一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法

摘要

本发明公开一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法。包括如下步骤：取活性污泥离心，蒸馏水洗涤，再次离心；离心后的湿菌体，加入SDS溶液，水浴处理；处理后的菌液离心，弃上清液，加入次氯酸钠溶液，水浴处理，洗涤沉淀，于烘箱中烘干；菌体中加入氯仿溶液，抽提，获得PHB的氯仿溶液；加热该溶液除去氯仿；加入浓硫酸，水浴加热，冷却至室温并混匀；测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。经本发明的方法分析检测聚β‑羟基丁酸(PHB)，本发明确定的方法，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，极大的减少了对环境的污染，测定结果误差小，所需费用低。

说明书

技术领域

本发明属于生物合成材料领域，具体涉及一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法。

背景技术

聚β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB)具有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染；在物理性质和分子结构方面与聚丙烯很类似，在物理性质和分子结构方面与聚丙烯很类似，如分子量、软化点、结晶度、抗张强度等，只是抗冲击强度和耐溶性能较差，聚β-羟基丁酸与其他无机填充物或化学合成材料相配合，使抗冲击性和耐溶性得到改善，可制备优良的可降解塑料，解决当前危害严重的“白色污染”问题。聚β-羟基丁酸具有生物降解性、生物相容性和光学活性等，并且可利用再生资源进行生物合成，使它在农业、医药、环保、光学等领域具有广阔的应用前景。

污水处理中，微生物的胞内储存物为聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHAs)，它的主要成分是聚-β-羟基丁酸酯(PHB)，聚-β-羟基戊酸酯(PHV)和聚-β-羟基-2-甲基戊酸酯(PH2MV)，如何从中提取出聚-β-羟基丁酸酯(PHB)目前没有方便、准确、可靠的方法。

聚β-羟基丁酸(PHB)的检测方法主要有染色法、重量测定法、气相色谱检测法、

发明内容

本发明目的是为了克服上述“白色污染”问题，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，降低分析检测所需成本，提供一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法，既处理了污泥，又降低了合成费用，得到的产物其性能比单一菌株在纯碳源培养得到的PHB要优越。

为实现本发明目的，本发明采用的技术方案为：一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法，包括如下步骤：

1)取活性污泥离心，蒸馏水洗涤，再次离心；

2)离心后的湿菌体，加入SDS溶液，搅拌均匀，水浴处理；处理后的菌液离心，弃去上清液，

3)加入次氯酸钠溶液，水浴处理，洗涤沉淀，于烘箱中烘干；

4)菌体中加入氯仿溶液，抽提，获得PHB的氯仿溶液，加热该溶液除去氯仿；

5)加入浓度为98％浓硫酸，水浴加热，使PHB溶解，冷却至室温并混匀；

6)测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。

上述的方法，步骤1)中，所述离心，离心机的转速为6000r/min，离心20-25分钟。

上述的方法，步骤2)中，所述水浴，水浴处理的温度是35℃，时间是10min；所述离心，离心机的转速是1500r/min.离心12min。

上述的方法，步骤3)中，加入的次氯酸钠溶液的PH值是9.6。

上述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述水浴，水浴温度为350℃，时间是5min；所述洗涤沉淀，蒸馏水洗涤一次，丙酮洗涤一次。

上述的方法，步骤3)中，所述烘干，烘干温度为75℃。

上述的方法，步骤4)中，所述抽提，抽提的温度是65℃，时间是1h。

上述的方法，步骤4)中，所述加热，加热温度为70-80℃。

上述的方法，步骤5)中，所述水浴，水浴温度为110℃，时间为10min.

上述的方法，步骤6)中，测定含有PHB硫酸溶液的DO值所用波长为235nm。

本发明的有益效果是：克服“白色污染”问题，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，降低分析检测所需成本，提供一种生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法，既处理了污水，又降低了合成费用，得到的产物其性能比单一菌株在纯碳源培养得到的PHB要优越，极大的减少了对环境的污染，测定结果误差小，所需费用低。

附图说明

图1是实施例1中不同时间对湿菌体破壁效果的有影响效果。

图2是实施例1中不同SDS浓度对湿菌体破壁效果的影响效果。

图3是实施例2中PHB标准曲线的绘制。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。

实施例1

一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸的方法，包括如下步骤：

1)取5ml活性污泥，于离心机6000r/min转速下离心25min，蒸馏水洗涤，再次离心，6000r/min转速下离心20min；

2)离心后的湿菌体，加入5ml浓度为10g/L的SDS溶液，35℃水浴处理10min，处理后的菌液以1500r/min转速离心12min，弃去上清液；

3)加入2.5ml PH为9.6、浓度为5g/L的次氯酸钠溶液，350℃水浴处理5min，用蒸馏水洗涤沉淀一次，再用丙酮洗涤沉淀一次，于烘箱中75℃烘干；

4)菌体中加入5ml氯仿溶液，65℃抽提1h，吸取0.5ml含PHB的氯仿溶液于磨口试管中，加热至80℃除去氯仿；

5)加入10ml浓硫酸，盖上玻璃塞，100℃水浴加热10min，冷却至室温并混匀；

6)在235nm波长处测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。

所得到的聚β-羟基丁酸的结构式如下：

实施例2不同处理时间和不同SDS浓度对湿菌体的破壁效果的影响

不同处理时间和不同浓度SDS对湿菌体的破壁效果,如图1、2所示,当处理时间t为10min(C

实施例3 PHB标准曲线的绘制及含量测定

(一)PHB标准曲线的绘制

1)精确称取0.0095gPHB标准品，加入50ml三氯甲烷，充分溶解，此时PHB浓度为100ug/ml；

2)将PHB、三氯甲烷混合溶液分别稀释至0.5ug/ml、1.0ug/ml、1.5ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、3.5ug/ml，分别取1ml置于21支干燥带塞比色管中(每个浓度各三支)；

3)加热除去三氯甲烷，加入10ml浓硫酸，用塞封闭比色管，100℃水浴加热20min后冷却，充分混匀；

4)以浓硫酸为空白对照，采用紫外分光光度计在235nm处OD值为纵坐标，做一条曲线，即为PHB浓度-235nmOD值关系标准曲线，如图3所示。

(二)PHB含量测定

配制抽提液V(三氯甲烷)∶V(无水乙醇)＝2∶1，准确称取0.01g干菌体，加入10ml配制的抽提液，并对其进行60℃抽提1h，浓H