示，在未处理的控制组，仅见不到5％的人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡，而处理卡铂的试验组1、处理亲代初代T细胞的试验组2和处理亲代初代T细胞和卡铂的试验组3，虽人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有统计意义的差异。而处理实施例2的试验组4所诱导的人类卵巢癌细胞株SKOV3死亡率可达接近80％，与试验组2相比具有统计意义的差异(p<0.001)。此外，处理实施例2和卡铂的试验组5所诱导的人类卵巢癌细胞株SKOV3的死亡率更可达超过80％，与试验组4相比具有统计意义的差异(p<0.05)，与试验组3相比亦具有统计意义的差异(p<0.001)。

由图4A至图4H的结果显示，处理实施例2对于乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞皆具有优异的毒杀作用，是以本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。此外，同时处理实施例2和化疗药物，对于乳癌细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、胰脏癌细胞或卵巢癌细胞的毒杀作用更为显著，显示本发明的用于治疗癌症的医药组合物，较佳地可包含化疗药物，可以有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。

2.3.处理化疗药物会增加肿瘤细胞细胞膜上人类白细胞抗原G的表现

本试验例进一步的探讨同时处理本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞和化疗药物的组别具有更优异的毒杀肿瘤细胞效果的原因。

先分别将人类乳癌细胞株MDA-MB-231、人类恶性脑瘤细胞株DBTRG、人类胰脏癌细胞株AsPC1以及人类卵巢癌细胞株SKOV3以2×10

请参照图5，为分析肿瘤细胞接受化学治疗后HLA-G表现量的流式细胞术分析结果统计图。图5中同一肿瘤细胞的控制组和化学治疗组相比，处理阿霉素可增加人类乳癌细胞株MDA-MB-231细胞膜上HLA-G的表现(p<0.001)，处理替莫唑胺可增加人类恶性脑瘤细胞株DBTRG细胞膜上HLA-G的表现(p<0.001)，处理吉西他滨可增加人类胰脏癌细胞株AsPC1细胞膜上HLA-G的表现(p<0.001)，处理卡铂可增加人类卵巢癌细胞株SKOV3细胞膜上HLA-G的表现(p<0.001)。由图5的结果显示，处理化疗药物可增加肿瘤细胞细胞膜上HLA-G的表现，而本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞所表达的HLA-G特异性嵌合抗原受体可专一性的与HLA-G特异性结合，是以处理过化疗药物后再处理本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，或同时处理本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞和化疗药物，可具有更优异的毒杀肿瘤细胞效果。

综上所述，本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体具有优异的专一性结合肿瘤细胞能力，特别是与肿瘤细胞的细胞膜上所表现的HLA-G专一性结合，因而可使表现本发明的HLA-G特异性嵌合抗原受体的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞专一性的靶向肿瘤细胞，避免脱靶效应，进而有效地毒杀肿瘤细胞，是以可用以制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。本发明的用于治疗癌症的医药组合物，包含本发明的表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。而进一步包含化疗药物的用于治疗癌症的医药组合物，其可进一步诱导肿瘤细胞的细胞膜大量表现HLA-G，因而可增进表达HLA-G特异性嵌合抗原受体细胞对于肿瘤细胞的毒杀作用，是以具有更优异的肿瘤细胞毒杀作用。

然本发明已以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，任何所属领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定的为准。

序列表

<110> 中国医药大学附设医院

<120> HLA-G特异性嵌合抗原受体、其核酸、表达质体、细胞、用途及组合物

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Phe Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Ser Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Gly Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Thr Pro Ser

130 135 140

Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu

165 170 175

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Arg Met Ser Ser

180 185 190

Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 2

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 3

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn

1 5 10 15

Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly

20 25 30

Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe

35 40 45

Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu

50 55 60

Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

85 90

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Arg Gly Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 12

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaggttcagc tgcaagagtc tggcggagga ctggtgcagc ctaagggaag cctgaagctg 60

agctgtgccg ccttcggctt caccttcaac acctacgcca tgcactgggt ccgacaggcc 120

cctggaaaag gccttgaatg ggtcgcccgg atcagaagca agagcaacaa ttacgccacc 180

tactacgccg acagcgtgaa ggacagattc accatcagcc gggacgacag ccagagcatg 240

ctgagcctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccatctacta ctgcgtcaga 300

ggcggctact ggtccttcga tgtttgggga gccggcacca ccgtgacagt ttctagcgga 360

ggcggtggat ctggcggcgg aggaagtggt ggcggaggtt ctgatatcgt gatcacccag 420

accacaccta gcgtgccagt gacacctggc gagagcgtgt ccatcagctg cagaagcagc 480

aagagcctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgtact ggttcctgca gaggcccgga 540

cagtctcctc agctgctgat ctccagaatg agcagcctgg ctagcggcgt gcccgataga 600

ttttctggca gcggctctgg caccgccttc acactgagaa tcagcagagt ggaagccgag 660

gacgtgggcg tgtactactg tatgcagcac ctggaatacc cctacacctt cggcggaggc 720

accaagctgg aaatcaag 738

<210> 13

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 14

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga agtgtaacac cccagacccc 60

tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag acgtccagaa gtggctctct 120

tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg cacctgagat ctcgccacta 180

gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctccccc tgaacactga tgcctacttg 240

tccctccaag aactccaggg tcaggaccca actcacttgg tg 282

<210> 15

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cctatcgcca ccaggccctg cccccttaa 339

<210> 16

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccc 63

<210> 17

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 18

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60

ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120

gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180

gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240

agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300

ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360

acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420

ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480

attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540

ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600

cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660

aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720

caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780

tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840

gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900

ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960

cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020

ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080

tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140

tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200

gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260

gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320

tttcaggtgt cgtga 1335