f-β-hCG蛋白检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开一种f‑β‑hCG蛋白检测试剂盒和检测方法，其中，f‑β‑hCG蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f‑β‑hCG蛋白抗体，其中，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f‑β‑hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f‑β‑hCG蛋白抗体。本发明f‑β‑hCG检测试剂盒提高了检测f‑β‑hCG蛋白的灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及f-β-hCG蛋白检测试剂盒和f-β-hCG蛋白检测方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotropin，hCG)属于糖蛋白激素(37kDa)，由两个通过非共价键结合的亚基α-链(分子量为15kDa)和β-链(分子量为22kDa)组成。β-hCG蛋白是人绒毛膜促性腺激素的特有结构，决定人绒毛膜促性腺激素的生物学和免疫学特性。hCG蛋白由母体滋养层组织产生，在妊娠早期维持黄体功能并刺激孕酮的生成。妊娠妇女的血清中含有的hCG蛋白主要为全段hCG蛋白，不过较小片断的α-亚基和β-亚基也可以以非结合的形式存在于血液中。与全段hCG蛋白相比，游离β-hCG(freeβ-hCG，f-β-hCG)蛋白约占1％。随着hCG蛋白的降解，血液和尿液中也可检测出其它的hCG蛋白变型，例如，缺刻hCG蛋白、缺刻β-hCG蛋白以及β核心蛋白片断。不过，在上述hCG蛋白变型中，只有全段hCG蛋白具有生物活性。

怀孕过程中，f-β-hCG蛋白伴随hCG蛋白一起出现及增长，因此是诊断早孕和孕中期的一项重要检测指标。在妊娠前三个月(第8～14周)，游离β-hCG蛋白、血清妊娠相关血浆蛋白A以及颈半透明度的超声可以对胎儿进行唐氏综合症的鉴别。除此之外，血清中f-β-hCG蛋白的测定不仅能诊断先兆流产、异位妊娠、葡萄胎、子痫前期等疾病，也是治疗后及预后观察的重要检测指标。

目前临床上定量检测f-β-hCG蛋白浓度的方法主要包括放射免疫技术和酶联免疫分析法。上述两种检测方法的检测效率慢、灵敏度低。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种f-β-hCG蛋白检测试剂盒和f-β-hCG蛋白检测方法，旨在提高检测f-β-hCG蛋白的灵敏度。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种f-β-hCG蛋白检测试剂盒，包括：

第一试剂，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，其中，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；以及

第二试剂，所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体。

可选地，所述磁微粒的直径为大于或等于1.0μm，且小于或等于3.0μm。

可选地，所述f-β-hCG蛋白抗体与所述磁微粒的质量比为大于或等于1:100，且小于或等于1:50。

第二方面，本发明还提出一种f-β-hCG蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)依次混合待测样品、第一试剂和第二试剂、依次混合校准品、第一试剂和第二试剂，分别孵育、磁分离和清洗后，加入所述底物发光液；

(2)检测所述底物发光液的相对发光强度，通过检测到的相对发光强度，计算f-β-hCG蛋白的浓度；

其中，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体。

本发明f-β-hCG蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，其中，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体；甲苯磺酰基化的磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合f-β-hCG蛋白抗体的特异性，进而提高了检测的灵敏度。同时，甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下偶联抗体，简化了操作步骤，提高了检测f-β-hCG蛋白的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为实施例二的线性范围检测结果图；

图2为实施例四的两种检测试剂盒的相关性分析结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。

本发明提出一种f-β-hCG蛋白检测试剂盒。

所述f-β-hCG蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，其中，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体。

在本发明试剂盒中，所述磁微粒被甲苯磺酰基化，因而所述磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合f-β-hCG蛋白抗体的特异性。同时，甲苯基基团作为活性基团结合在所述磁微粒的表面上，使得所述磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下偶联抗体，简化了操作步骤。所述f-β-hCG蛋白抗体可以为单克隆抗体，这样所述f-β-hCG蛋白抗体可以结合单一的抗原表位，具有高度的特异性。当然，所述f-β-hCG蛋白抗体也可以为多克隆抗体，不做限定。

所述第二试剂中的所述f-β-hCG蛋白抗体也可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。所述酶可以为碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶的至少一种，不做限定。

本发明f-β-hCG蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，其中，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体；甲苯磺酰基化的磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合f-β-hCG蛋白抗体的特异性，进而提高了检测的灵敏度。同时，甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下偶联抗体，简化了操作步骤，提高了检测f-β-hCG蛋白的效率。

可选地，所述磁微粒的直径为大于或等于1.0μm，且小于或等于3.0μm。当所述磁微粒的直径小于1.0μm时，单个所述磁微粒偶联多个所述f-β-hCG蛋白抗体的数量比较少，会影响到检测效果。当所述磁微粒的直径大于3.0μm时，所述磁微粒在悬浮溶中容易沉降，影响偶联所述f-β-hCG蛋白抗体的效果，也最终会影响到检测效果。

可选地，所述f-β-hCG蛋白抗体与所述磁微粒的质量比为大于或等于1:100，且小于或等于1:50。当所述f-β-hCG蛋白抗体与所述磁微粒的质量比小于1:100时，会导致所述磁微粒的浪费。当所述f-β-hCG蛋白抗体与所述磁微粒的质量比大于1:50时，所述磁微粒不足以结合足量的所述f-β-hCG蛋白抗体，影响到检测结果。

所述第一试剂的制备过程如下：

1)取2mg甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，置于磁力架上，静置2min后磁分离上清，加入1ml的硼酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH＝9.0)清洗3次，再加入200μl的硼酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH＝9.0)重悬；

2)依次加入100μl的硫酸铵溶液(3mol/L)、40μg的f-β-hCG蛋白抗体，37℃下混悬12h～24h；

3)磁分离去上清后，用1ml的硼酸盐溶液(0.1mol/L、pH＝9.0)清洗1次，加入200μl的Tris缓冲液(50mmol/L)反应16～24h；

4、后取出磁分离去上清，加入200μl的Tris缓冲液(50mmol/L)反应2h，反应完成后，磁分离去上清，用200μl的Tris缓冲液(50mmol/L)重悬，得到磁微粒捕获的f-β-hCG蛋白抗体；

5)取磁微粒捕获的f-β-hCG蛋白抗体，用50mM Tris、0.1％(W/V)吐温-20、0.1％(W/V)ProcLin300、0.9％(W/V)NACL、1.2％(W/V)BSA的混合液(pH＝7.4)，将所述磁微粒捕获的f-β-hCG蛋白抗体溶液稀释到0.2mg/ml的浓度，放于2-8℃保存，所述第一试剂制备完成。

在所述第二试剂中，所述f-β-hCG蛋白抗体与所述酶的质量比可以为大于或等于5：10，且小于或等于5：6。当所述f-β-hCG蛋白抗体与所述酶的质量比小于5：10时，所述酶的量过多，不利于后续检测。当所述f-β-hCG蛋白抗体与所述酶的质量比大于5：6时，部分所述f-β-hCG蛋白抗体没有被所述酶标记，会影响到检测结果。

所述第二试剂的制备过程如下：

1)取100μl的f-β-hCG蛋白抗体，加入250μl的PBS缓冲液(0.1mol/L、pH＝7.0)，混匀；

2)加入20～50μl新配制的EDC水溶液(10mg/ml)，活化30分钟，加入200～500μl的碱性磷酸酶溶液(5mg/ml)，混匀；

3)室温避光保存2小时后取出，用30KD的超滤柱除盐纯化，收集剩余溶液，加一半体积的纯甘油，保存于-20℃备用；

4)取碱性磷酸酶标记的f-β-hCG蛋白抗体，加入50mM Tris、0.1％(W/V)吐温-20、0.1％(W/V)ProcLin300、0.9％(W/V)NACL、1.2％(W/V)BSA的混合液(pH＝7.4)，按1:500倍稀释，酶标记的f-β-hCG蛋白抗体的终浓度为0.2～0.6μg/ml，所述第二试剂制备完成。

所述f-β-hCG蛋白检测试剂盒还包括底物发光液、校准品和质控品。所述底物发光液包括碱性磷酸酶催化发光底物和辣根过氧化物酶催化发光底物中的至少一种。例如，所述底物发光液可以为碱性磷酸酶的催化发光底物AMPPD。所述校准品和质控品以纯品f-β-hCG抗原配制而成。在本发明中，采用校准品缓冲液将纯品f-β-hCG抗原配制成浓度为0IU/L、10IU/L、100IU/L、150IU/L，190IU/L的校准品溶液，0.5ml/管分装，4℃保存备用。所述校准品缓冲液BUFF包括0.05mol/L(pH＝7.4)Tris、1％(W/V)B-环糊精、5％(W/V)BSA、0.1％(W/V)吐温-20、0.9％(W/V)NACL和0.05％(W/V)PC300。所述质控品也以纯品f-β-hCG抗原配制而成，配制方法与所述校准品的配制方法类似，在此不再赘述。

本发明还提出一种f-β-hCG蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)依次混合待测样品、第一试剂和第二试剂、依次混合校准品、第一试剂和第二试剂，分别孵育、磁分离和清洗后，加入所述底物发光液；(2)检测所述底物发光液的相对发光强度，通过检测到的相对发光强度，计算f-β-hCG蛋白的浓度；其中，所述第一试剂包括甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体，所述甲苯磺酰基化的磁微粒和f-β-hCG蛋白抗体偶联；所述第二试剂包括酶标记的f-β-hCG蛋白抗体。

f-β-hCG蛋白检测方法的具体步骤如下：

1)采用全自动化学发光仪(深圳天辰医疗科技有限公司，货号：CL-2000)，方法学模式选择双抗体夹心法，取20μl检测样本，依次加入50μl所述第一试剂和100μl所述第二试剂；

2)37℃孵育5min，磁分离去上清，清洗3次；

3)加入300μl底物发光液AMPPD；

4)将反应杯移到光电模块中，采集光电值，仪器转换为浓度模式，显示测试结果。

实施例一、灵敏度检测

采用本发明检测试剂盒和检测方法，对5个f-β-hCG蛋白浓度近似检出限的低值样本进行检测，每份样本检测5次。请参阅表1，本发明的检测结果均大于空白限数值(0.1IU/L)，符合小于空白限数值的数量小于或等于3个的检测标准；且本发明的检测结果均小于0.2IU/L，符合检出限不大于0.2IU/L的检测标准。以上结果说明，本发明检测试剂盒和检测方法具有较高的灵敏度。

表1灵敏度检测结果

实施例二、线性范围测定

采用本发明检测试剂盒和检测方法，分别对f-β-hCG蛋白浓度为0IU/L、40IU/L、80IU/L、120IU/L、160IU/L、200IU/L的样本进行检测。请参阅表2和图1，检测结果表明，当所述f-β-hCG蛋白浓度范围在0-190IU/L内时，本发明对所述f-β-hCG蛋白的检测结果呈线性。具体地，图1中横坐标为样本浓度值(IU/L)，纵坐标为相对发光值(RLU)，线性方程为y＝25340x-432387，R

表2线性范围检测结果

实施例三、准确度检测

采用本发明检测盒和检测方法，对f-β-hCG蛋白浓度分别为9.873IU/L和100.368IU/L的样本进行检测，通过计算检测结果与实际浓度的相对偏差(％)，来检验本发明检测盒和检测方法的检测准确度。本实施例按照检测标准，对两个样本均重复检测3次。请参阅表3，本发明检测试剂盒检测f-β-hCG蛋白浓度为9.873IU/L的样本的均值为10.22IU/L，平均相对偏差为4％；检测f-β-hCG蛋白浓度为100.368IU/L的样本的均值为101.53IU/L，平均相对偏差为1％。两个样本的检测结果均符合相对偏差小于10％的准确度的检测标准，说明本发明检测盒和检测方法的检测准确度较高。

表3准确度检测分析结果

实施例四、方法学比对

本发明接着对罗氏诊断公司的freeβ-hCG试剂盒(注册号：国械注进20142405076)和本发明检测试剂盒的检测结果进行比对，来进一步验证本发明检测试剂盒的检测准确性。

本实施例采用6个样本进行比对检测，6个样本随机排列，每个样本每次均重复测定2次，为了保证样本的稳定性，6个样本全部在2小时内测定完毕，共连续检测11天。两种试剂盒的检测结果如表4所示。进而根据表4中的数据，对两种试剂盒的检测结果进行相关性分析。请参阅图2，图2中横坐标为罗氏诊断公司试剂盒的检测值(IU/L)，纵坐标为本发明试剂盒的检测值(IU/L)，线性相关方程为y＝1.0245x-0.574，R

表4方法学比对检测结果

实施例五、批内精密度分析

随机取本发明检测试剂盒中的一批试剂，检测f-β-hCG蛋白的浓度为10IU/L(±20％)和100IU/L(±20％)的样本，两个样本各平行检测10次，计算变异系数(CV，％)，从而检验本发明检测试剂盒的批内精密度。请参阅表5，本发明检测试剂盒的结果与f-β-hCG蛋白浓度为9.873IU/L的样本的平均变异系数为5.94％，与f-β-hCG蛋白浓度为100.368IU/L的样本的平均变异系数为5.44％。以上结果均符合变异系数＜8％的批内精密度的检测标准，说明本发明检测试剂盒的批内精密度较高。

表5批内精密度检测分析结果

实施例六、批间精密度分析

随机取本发明检测试剂盒的三批试剂，分别检测f-β-hCG底板的浓度为10IU/L(±20％)和100IU/L(±20％)的样本，两个样本各平行检测10次，共检测30次，计算变异系数(CV，％)。请参阅表6，本发明检测试剂盒的三批试剂与f-β-hCG蛋白浓度为9.873IU/L的样本的平均变异系数为7.96％，与f-β-hCG蛋白浓度为100.368IU/L的样本的变异系数为7.46％。以上结果均符合变异系数＜15％的批间精密度的检测标准，说明本发明检测试剂盒的批间精密度较高。

表6批间精密度检测分析结果

实施例七、特异性分析

分别称/量取一定量的f-β-hCG蛋白，加入适量的零浓度校准品或样本稀释液配制浓度为200mIU/mL的促黄体生成素(Luetinizing Hormone，LH)、0.2mIU/mL的促甲状腺激素(Thyroid Stimμlating Hormone，TSH)、200mIU/mL的促卵泡生成素(FoLLicLe-Stimμlating Hormone，FSH)及1000mIU/mL的hCG。使用本发明检测试剂盒，对所述LH、所述TSH、所述FSH和所述hCG的浓度进行检测，来检验该试剂盒的检测特异性。

该试剂盒检测到所述LH的平均浓度为0.49mIU/ml(即0.49ng/ml)，符合检测结果应不高于1.25ng/ml的检测标准；检测到所述TSH的平均浓度为0.54mIU/ml(即0.54ng/ml)，符合检测结果应不高于1.25ng/ml的检测标准；检测到所述FSH的平均浓度为1.02mIU/ml(即1.02ng/ml)，符合检测结果应不高于1.25ng/ml的检测标准；检测到所述hCG的平均浓度为1.33mIU/ml(即1.33ng/ml)，符合检测结果应不高于2.50ng/ml的检测标准；以上结果均说明本发明检测试剂盒具有较高的检测特异性。

表7特异性检测分析结果

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。