PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用

摘要

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用。所述PRDM9转座子融合的融合位点选自位于chr5:23299411的PRDM9‑type I；位于chr5:23262356的PRDM9‑type II‑1；以及位于chr5:23245181的PRDM9‑type II‑2。相对于传统诊断方法（钡灌肠等），本方法具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用。

背景技术

先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR）是一种儿童肠神经发育异常的出生缺陷疾病，病理机制为肠神经嵴细胞迁移和分化成肠神经元发生障碍，导致肠神经缺乏而发生持续性痉挛，是小儿常见的先天性肠道疾病之一。先天性巨结肠的早期表现为呕吐、腹胀、腹泻等，临床上会造成新生儿死亡或手术后反复肠炎、难治性便秘等并发症，严重影响患儿的生长发育和生活质量。

先天性巨结肠的及时诊治可以减少先天性巨结肠肠炎发生的危险，获得良好的预后。该疾病确诊需要术后病变组织的病理切片。术前诊断方法主要为钡剂灌肠，直肠活检、直肠测压，以判断是否要实施“巨结肠根治术”。目前，钡灌肠为最重要的诊断方法，原理为先天性巨结肠患儿的肠道存在无神经节段的狭窄、近端的扩张，钡灌肠后可见扩张和狭窄段而诊断为巨结肠，但该方法只能诊断出有典型肠道形态改变的患儿，灵敏度需要提高，诊断的准确度80%左右。直肠活检是直接取直肠组织，检测是否有神经节细胞的缺失，准确率高，但取样部位对结果有影响，但该方法为介入有创型，且价格非常高，一般情况下该方法应用于钡灌肠不明显，或不适用的患儿，比如当患儿有坏死性小肠结肠炎（NEC）这种可能的时候，钡灌肠会导致肠穿孔，这种时候不适合用钡灌肠去诊断，才考虑用直肠活检。直肠测压是通过检测肛门内括约肌的松弛缺乏判定肠神经的支配异常，仅为辅助诊断方法，假阳性和假阴性都较多，不能用于单独检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种先天性巨结肠诊断标记物及其应用，为先天性巨结肠的诊断提供了一种新的准确、灵敏的检测途径。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明的第一方面涉及PRDM9转座子融合的定量检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂或试剂盒中的应用；

所述PRDM9转座子融合的融合位点选自：

位于chr5: 23299411的PRDM9-type I；

位于chr5:23262356的PRDM9-type II-1；以及

位于chr5: 23245181的PRDM9-type II-2。

可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂用于执行以下任一种方法：

聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。

可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂为引物。

可选的，如上所述的应用，所述引物包括a~c中的至少一种：

a. 用于检测PRDM9-type I的SEQ ID NO：1~2；

b. 用于检测PRDM9-type II-1的SEQ ID NO：3~4；以及

c. 用于检测PRDM9-type II-2的SEQ ID NO：5~6。

可选的，如上所述的应用，所述引物还包括用于检测PRDM9-type I、PRDM9-typeII-1和PRDM9-type II-2中至少一个所对应的野生型序列的内参引物。

可选的，如上所述的应用，所述内参引物包括d~f中的至少一种：

d. 用于检测PRDM9-type I所对应的野生型序列的SEQ ID NO：7~8；

e. 用于检测PRDM9-type II-1所对应的野生型序列的SEQ ID NO：9~10；以及

f. 用于检测PRDM9-type II-2所对应的野生型序列的SEQ ID NO：11~12。

可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。

可选的，如上所述的应用，所述试剂或试剂盒的受试样品选自血液、组织、细胞样品中至少一种。

本发明的第二方面涉及如上所述应用中所定义的引物。

本发明的第三方面涉及含有如上所述应用中所定义的定量检测剂的试剂盒。

本发明的有益效果为：

先天性巨结肠所用钡灌肠检测、直肠活检方法具有有创性，对希望获得疾病确诊的新生儿患者及其父母均带来一定的身心痛苦。先天性巨结肠患儿表现为呕吐、腹胀、便秘、肠炎等，此类症状的患儿群体很大，其中为先天性巨结肠的儿童占比又很少，上述方法对仪器设备的要求高，价格也昂贵，不适合用于疾病的筛选。而直肠测压方法虽然无创，但其假阳性、假阴性率均较高，并不能有效和准确地对先天性巨结肠疾病进行确诊。

本发明利用DNA诊断技术、率先采用高特异性的PRDM9转座子融合位点进行儿童先天性巨结肠的诊断，所采用的产品和方法，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠诊断或筛选的替代或辅助检测手段。其中，本方法诊断先天性巨结肠时AUC值最高达到0.9666，最佳界限对应灵敏性为84.38%，特异性为95.35%，准确性甚至优于现有诊断方法。而且本方法灵敏性为100%时，特异性为76.74%，适合用于疾病筛选。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中的先天性巨结肠转座子融合遗传标记物的筛选流程示意图；

图2为本发明一个实施例中的先天性巨结肠的转录组测序及差异表达转座子分析结果；

图3为本发明一个实施例中的机器学习明确PRDM9转座子融合与先天性巨结肠段型密切相关；

图4为本发明一个实施例中的双荧光报告基因检测PRDM9转座子融合发生在转录调控区域；

图5为本发明一个实施例中的PRDM9转座子融合的定量PCR检测及ROC曲线评价PRDM9转座子融合对先天性巨结肠的诊断效果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及PRDM9转座子融合的定量检测剂在制备先天性巨结肠诊断试剂或试剂盒中的应用；

所述PRDM9转座子融合的融合位点选自：

位于chr5: 23299411的PRDM9-type I；

位于chr5:23262356的PRDM9-type II-1；以及

位于chr5: 23245181的PRDM9-type II-2。

本发明通过来自于先天性巨结肠患者的组织的有神经节段和无神经节段的全转录组测序，分析差异表达的转座子融合，并用机器学习筛选先天性巨结肠亚型相关的转座子融合，并在先天性巨结肠队列的DNA中用定量PCR技术、ROC曲线分析，对其进行了进一步效果验证。

本发明的研究结果发现，PRDM9转座子融合是先天性巨结肠疾病的有效诊断标记物，其中，位于人第5号染色体的第23299411位和/或第23262356位和第23245181位的3个PRDM9转座子融合（PRDM9-type I，PRDM9-type II-1，PRDM9-type II-2），其未发生融合的序列分别如SEQ ID NO：16~18所示，融合序列为SEQ ID NO：13~15所示，是本发明发现的最有效标记物。

其中，所述PRDM9-type I、PRDM9-type II-1、PRDM9-type II-2可以用于先天性巨结肠。优选的，相对于健康对照组和肠疾病对照，所述PRDM9-type I位点融合水平在先天性巨结肠患者DNA中表现为低水平。优选的，相对于健康对照组和肠疾病对照，所述PRDM9-type II-1、PRDM9-type II-2位点融合水平在先天性巨结肠患者DNA中表现为高水平。

本发明利用DNA诊断技术、率先采用高特异性的PRDM9转座子融合位点进行儿童先天性巨结肠的诊断，所采用的产品和方法，不仅能够使得先天性巨结肠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势，有效地弥补了上述现有技术中的不足，是一种有效的先天性巨结肠诊断或筛选的替代或辅助检测手段。其中，本方法诊断先天性巨结肠时AUC值最高达到0.9666，最佳界限对应灵敏性为84.38%，特异性为95.35%，准确性甚至优于现有诊断方法。而且本方法灵敏性为100%时，特异性为76.74%，适合用于疾病筛选。

本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。

在一些实施方式中，所述定量检测剂用于执行以下任一种方法：

聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。

在一些实施方式中，所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman 探针法、qPCR、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。

在一些实施方式中，所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测。

在一些实施方式中，所述定量检测剂为引物。

在一些实施方式中，所述定量检测剂用于定量检测SEQ ID NO：13~15所示的至少一个片段。

在一些实施方式中，所述引物带有可检测的标记。

如本文所用的术语“标记”指可用于提供可检测的（优选可定量的）效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记，诸如

在一些实施方式中，所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发集团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）。

在一些实施方式中，所述引物包括a~c中的至少一种：

a. 用于检测PRDM9-type I的SEQ ID NO：1~2；

b. 用于检测PRDM9-type II-1的SEQ ID NO：3~4；以及

c. 用于检测PRDM9-type II-2的SEQ ID NO：5~6。

在一些实施方式中，所述引物还包括用于检测PRDM9-type I、PRDM9-type II-1和PRDM9-type II-2中至少一个所对应的野生型序列的内参引物。

在一些实施方式中，所述内参引物用于定量检测SEQ ID NO：16~18所示的至少一个片段。

在一些实施方式中，所述内参引物包括d~f中的至少一种：

d. 用于检测PRDM9-type I所对应的野生型序列的SEQ ID NO：7~8；

e. 用于检测PRDM9-type II-1所对应的野生型序列的SEQ ID NO：9~10；以及

f. 用于检测PRDM9-type II-2所对应的野生型序列的SEQ ID NO：11~12。

在一些实施方式中，所述定量检测剂还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述双链特异性荧光染料定量选自溴化乙锭、SYBR Green、PicoGreen、RiboGreen中的任一种。

在一些实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水（Distilled Water）、去离子水（Deionized Water）或反渗水（Reverse osmosis Water）。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂；进一步地，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。

在一些实施方式中，所述试剂或试剂盒的受试样品选自血液、组织、细胞样品中至少一种。

其中，优选的检测样品为血液，更优选的它们来自外周血。

本发明还涉及如上所定义的引物。

本发明还涉及如上所定义的定量检测剂的试剂盒。

根据本发明的再一方面，还涉及一种先天性巨结肠的诊断方法，其包括使用如上所定义的定量检测剂定量测量检测样品中所述PRDM9转座子融合的融合位点。

通常的，PRDM9转座子融合的融合位点检测是与对照组（例如健康人）比较而得出结论。升高或者降低通常是显著性的，确定受试者和健康群体的初始状态（baseline）相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

本发明试验结果均采用统计学分析，

本发明所述“转座子”是指一段可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。

本发明所述“先天性巨结肠疾病”又称希尔施普龙病，是由于结肠缺乏神经节细胞导致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，近端结肠肥厚、扩张，是小儿常见的先天性肠道疾病之一，其中对于先天性巨结肠疾病而言，按照严重程度递增，临床上可分为短段型，普通型，长段型，全结肠型。短段型病变位于直肠近、中段，距肛管不超过6.5cm；常见型病变位于直肠近端或直肠乙状结肠远端，距肛管约9cm；长段型病变延至乙状结肠或降结肠；全结肠型病变波及全部结肠及回肠末端，距回盲瓣30cm以内。

本发明所述“ROC曲线”是1-特异性（假阳性率）和敏感性（真阳性率）变化的曲线，反应了二分类器的诊断能力。一个好的分类器真阳性率与假阳性率的变化比值是大于1的，远离45度直线。

本发明所述“AUC”是指ROC曲线下面积，介于0.1和1之间，用于评价分类器的好坏，越接近1分类器越好。

实施例1. 先天性巨结肠转座子融合遗传标记物的筛选流程

本发明证明了PRDM9转座子融合可以用于先天性巨结肠的早期诊断和筛查，填补了先天性巨结肠在早期诊断领域的空白，以下是本发明的具体实施例。

本实施例所采用的先天性巨结肠转座子融合遗传标记物的筛选流程如图1所示。具体步骤包括，取先天性巨结肠手术的组织样品，其中选取无神经节段、有神经节段的配对组织样品进行全转录组测序，检测转座子和基因组嵌合序列，查找嵌合的paired-end的reads中有一半是转座子序列的reads，确定这些转座子插入的位置，统计分析各插入位点的嵌合转录在有神经节和无神经节段的总reads数，用总的测序数目去做归一化，用limmaR去做差异表达分析，从而分析显著变化的转座子融合位点。将发现的转座子融合位点分成无神经节段下调（type I）和上调（type II）两种，按照样品中基因携带转座子融合位点的类型，将样品中基因分为三型，包括携带I和II型转座子（gene I，II），及不携带转座子（gene N）。同时收集疾病的表型，这些表型与疾病密切相关，包括疾病的亚型（按照严重程度递增：短段型，普通型，长段型，全结肠型），是否有肠炎，是否有病毒感染，性别和年龄。用机器学习的方法，分析疾病的表型与基因转座子类型的关系，预测可能的驱动基因。筛选得到的转座子融合基因在巨结肠队列中用qPCR验证。

实施例2. 血液DNA和组织样本采集和分组

巨结肠队列：血液DNA样品分为先天性巨结肠患儿组（32例），其它肠病对照组（16例），健康儿童组（27例），年龄介乎3个月到3岁，性别男性3/4为男性，疾病和对照组年龄和性别匹配。所有样品来源于广州市妇女儿童医疗中心，健康儿童组为健康儿童体检后剩余血样。采血方式为抗凝采血，离心分离白细胞提取DNA。结肠组织样品为52个先天性巨结肠患儿手术切除的病变组织，包括有神经节段和无神经节段。

实施例3. 先天性巨结肠全转录组测序及差异表达转座子分析

在先天性巨结肠病人52例，手术的组织样品，取有神经节段、无神经节段的配对组织样品，用RNAeasy kit (Qiagen)提取总RNA，用illumina TruSeq RNA Library Prep Kitv2建库，进行转录组测序，得到每个样品6GB paired-end的测序reads。

测序的fastq文件用Trimmomatic-0.36去接头，去短和低质量序列，用STAR与人的基因组(hg19)比对，用HTSeq-count计算基因表达量，edgeR计算log2(cpm)。基因表达量用voom去归一化，用limma R package计算差异表达基因，用FDR做多重比较。差异表达显著的基因定义为P-value <0.05 且log2FC >1。基因表达值转化成Z-score，用pheatmap画出差异表达基因的热图。差异表达基因的信号通路富集分析用DAVID (version 6.8)，参数设置为EASE值<0.1作为cut-off。

转座子融合位点分析，用同上的方法检测嵌合序列，查找嵌合的paired-end 的reads中有一半是转座子序列的reads，确定这些转座子插入的位置，统计分析各插入位点的嵌合转录在有神经节和无神经节段的总reads数，用总的测序数目去做归一化，用limmaR去做差异表达分析，得到差异的转座子融合位点。这些差异的转座子融合位点分为两类，一类在无神经节段（aganglionic segments）下调（type I）和一类上调（type II）。

图2示出了先天性巨结肠中差异表达的转座子融合位点。在先天性巨结肠中存在转座子融合位点表达的显著变化，这些差异的转座子融合位点分为两类，一类在无神经节段（无神经节段，aganglionic segments）下调（type I）和一类上调（type II）。

实施例4. 机器学习明确PRDM9转座子融合与先天性巨结肠段型密切相关

将发现的无神经节段下调（type I）和上调（type II）的转座子融合位点，关联其最相邻基因，按照样品中最相邻基因携带转座子融合位点的类型，将样品中基因分为三型，包括携带I和II型转座子融合位点（gene I，II），及不携带转座子融合位点（gene N）。同时收集疾病的表型，这些表型与疾病密切相关，包括疾病的亚型（按照严重程度递增：短段型，普通型，长段型，全结肠型），是否有肠炎，是否有病毒感染，性别和年龄。用随即森林方法进行表型的特征选择（feature selection），分析疾病的表型相关的转座子融合基因，预测可能的驱动基因。用机器学习的方法，选择与先天性巨结肠亚型最显著相关的转座子融合基因。

结果见图3，其显示PRDM9转座子融合，与先天性巨结肠段型密切相关（p=0.001），在所有转座子融合的基因中p值排名靠前，重要性（importance）的排名也靠前。具体而言，PRDM9-type I融合在短段型中更多；而PRDM9-type II融合与长段型有关。这些结果提示，PRDM9的转座子融合是一个与先天性巨结肠严重程度密切相关的标志物。

实施例5. 双荧光报告基因检测PRDM9转座子融合发生在转录调控区域

PRDM9的三个转座子融合位置为chr5 23299411，23262356，23245181，三者序列及对照序列见表一。PRDM9融合转座子位于PRDM9上游非编码区，推测可能影响PRDM9的转录。将PRDM9和三个转座子融合的序列（E1+TE，E2+TE，E3+TE）与（E1+TE+C1，E2+TE+C2，E3+TE+C3），两种对照序列（E1+C1，E2+C2，E3+C3）和（C1，C2，C3）分别放入纳米荧光素酶报告基因PNL3.1，用萤火虫荧光素酶做对照，用瞬时转化293T和SKNSH细胞系中，双通道检测报告基因的强度，以此来确定转座子插入对PRDM9对表达的影响。结果显示PRDM9-type I融合会进一步激活PRDM9的增强子表达，PRDM9-type II-1，PRDM9-type II-2融合会抑制PRDM9增强子的表达（见图4）。

实施例6. PRDM9转座子融合的定量PCR

为了验证PRDM9转座子融合对先天性巨结肠的诊断效果，我们收集来源于巨结肠病人（32例）、其它肠疾病对照（包括肛门狭窄和肠狭窄造瘘儿童的血液DNA样品共16例）、健康儿童对照（27例）的血细胞DNA，用定量PCR血液DNA中PRDM9转座子融合的水平。每个融合位点设计2对引物，分别检测野生型（wt）和融合型的DNA水平，其中野生型用来做内参，引物序列如下表二所示。结果显示巨结肠病人的血液DNA中PRDM9-type I转座子融合显著低于健康对照组和肠疾病对照；而PRDM9-type II-2在巨结肠中显著高于健康对照和肠疾病对照，PRDM9-type II-2也高于健康对照，但在肠疾病对照中也高（图5）。

表一：PRDM9转座子融合位点序列

表二：PRDM9转座子融合位点的引物设计

实施例7. ROC曲线评价PRDM9转座子融合对先天性巨结肠的诊断效果

ROC曲线用于评价PRDM9转座子融合对先天性巨结肠的诊断效果（图5）。PRDM9-type I AUC值为0.7885，PRDM9-type II-1为0.8503，PRDM9-type II-2为0.7791。3者联合检测AUC为0.9666，最佳界限对应特异性为95.35%，灵敏性为84.38%。用于疾病筛选时，灵敏性为100%时，特异性为76.74。由此可见，PRDM9转座子融合可以有效诊断和筛选先天性巨结肠，表现出很好的效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市妇女儿童医疗中心

<120> PRDM9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gggtgacaga gtgagactcc a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ctgaacccac ctctgtcctg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gctctaggaa gcaaataaaa agga 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaa 23

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

tattcttttt tttttttttt tttttt 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

aaaattaact gggcgtggtg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gggtgacaga gtgagactcc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ttgaagaggc ttgtccagag a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

attgggtttt atcccggttt 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aaa 23

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

tattcttttt tttttttttt tttttt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

tgcatgtata tactttgaga caaacc 26

<210> 13

<211> 269

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

gggtgacaga gtgagactcc atctcaaaaa tttaaaaaaa aaaaaaaaag cctgtggtta 60

ttttgatggg atagcaagga taacatgaac catgtaaggt ttggcataaa tagttcatag 120

tttacctggt ctgtctgact gtctgagatg tcactgagtc atttgatgac cttgaaatgc 180

taaagcattg gaatgaatgt ctgtagatca ggacagaggt gggttcagag aactatttag 240

gagacatctg ggtgggagtt gtggccaac 269

<210> 14

<211> 190

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

aaccttctca ctgaatagag ctctaggaag caaataaaaa ggaaaaaatg tttttacaac 60

aaaggtaacc aaaaatcaca taattttcgc atgaaaaatc ttttttagtc caggtacagt 120

ggctcatgcc tataattcca gcaccttgag actttttttt tttttttttt tttttttttt 180

tttgagacag 190

<210> 15

<211> 187

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

tattcttttt tttttttttt tttttttttt ttttacagtc tcactctgtc gtccaggctg 60

gagtgcagtg gagtgatctt ggctcactac atttctctct taggttcaag cgattcttct 120

gcctcagcct cctgagtagc tagaattaca ggcatgcacc accacgccca gttaattttt 180

gtatttt 187

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