抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物及制备和应用

摘要

本发明提供了一种抗体‑高活性细胞毒小分子药物偶联药物及制备和应用。所述方法包括以亲水性异双功能不可裂解链接子通过化学修饰连接抗体和活性细胞毒类小分子化学药物偶联来制备所述抗体‑高活性细胞毒小分子药物偶联药物；其中，所述亲水性异双功能不可裂解链接子具有如下式(I)或式(II)所示的结构：其中，L1选自亚苯基、或‑(CH2)m‑C(＝O)‑NHC2H4‑(OC2H4)n‑；R1选自H或‑SO3Na；m为0、1、2或3；n为1～30。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是癌症治疗，具体的说，本发明涉及一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物及制备和应用。

背景技术

针对目前公开的抗体-药物化学偶联技术，其主要采用的链接子都是非水性有机化合物，在抗体偶联药物(antibody-drug conjugates，ADCs)生产制备过程中需要使用一定比例的有机溶剂(如：DMAC、DMF、DMSO等)溶解链接子用于抗体化学偶联反应，有机溶剂体积比例甚至达到30％(V:V)，较大量有机溶剂的使用不仅生产工艺过程中存在使用有机溶剂的危险性(车间有可能需要防爆设计)且生产废液会造成一定程度上的环境污染或造成大量混有有机溶剂废弃物回收困难，而且在抗体化学偶联反应过程中使用一定比例的有机溶剂(如：DMAC、DMF、DMSO等)对抗体蛋白药物类物理化学性质有较大的影响(有可能导致抗体蛋白变性沉淀)，甚至会导致抗体蛋白沉淀析出或者变性，直接导致抗体偶联药物生产失败，同时在药物生产过程中和成品放行检测需控制检测药物中有机溶剂的残留，这些都致使抗体偶联药物(antibody-drug conjugates，ADCs)生产制备工艺较难放大商业化、工业化且不符合环境友好型生产理念且处理费用较高。

譬如，US5208020和US5416064等报道了制备抗体-美登素生物碱偶联物的多种方法，首先用异双功能链接子化学修饰单克隆抗体，利用Sephadex

CN101087611A也报道了与US5208020、US5416064相同的方法制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，即先将异双功能链接子化学修饰单克隆抗体，纯化获得抗体第一步化学修饰反应溶液混合物，抗体修饰产物再与美登素类衍生物化学毒素偶联，进而纯化获得偶联物。利用这种方式获得的抗体-药物偶联物纯度较低并且使用大量的有机溶剂。例如，CN101087611A实施例中公开的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的单体纯度只有95％左右，并且抗体药物的聚体含量可达4.2％以上，生产工艺中使用一定比例的有机溶剂，这种高聚体抗体药物的存在在用药治疗过程中可能存在引起较高免疫源性的风险且药物有机溶剂的残留也会影响药物安全。

CN103254311A公开了在抗体化学偶联过程中加入一定比例的表面活性剂提高化学偶联率，同时在纯化步骤中增加阴离子层析纯化步骤，提高了产物的纯度，减低了药物的内毒素含量等，生产工艺中需要用到有机溶剂二甲基乙酰胺(DMAC)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等。

鉴于上述原因，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物；

本发明的另一目的在于采用新型亲水性异双功能链接子提供一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物的制备方法；

本发明的再一目的在于提供所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物的用途。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物的制备方法，其中，所述方法包括以亲水性异双功能不可裂解链接子通过化学修饰连接抗体和活性细胞毒类小分子化学药物来制备所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物；

其中，所述亲水性异双功能不可裂解链接子具有如下式(I)或式(II)所示的结构：

其中，L

R1选自H或-SO

m为0、1、2或3；n为1～30。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述亲水性异双功能不可裂解链接子具有如下式(1)-式(4)所示的结构：

其中式(1)为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；

式(2)为SM(PEG)n(PEGylated,long-chain SMCC crosslinker)；

式(3)为SM(PEG)n-SO

式(4)为Sulfo-MBS；

式(II)为Sulfo-SIAB。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括：

(A)先利用亲水性异双功能不可裂解链接子化学修饰抗体得到修饰抗体，然后修饰抗体再和活性细胞毒类小分子化学药物进行化学偶联得到所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物；或者，

(B)先利用亲水性异双功能不可裂解链接子化学修饰活性细胞毒类小分子化学药物得到修饰小分子化学药物，然后修饰小分子化学药物再和抗体进行化学偶联得到所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括将抗体以超滤浓缩或脱盐层析的方法置换于偶联反应缓冲液体系中，然后再用亲水性异双功能不可裂解链接子化学修饰抗体得到修饰抗体，或者用修饰小分子化学药物和抗体进行化学偶联得到所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物。

根据本发明一些具体实施方案，其中，偶联反应缓冲液体系为20-100mM的磷酸氢钠盐缓冲液或10-30Mm的醋酸钠盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，偶联反应缓冲液体系为50mM的磷酸氢钠盐缓冲液或20Mm的醋酸钠盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，方法(A)中，所述方法包括得到修饰抗体后，先将修饰抗体通过层析柱或超滤进行纯化，然后再和活性细胞毒类小分子化学药物进行化学偶联。

根据本发明一些具体实施方案，其中，方法(A)中，所述方法包括得到修饰抗体后，先将修饰抗体通过G25层析柱或超滤进行纯化，然后再和活性细胞毒类小分子化学药物进行化学偶联。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括将得到的抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物进行阳/阴离子层析纯化和/或超滤置换纯化。

根据本发明一些具体实施方案，其中，方法(A)中，修饰抗体再和活性细胞毒类小分子化学药物是在乳化剂存在下进行化学偶联得到所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物；以化学偶联反应的反应液总体积为100％计，乳化剂的用量为0.1-1v/v％。

本发明通过利用乳化剂，减低了化学偶联反应体系中有机溶剂的体积含量，提高化学偶联效率。

根据本发明一些具体实施方案，其中，以化学偶联反应的反应液总体积为100％计，乳化剂的用量为0.2-0.6v/v％。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括如下步骤：

(1)抗体反应缓冲液制备：

将抗体以超滤浓缩或脱盐层析的方式置换抗体原液至偶联反应缓冲液体系中，然后将偶联反应缓冲液体系浓缩至抗体浓度在10～40mg/ml，得置换后的抗体；

(2)用链接子化学修饰抗体反应：

将亲水性异双功能不可裂解链接子加入置换后的抗体溶液中进行化学修饰反应得到含有修饰抗体的反应液；

(3)纯化制取抗体-链接子修饰产物：

将步骤(2)得到的含有修饰抗体的反应液进行柱层析或进行超滤纯化；

(4)化学偶联反应：

将步骤(3)得到的纯化后的修饰抗体、活性细胞毒类小分子化学药物和乳化剂混合后进行化学偶联反应；

(5)阳/阴离子柱层析纯化：

将步骤(4)得到的化学偶联反应液进行阳/阴离子柱层析纯化，收集洗脱液；

(6)超滤置换与浓缩：

将步骤(5)得到的洗脱液用制剂缓冲液超滤浓缩，收集浓缩液得到所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(1)是将偶联反应缓冲液体系浓缩至抗体浓度为20～25mg/ml。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(3)将步骤(2)得到的含有修饰抗体的反应液上样至G25柱进行柱层析或进行超滤纯化。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(3)还包括用平衡缓冲液冲洗层析柱或超滤系统。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(5)所述柱层析为G25-COO柱层析。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(5)所述柱层析的洗脱液为5-30mM的琥珀酸钠盐缓冲液或者5-70mM的磷酸钠盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(6)所述制剂缓冲液为琥珀酸钠盐缓冲液或者磷酸钠盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(6)所述制剂缓冲液为5-30mM的琥珀酸钠盐缓冲液或者5-70mM的磷酸钠盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括向步骤(6)得到洗脱液中加入其它制剂成分。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述其它制剂成分为5-30mM琥珀酸钠盐缓冲液(或盐酸-组氨酸类缓冲液)或者5-70mM磷酸钠盐缓冲液-蔗糖或海藻糖-0.02％吐温20或80的混合溶液。

其中可以理解的是，这里所述的“5-30mM琥珀酸钠盐缓冲液(或盐酸-组氨酸类缓冲液)或者5-70mM磷酸钠盐缓冲液-蔗糖或海藻糖-0.02％吐温20或80的混合溶液”是指琥珀酸钠盐缓冲液(或者磷酸钠盐缓冲液)-蔗糖(或海藻糖)-0.02％吐温20(或吐温80)的混合溶液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述其它制剂成分为5-10mM琥珀酸钠或盐酸-组氨酸类缓冲液)-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80的混合溶液，所述混合溶液pH值为4.0-7.0。

其中可以理解的是，这里所述的“5-10mM琥珀酸钠或盐酸-组氨酸类缓冲液)-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80的混合溶液”是指5-10mM琥珀酸钠或盐酸-组氨酸类缓冲液)、以及2-10％蔗糖、以及0.01-0.1％吐温20(或吐温80)的混合溶液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体和亲水性异双功能不可裂解链接子的物质的量的比为(2-10)：1；活性细胞毒类小分子化学药物与修饰抗体的物质的量比为(4-7)：1。

根据本发明一些具体实施方案，其中，亲水性异双功能不可裂解链接子化学修饰抗体的反应条件包括：反应温度10℃-40℃，反应时间0.5～5小时(优选为60min～150min)，反应体系溶液pH值为4-9；修饰抗体和活性细胞毒类小分子化学药物进行化学偶联的反应条件包括：反应温度15℃-35℃，反应时间0.5～6小时，反应体系溶液pH值为3-10。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体选自特异性地和靶向癌细胞表面的任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段、抗体、单链抗体、单克隆抗体片段、多克隆抗体片段、和嵌合抗体中的一种或多种的组合；所述活性细胞毒类小分子化学药物为美登素生物碱及其衍生物。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体为人源化单克隆抗体。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体为抗-her2抗体、抗CD79b抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体和抗EGFR抗体。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述活性细胞毒类小分子化学药物选自N

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述乳化剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80中的一种或多种的组合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述偶联反应缓冲液体系为pH值为4.0-9.0的磷酸盐缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述偶联反应缓冲液体系为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述的超滤浓缩或者脱盐层析的方法可以采用现有技术，例如可以通过Pellicon系统进行超滤浓缩，或采用SephadexTMG25凝胶层析柱进行脱盐层析。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤(4)的化学偶联反应是在有机溶剂中进行的，所述有机溶剂选自二甲基乙酰胺(DMAC)、二甲基甲酰胺(DMF)、和二甲基亚砜(DMSO)等。

根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明的方法具体包括如下步骤：

(1)用于制备抗体-美登素偶联药物的抗体反应缓冲液制备

利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至第一步化学修饰反应缓冲液中，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml，得置换后的抗体；

(2)用水溶性(亲水性)不可裂解异双功能链接子化学修饰抗体反应(抗体第一步化学修饰反应)

精确称取水溶性(亲水性)不可裂解异双功能链接子，加入上述置换后的抗体溶液中化学修饰反应60min～150min；反应温度为15～30℃，优选的，所述水溶性(亲水性)不可裂解异双功能链接子为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。

(3)超滤或G25纯化制取抗体-链接子修饰产物

将上述抗体化学修饰反应液上样至G25柱或超滤进行纯化，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗G25柱或超滤系统，直至收集完毕；

(4)抗体-链接子修饰产物化学偶联美登素衍生物(DM1)反应(抗体第二步化学偶联反应)

按美登素衍生物(DM1)与抗体-链接子修饰产物的物质的量比为4～7：1的比例，将第(3)步中得到的置换后的抗体与美登素生物碱母液混合，化学偶联反应液中加入0.1％～1％V/V的乳化剂进行抗体化学偶联反应，反应温度15～30℃，反应时间3～6小时；

(5)阳离子层析纯化

将上述抗体化学偶联反应液进行阳离子层析纯化，收集洗脱液。

(6)超滤置换与浓缩

将上述抗体化学偶联反应液阳离子层析纯化产物用制剂缓冲液的组分超滤浓缩，收集洗脱液。

(7)抗体-美登素衍生物偶联药物原液制备

将上述抗体化学偶联反应液超滤浓缩产物溶液，按照一定的比例加入其它制剂成分调节成一定的浓度制备成抗体-美登素衍生物偶联药物原液。

另一方面，本发明还提供了一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物，其中，所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物由亲水性异双功能不可裂解链接子连接抗体和活性细胞毒类小分子化学药物得到；所述亲水性异双功能不可裂解链接子具有如下式(1)或式(II)所示的结构：

其中，L选自亚苯基、

R1选自H或-SO

m为0、1、2或3；n为1～30；

优选所述亲水性异双功能不可裂解链接子具有如下式(1)-式(4)所示的结构：

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体选自特异性地和靶向癌细胞表面的任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段、抗体、单链抗体、单克隆抗体片段、多克隆抗体片段、和嵌合抗体中的一种或多种的组合；所述活性细胞毒类小分子化学药物为美登素生物碱及其衍生物。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体为人源化单克隆抗体。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体为抗-her2抗体、抗-CD79b抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体和抗CD22抗体。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述活性细胞毒类小分子化学药物选自N

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物由本发明上述任意一项所述的制备方法制备得到。

再一方面，本发明还提供了所述的抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述肿瘤选自her2阳性过度表达类癌症或膀胱癌。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述肿瘤选自her2阳性过度表达类癌症为乳腺癌、结直肠癌或胃癌。

综上所述，本发明提供了一种抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物及制备方法。本发明的技术方案具有如下优点：

1、在生产制备抗体-高活性细胞毒类小分子药物(美登素类)偶联药物过程中选用亲水性链接子(如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)，抗体第一步化学修饰工艺过程中无需使用有机溶剂，从而使小试工艺更适合工业化商业化生产，同时避免了生产工艺过程中有机溶剂存在对抗体蛋白物理化学性质的改变，在药物生产过程中中间体中和成品放行检测中无需检测有机溶剂的残留，例如：以抗-HER2抗体-MCC-DM1生产工艺为例，同等条件下，抗体第一步化学修饰反应无需有机溶剂，采用亲水性异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，提高抗体化学修饰反应效率，降低了生产成本和废弃物处理成本，生产工艺中无有机溶剂或更低含量的有机溶剂，既安全、减低成本又符合环境友好型的理念。

2、抗体第二步化学偶联反应液纯化增加阳离子层析纯化工艺，生产制备的抗体-高活性细胞毒类小分子药物(美登素类)偶联药物具有较高的纯度、较低的内毒素含量和较低的游离小分子药物含量(FREE DRUG)。以抗HER2抗体-MCC-DM1生产工艺为例，抗体第二步化学偶联反应液纯化增加阳离子层析纯化工艺可以使抗体药物聚体由4％左右降低到1.5％左右或更低，SEC-HPLC纯度可提高到约99％左右或更高，同时可以降低药物内毒素含量、降低药物中游离高活性小分子药物的残留。

3、抗体第二步化学偶联反应液加入0.1％～1％V/V的乳化剂(如吐温20或吐温80)，该乳化剂也是药物制剂主要成分，无需检测成品的中残留，提高抗体化学偶联反应效率和药物单体含量，降低高活性细胞毒类小分子药物的相对使用量和药物聚体含量，反应条件更为温和，较适宜生产工艺放大及商业化。

4、采用系列新型水溶性异双功能链接子增强抗体偶联药物的稳定性，进一步提高药物纯度、安全性和有效性，拓宽了药物治疗窗口。

5、该制备方法适合于靶向不同靶点的抗体偶联药物，特别是抗体为抗-her2抗体、抗-CD79b抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体和抗CD22抗体的抗体偶联药物的生产。

附图说明

图1为实施例1的抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物质谱图谱(DAR)；

图2为实施例1的抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药抗体-抗原结合活性；

实验过程简要描述及结论：

用抗原包被酶标板，将梯度稀释好的待测样品加至包被好的酶标板中，孵育0.5-2h；之后加入酶标二抗(Anti-human IgG(γchain specific)-peroxidase conjugate，来自Sigma)稀释液，孵育0.5-3h；洗板后，室温孵育10-100min；终止液终止反应后，在450nm波长测吸光值，拟合四参数曲线。

结论：抗-Her2抗体-MCC-DM1偶联药物与抗原靶点具有高活性、特异性结合活性。

图3为实施例1的抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药体外抑制癌细胞生物学活性；

实验过程简要描述及结论：

根据药物的抑癌作用机理，选择Her2高表达的细胞作为靶细胞，通过方法优化，确定了细胞量、孵育时间、加样浓度等实验条件。

检测方法：

细胞悬液制备：调整细胞浓度至0.4-1*105cells/mL，铺板孵育1-5小时。

样品处理：将reference与待测样品用培养液进行梯度稀释后加入细胞版中，同时设立空白对照孔，置于37度孵育60-120小时。染色5-9小时后，在530nm激发光和590nm发射光，用酶标仪读取荧光读值，记录结果。利用平行性分析的方法进行结果处理。

结果：抗-Her2抗体-MCC-DM1偶联药物具有明显抑制癌细胞生物学活性。

图4为实施例1的抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药纯度(单体含量)检测图谱(SEC-HPLC)；

实验过程简要描述及结论：

按《中国药典》2015版三部通则0514分子排阻色谱法检测。色谱柱适合分离蛋白质的色谱用凝胶为填充剂(如TOSOH的TSK gel G3000 SWXL 7.8mm)；流动相为磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾-氯化钾溶液，pH6.0±1)-异丙醇；检测波长为280nm。用流动相将供试品稀释至每lmL中约含10mg，作为供试品溶液，取供试品溶液20μL注入液相色谱仪。按面积归一化法计算，单体含量≥93.0％，聚体含量应≤7.0％。

图5为实施例1的抗-Her2抗体-MCC-DM1偶联药物对人乳腺癌BT-474裸小鼠移植瘤的疗效(n＝10)；

图6为实施例2的采用亲水性链接子合成抗her2-抗体--MCC-DM1偶联药物质谱图谱(DAR)。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。

偶联率的测定方法：测定偶联率是指测定每个单抗分子上连接美登素衍生物生物碱类药物分子或其它高活性毒素分子的数量，即美登素生物碱类药物或其它高活性细胞毒小分子的摩尔数与单抗摩尔数的比值。可采用双波长紫外分光光度法和液相-质谱分析法两种方式测定。双波长紫外分光光度法：通过测定抗体-美登素生物碱类偶联物在252nM和280nM处的紫外吸收值，并通过朗伯尔比定律进行计算得出偶联率(DAR)；质谱分析法：对抗体-美登素衍生物生物碱偶联药物进行ESI-MS分析，可以获得连接不用个数药物的峰型图和分布图，根据各个峰的面积进行计算得出偶联率(DAR)。通过两种方法获得的偶联率具有较好的一致性和相互校正。

抗体偶联药物浓度测定：采用双波长紫外分光光度法，测定出在252nM和280nM处的紫外吸收值，通过朗伯比尔定律即可计算出抗体和药物的浓度；本发明中所述的抗体偶联药物浓度是指单抗浓度及其偶联的美登素衍生物生物碱药物的总和。

SEC-HPLC分析：利用TSKgelG3000高效分子筛对抗体-美登素生物碱偶联药物进行分析，流动相选用KH

内毒素含量检测：参照《中国药典2015版》细菌内毒素检测法进行。

实施例中的链接子为异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。其中4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐购自sigma公司或苏州昊帆生物股份有限公司，SMCC购自苏州昊帆生物股份有限公司，DM1购自联宁生物制药有限公司，抗体(抗-HER2)和注射用水为东曜药业有限公司生产提供。

实施例中各步骤前面出现的“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”表示分别采用不同的并列技术方案，以作平行对照。

实施例1

制备抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物，具体步骤如下：

(1)制备用于偶联反应的抗体置换缓冲液体系

利用50Mm磷酸钠盐缓冲液超滤置换的方式置换抗-HER2抗体原液(抗体A，即抗her2抗体)至50Mm磷酸钠盐缓冲液(pH值4.0-8.0)中，浓缩至抗体浓度在20～40mg/ml，得置换后的抗体溶液，溶液的pH值4～8。

(2)制备10mg/ml的sulfo-SMCC反应液

按照sulfo-SMCC:抗体物质的量比8:1，精确称量需要的水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐固体粉末，用注射用水溶解配置成10mg/ml的sulfo-SMCC溶液备用；

(3)抗体第一步化学修饰反应

在步骤(1)所制备的抗体(抗体A)溶液中加入步骤(2)制备的水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，搅拌至充分混合，反应温度控制在10～30℃，反应时间为1h～3h。

(4)抗体第一步化学修饰反应溶液纯化

将步骤(3)中反应液分别用步骤(5)中及20Mm醋酸钠盐(pH值4.0-8.0)反应缓冲液8-15倍体积超滤置换纯化，分别收集抗体(抗体A)-MCC修饰产物的纯化溶液。

(5)抗体第二步化学偶联反应

按照DM1：(抗体A)-MCC＝1-5:1精确称量DM1产品，用DMAC(二甲基乙酰胺)溶解配置成20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液；在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20或吐温80)，加入1-5％(体积比)的20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)溶液反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

(6)抗体第二步化学偶联反应溶液纯化

将步骤(5)中反应液先用20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液阳(或阴)离子层析交换(Fractogel EMD COO-，洗脱液20Mm醋酸钠盐缓冲液)在≤300cm/h线性流速下纯化出去小分子药物和药物聚体，再用5-10mM琥珀酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液制剂缓冲液8-15倍体积超滤置换纯化，收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液。

(7)抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液制备

分别将步骤(6)中收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液添加一定比例的其它制剂缓冲液成分(优选制剂组分及含量为5-10mM琥珀酸钠-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80，PH4.0-7.0)配置成抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液。药学检测图谱如图1所示。药物纯度如图4所示。所制得的药物质量如下表1所示。所制备的药物活性如图2、图3和图5所示。

表1抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物质量分析

实施例2

制备抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物，验证评估改用水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐对抗体偶联药物质量的影响。

抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备用于偶联反应的抗体置换缓冲液体系

利用50Mm磷酸钠盐缓冲液超滤置换或者或者凝胶G25柱(FF)交换层析析(流速不高于300cm/h)的方式置换抗-HER2抗体原液(抗体A)至50Mm磷酸钠盐缓冲液(pH值4.0-8.0)中，浓缩至抗体浓度在20～40mg/ml，得置换后的抗体溶液，溶液的pH值4～8。

(2)a:制备10mg/ml的SMCC/DMSO(二甲基亚砜)有机溶液反应液

按照SMCC:抗体物质的量比8:1，精确称量需要的SMCC固体粉末，用有机溶剂DMSO(二甲基亚砜)溶解配置成10mg/ml的SMCC/DMSO(二甲基亚砜)溶液。

b:按照sulfo-SMCC:抗体物质的量比8:1，精确称量需要的水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐固体粉末，用注射用水溶解配置成10mg/ml的sulfo-SMCC溶液；

(3)抗体第一步化学修饰反应

a:在步骤(1)所制备的抗体(抗体A)溶液中加入步骤(2)a部分SMCC/DMSO(二甲基亚砜)有机溶液反应液，充分搅拌混合，化学修饰反应温度控制在为10～30℃，反应时间为1h～3h。

b:在步骤(1)所制备的抗体(抗体A)溶液中加入步骤(2)b部分相同物质的量的水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，搅拌至充分混合，反应温度控制在10～30℃，反应时间为1h～3h。

(4)抗体第一步化学修饰反应溶液纯化

分别将步骤(3)中a、b两组反应液分别用步骤(5)中及20Mm醋酸钠盐(pH值4.0-8.0)反应缓冲液10倍体积超滤置换纯化，分别收集抗体(抗体A)-MCC修饰产物的纯化溶液。

(5)抗体第二步化学偶联反应

a:在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中加入5-10％(体积比)的10mg/ml的DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液反应液，充分搅拌混合，化学修饰反应温度控制在为10～30℃，反应时间为1h～5h或过夜。

b:在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中加入5-10％(体积比)的DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)反应液，反应温度为15～30℃，反应时间为1h～5h或过夜。

(6)抗体第二步化学偶联反应溶液纯化

分别将步骤(5)中a、b两组反应液分别用制剂缓冲液(即5-10mM琥珀酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液)10倍体积超滤置换纯化，分别收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液。

(7)抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液制备

分别将步骤(6)中a、b两组收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液添加一定比例的其它制剂缓冲液成分(优选制剂组分及含量为5-10mM琥珀酸钠-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80，PH4.0-7.0)配置成抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液。药学检测图谱如图6所示。所制得的药物质量如下表2所示。

表2使用水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠对抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物质量分析对比：

实施例3

制备抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物，研究评估抗体第二步化学偶联反应纯化步骤增加阳离子层析纯化工艺对抗体偶联药物质量的影响。

抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备用于偶联反应的抗体置换缓冲液体系

利用超滤置换或者G25柱交换层析的方式置换抗-HER2抗体原液(抗体A)至50mM磷酸钠盐反应缓冲液中，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml，得置换后的抗体溶液，抗体溶液的pH值4～8。

(2)按sulfo-SMCC:抗体物质的量比8:1理论计算值，精确称量水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐固体粉末，用注射用水溶解配置成10mg/ml的sulfo-SMCC溶液。

(3)抗体第一步化学修饰反应

在步骤(1)所制备的抗体(抗体A)溶液中加入步骤(2)配置好的10mg/ml(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，充分搅拌，反应温度控制为10～30℃，反应时间为1h～3h。

(4)抗体第一步化学修饰反应溶液纯化

分别将步骤(3)中抗体第一步化学修饰反应液用步骤(5)中反应缓冲液(20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液)10倍体积超滤置换纯化，收集抗体(抗体A)-MCC修饰产物的纯化溶液。

(5)抗体第二步化学偶联反应

在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中加入5-10％(体积比)的10mg/ml的DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

(6)抗体第二步化学偶联反应溶液纯化

c：将步骤(5)中反应液直接用20Mm琥珀酸钠盐制剂缓冲液10倍体积超滤置换纯化，收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液；

d:将步骤(5)中反应液先用20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液阳(或阴)离子层析交换(Fractogel EMD COO-，洗脱液20Mm醋酸钠盐缓冲液)在≤300cm/h线性流速下纯化出去小分子药物和药物聚体，再用5-10mM琥珀酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液制剂缓冲液10倍体积超滤置换纯化，收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液。

(7)抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液制备

分别将步骤(6)中c、d两组收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液添加一定比例的其它制剂缓冲液成分(优选制剂组分及含量为5-10mM琥珀酸钠-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80，PH4.0-7.0)配置成抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液。做制备的药物质量如表3所示：

表3抗体第二步化学偶联反应纯化步骤增加阳离子层析纯化工艺对抗体偶联药物质量的影响：对抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物质量分析对比：

实施例4

制备抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物，验证抗体第二步化学偶联反应中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20)对抗体偶联药物质量的影响

抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备用于偶联反应的抗体置换缓冲液体系

利用超滤置换或者G25柱交换层析的方式置换抗-HER2抗体原液(抗体A)至50mM磷酸钠盐反应缓冲液中，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml，得置换后的抗体溶液，抗体溶液的pH值4～8。

(2)按sulfo-SMCC:抗体物质的量比8:1理论计算值，精确称量水溶性(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐固体粉末，用注射用水溶解配置成10mg/ml的sulfo-SMCC溶液。

(3)抗体第一步化学修饰反应

在步骤(1)所制备的抗体(抗体A)溶液中加入步骤(2)配置好的10mg/ml(亲水性)异双功能不可裂解链接子4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液，充分搅拌，反应温度控制为10～30℃，反应时间为1h～3h。

(4)抗体第一步化学修饰反应溶液纯化

分别将步骤(3)中抗体第一步化学修饰反应液用步骤(5)中反应缓冲液(20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液)10倍体积超滤置换纯化，收集抗体(抗体A)-MCC修饰产物的纯化溶液。

(5)抗体第二步化学偶联反应

e:按照DM1：(抗体A)-MCC＝5-10:1精确称量DM1产品，用DMAC(二甲基乙酰胺)溶解配置成10mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液；在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中加入5-10％(体积比)的10mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

f:按照DM1：(抗体A)-MCC＝1-5:1精确称量DM1产品，用DMAC(二甲基乙酰胺)溶解配置成20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液；在步骤(4)所制备的抗体(抗体A)-MCC修饰产物溶液中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20或吐温80)，加入1-5％(体积比)的20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)溶液反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

(6)抗体第二步化学偶联反应溶液纯化

将步骤(5)中反应液先用20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液阳(或阴)离子层析(Fractogel EMD COO-)在≤300cm/h线性流速下交换纯化除去小分子药物和药物聚体，再用5-10mM琥珀酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液制剂缓冲液10倍体积超滤置换纯化，收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液。

(7)抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液制备

分别将步骤(6)中e、f两组收集抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物的纯化溶液添加一定比例的其它制剂缓冲液成分(优选制剂组分及含量为5-10mM琥珀酸钠-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80，PH4.0-7.0)配置成抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物原液。所得到的药物质量如表4所示：

表4抗体第二步化学偶联反应中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20)对抗-HER2抗体-MCC-DM1偶联药物偶联效率和质量分析对比：

实施例5

制备抗-CD79b抗体-SM(PEG)

抗-CD79b抗体-SM(PEG)

(1)制备用于偶联反应的抗体置换缓冲液体系

利用超滤置换或者G25柱交换层析的方式置换抗-CD79b抗体原液至50mM磷酸钠盐反应缓冲液中，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml，得置换后的抗体溶液，抗体溶液的pH值为4～8。

(2)按-SM(PEG)

(3)抗体第一步化学修饰反应

在步骤(1)所制备的抗-CD79b抗体溶液中加入步骤(2)配置好的10mg/ml(亲水性)异双功能不可裂解链接子SM(PEG)24溶液溶液，充分搅拌，反应温度控制为10～30℃，反应时间为1h～5h。

(4)抗体第一步化学修饰反应溶液纯化

分别将步骤(3)中抗体第一步化学修饰反应液用步骤(5)中反应缓冲液(20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液)10倍体积超滤置换纯化，收集抗-CD79b抗体-SM(PEG)24修饰产物的纯化溶液。

(5)抗体第二步化学偶联反应

g:按照DM1：抗-CD79b抗体-SM(PEG)24＝5-10:1精确称量DM1产品，用DMAC(二甲基乙酰胺)溶解配置成10mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液；在步骤(4)所制备的抗-CD79b抗体-SM(PEG)24修饰产物溶液中加入5-10％(体积比)的10mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

h:按照DM1：抗-CD79b抗体-SM(PEG)24＝1-5:1精确称量DM1产品，用DMAC(二甲基乙酰胺)溶解配置成20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)有机溶液；在步骤(4)所制备的抗-CD79b抗体-SM(PEG)24修饰产物溶液中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20或吐温80)，加入1-5％(体积比)的20mg/ml DM1/DMAC(二甲基乙酰胺)溶液反应液，反应温度控制为15～30℃，反应时间为1h～6h或过夜。

(6)抗体第二步化学偶联反应溶液纯化

将步骤(5)中反应液先用20Mm醋酸钠盐缓冲液或磷酸钠盐缓冲液阳(或阴)离子层析(Fractogel EMD COO-)在≤300cm/h线性流速下交换纯化除去小分子药物和药物聚体，再用5-10mM琥珀酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液制剂缓冲液10倍体积超滤置换纯化，收集抗-CD79b抗体-SM(PEG)24-DM1偶联药物的纯化溶液。

(7)抗-CD79b抗体-SM(PEG)24-DM1偶联药物原液制备

分别将步骤(6)中g、h两组收集抗-CD79b抗体-SM(PEG)24-DM1偶联药物的纯化溶液添加一定比例的其它制剂缓冲液成分(优选制剂组分及含量为5-10mM琥珀酸钠-2-10％蔗糖-0.01-0.1％吐温20或吐温80，PH4.0-7.0)配置成抗-CD79b抗体-SM(PEG)24-DM1偶联药物原液。所得到的药物质量如表5所示：

表5新型抗体、新型PEG化链接子和抗体第二步化学偶联反应中添加0.1％～1％V/V的乳化剂(吐温20)对抗-CD79b抗体-SM(PEG)24-DM1偶联药物偶联效率和质量分析对比：