ZmD53基因在调控玉米雄穗分枝发育或培育耐密植新品种中的应用

摘要

本发明公开了ZmD53基因在调控玉米雄穗分枝发育或培育耐密植玉米新品种中的应用。本发明首先构建了ZmD53基因的玉米突变体，通过表型观察发现ZmD53基因的突变导致玉米雄穗分枝数量明显减少；本发明进一步通过分子机制研究发现ZmD53是调控玉米独脚金内酯信号通路中的一个重要因子，通过调控ZmD53基因在玉米中的表达，能够调控玉米雄穗的发育或分枝数目，在培育耐密植、适合机械化收获的理想株型玉米新品种等方面有应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及ZmD53基因的新应用，尤其涉及ZmD53基因在调控玉米雄穗分枝发育或培育耐密植新品种中的应用，属于ZmD53基因的新用途领域。

背景技术

玉米不仅是重要的粮食作物，也是食品、化工、燃料、医药等行业的重要原料。目前玉米已成为我国种植面积最广、单产最高的第一大作物。但由于人口增长、膳食结构改变、城镇化和能源供应压力的增加，提高玉米单产已成为保障中国粮食安全的关键技术措施。

大量研究表明，提高品种耐密性和种植密度是提高玉米单产的关键。作为玉米种植和生产大国，美国玉米的的种植密度从上世纪三十年代的～30000株/公顷(Cardwell,1982)提高到当代的～70000株/公顷(62000-104000株/公顷)(Mansfield and Mumm,2014)；同时，单产也从1287公斤/公顷提高到9595公斤/公顷(2010年统计数据)(Mansfieldand Mumm,2014；USDA-NASS,2012)。

在玉米育种上，合适的株高与穗位、适当的穗分枝数、最佳的生育期和叶夹角是获得理想株型、产量和生物量的关键指标，也是培育适宜机械化作业新品种的基础。雄穗大小(雄穗分枝数和长度)是玉米驯化和遗传改良的重要目标性状。过度发达的雄穗影响株型的冠层结构，降低植株整体光能利用率。然而，起始于生殖生长阶段的雄穗分枝发育，本质上是植物侧生分生组织的发育。如何调控雄穗分枝，调控路径如何运转，我们该如何对其加以利用，为培育优良高效耐密的新品种贡献理论基础和基因资源。玉米雄穗分枝数是典型数量性状，其分化发育过程受植物激素、环境和遗传因子的协同调控。目前已鉴定出多条途径参与调控玉米雄穗发育，包括CLV/WUS途径，生长素途径，RAMOSA途径和SPL途径等(Justineet al.,1999；Taguchi-Shiobara et al.,2001；Gallavotti et al.,2004,2010；Vollbrecht et al.,2005；Bommert et al.,2005；Skirpan et al.,2009；Chuck et al.,2014)。

研究表明，这几十年的育种过程中美国玉米单株产量和杂种优势的提升并不明显，玉米单产的增加更多的是由于种植密度和品种耐密性的持续增长(Duvick,2005；Duvick and Cassman,1999；Duvick,1997；Hammer et al.,2009)。对不同年代中国玉米品种的研究也显示，相较于早期品种，近现代品种在产量、光合效率、抗倒性、空杆率等重要农艺性状方面都表现出对高密度栽培条件的更适应性(白向历等,2015；李从锋等,2013；刘鑫等,2012；钱春荣等,2012；汤彬等,2013)。由此可见，提高品种耐密性和种植密度是现代玉米育种和生产的重要目标和趋势。近年来，随着社会的发展，中国劳动力成本越来越高，农业也向着机械化、集约化的方向发展；在这些压力下，培育耐密植、适合机械化收获的理想株型玉米品种便是保障玉米单产增加和提高种植者收益的重要出路(Gong et al.,2015)。

因此，鉴定调控雄穗分枝数和雄穗大小的关键基因，解析其遗传调控网络和分子机理对于雄穗的遗传改良具有指导意义。

发明内容

本发明的目的之一是鉴定调控雄穗分枝数或雄穗大小的关键基因；

本发明的目的之二是将所鉴定调控雄穗分枝数和雄穗大小的关键基因应用玉米的雄穗的遗传改良或培育耐密植的玉米新品种；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先构建了ZmD53内源启动子驱动的玉米显性突变体材料ZmD53

为了阐明ZmD53基因调控雄穗分枝数的分子机制，本发明进一步发现独脚金内酯类似物GR24能够降解ZmD53蛋白，但是突变后的Zmd53蛋白对GR24无响应)，该试验结果说明ZmD53是玉米独脚金内酯信号通路中的一员。在此基础上，本发明进一步对其调控雄穗分枝数的分子机理进行了解析，发现ZmD53可通过与SPL蛋白UB3和TSH4互作共同调控下游基因表达，该结果暗示玉米中SL信号途径与SPL信号途径互作协同调控玉米雄穗分枝发育过程。

由此，本发明提供了一种减少玉米雄穗分枝数量或使玉米雄穗变小的方法，包括：

构建ZmD53基因的敲除载体；将所构建的基因敲除载体转化到玉米植物中，将玉米中的ZmD53基因进行敲除或突变，所得到的转基因植物中雄穗分枝数量减少或雄穗变小。

本发明还提供了一种培育耐密植的玉米新品种的方法，包括：构建ZmD53基因的敲除载体；将所构建的基因敲除载体转化到玉米植物中，筛选得到雄穗分枝数量减少或雄穗变小的玉米新品种。

本领域人员可以采用常规的基因敲除或基因编辑技术等常规的方法，将玉米中的ZmD53基因进行突变或敲除，譬如构建ZmD53基因敲除载体或采用基因编辑技术构建CRISPR/Cas9基因编辑载体等，将玉米中的ZmD53基因进行突变或敲除，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。

本发明中所述的ZmD53基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明进一步提供了一种增加玉米雄穗分枝数量或使雄穗变大的方法，包括：

将ZmD53基因在植物中进行过表达得到转基因植物；譬如：将ZmD53基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在玉米中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化玉米，使ZmD53基因在玉米植物中进行过表达。

本发明公开了含有所述ZmD53基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；包括，将所述ZmD53基因可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，ZmD53基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将编码基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。

所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物是玉米。

本发明鉴定到玉米中一个调控雄穗分枝数的关键基因ZmD53，进一步发现ZmD53是一个调控玉米独脚金内酯信号通路中的重要因子，通过调控ZmD53的表达，就可调控玉米雄穗分枝数目；本发明进一步解析其遗传调控网络和分子机理；通过调控ZmD53的表达，从而可调控雄穗分枝数目，改造玉米株型或培育耐密植的高产新品种，本发明对于玉米雄穗的遗传改良具有指导意义。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1 ZmD53基因在玉米各组织中的表达量变化。

图2突变体植株表型分析；A.ZmD53：Zmd53的载体构建图；B.与野生型WT相比，ZmD53的两个株系雄穗分枝数明显减少；C.WT的雄穗原基扫描电镜成像照片；D.ZmD53的雄穗原基扫描电镜成像照片；E.与WT与ZmD53突变体两个株系的雄穗分枝数量统计。

图3 ZmD53与Zmd53对GR24的响应情况；玉米原生质体中ZmD53(A)和Zmd53(C)都是核定位蛋白，ZmD53响应独脚金内酯类似物GR24，能够被其降解(B)，但Zmd53对GR24不响应(D)。

图4 ZmD53与UB3和TSH4在体外互作。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1玉米ZmD53突变体的构建及表型观察试验

构建了ZmD53内源启动子驱动的显性突变体材料ZmD53

具体构建方法如下：

用CPB载体为骨架，用infusion的方法将已扩增出的D53启动子连入骨架，将D53cdna从突变区域为界限分为两段，用infusion的方法将中间的18个碱基缺失掉，融合进已连入D53启动子的CPB载体骨架。

使用的引物序列如下：

D53promoter-F：TACGTAGGGTGGTGGTGCACGT；

D53promoter-R：TTAACGGCAAGCCAGAGGGTG；

D53-F:TTTCTTTCCCGTTTCACTCCT；

D53-R:CCAATCCAGAATTATTCTCGAGG；

转化方法为：用EHA105农杆菌介导，转化玉米幼胚获得。

转基因植物经由basta抗性筛选获得。

经过观察，多个独立的转基因株系均表现出雄穗分枝数减少的缺陷表型(图1和2)。

试验例2 ZmD53基因调控雄穗分枝数的分子机制试验

本试验将ZmD53和突变形式的Zmd53构建到亚细胞定位表达载体1305中，转化玉米原生质体，获得瞬时表达体系，在处理组中加入5μMGR24处理4h后，与对照组一起观察ZmD53和Zmd53的表达模式。发现独脚金内酯类似物GR24能够降解ZmD53蛋白，但是突变后的Zmd53蛋白对GR24无响应(图3)，该结果说明ZmD53是玉米独脚金内酯信号通路中的一员。

进一步，对其调控雄穗分枝数的分子机理进行了解析，本试验用酵母双杂交的方法探索ZmD53与SPL蛋白的相互关系。分别将ZmD53和SPL蛋白UB2、UB3、TSH4构建到PGADT7和PGBKT7两个载体上，通过共转酵母菌株AH109验证其相互关系；实验发现ZmD53可通过与SPL蛋白UB3和TSH4互作共同调控下游基因表达(图4)，这个结果暗示着玉米中SL信号途径与SPL信号途径互作协同调控玉米雄穗分枝发育过程。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> ZmD53基因在调控玉米雄穗分枝发育或培育耐密植新品种中的应用

<130> GD-2001-190828A

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3408

<212> DNA

<213> Zea mays L

<400> 1

atgccgacgc cggtgcccgc cgcgcgccag tgcctctccc cgcccgccgt cacggccctc 60

gacgccgccg tcgcctccgc gcgccgacgg gcccacgcgc agaccacctc ccttcacctc 120

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