重组乙型肝炎抗原冻干保护剂、重组乙型肝炎抗原冻干疫苗及其制备方法

摘要

本发明实施例公开了一种重组乙型肝炎抗原冻干保护剂，包括以下原料组分：甘氨酸0.1‑0.5mg/ml；蔗糖10‑100mg/ml；吐温80(0.1‑0.3mg/ml)；以及渗透压调节剂。本发明还公开了相应的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗及其制备方法。实施本发明，可大大提高疫苗中重组乙型肝炎抗原的耐热性和安全性，降低疫苗的保存条件。

说明书

技术领域

本发明涉及乙肝疫苗领域，尤其涉及一种重组乙型肝炎抗原冻干保护剂、重组乙型肝炎抗原冻干疫苗及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病，约三分之二的慢性感染者会发展成为肝硬化、肝癌等恶性肝疾患者，全球每年约有55万人死于肝癌。通过对HBV结构的研究发现，外膜蛋白是引起宿主保护性应答的主要免疫原表位。

目前，我国生产的预防性乙肝疫苗有两种，一种是酵母表达的基因工程乙肝疫苗，另一种是哺乳动物(CHO)细胞表达的基因工程乙肝疫苗，两种疫苗的活性成分均为乙肝表面S抗原，统称为第二代预防性乙肝疫苗。

目前已上市的基因工程表达的乙肝疫苗均为水针剂，为重组乙肝抗原、佐剂和生理盐水。

发明人在实施本发明的过程中发现，上述技术方案存在以下缺陷：

水针剂保存时需要在低温保存，室温或高温长时间疫苗会失效，且水针剂一旦受到微生物污染会大量繁殖，存在安全风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种重组乙型肝炎抗原冻干保护剂、重组乙型冻干疫苗及其制备方法，以大大提升乙肝疫苗的耐热性和安全性。

为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：

一种重组乙型肝炎抗原冻干保护剂，其特征在于，包括以下原料组分：

甘氨酸 0.1-0.5mg/ml；

蔗糖 10-100mg/ml；

吐温80 0.1-0.3mg/ml；以及

渗透压调节剂。

作为一些可能的实施方式，各原料组分按照以下含量配置：

甘氨酸 0.3-0.5mg/ml；

蔗糖 10-100mg/ml；

吐温80 0.1-0.2mg/ml。

作为一个可能的实施方式，各原料组分，各原料组分按照以下含量配置：

甘氨酸 0.3mg/ml

蔗糖 50mg/ml

吐温80 0.2mg/ml。

作为一些可能的实施方式，所述渗透压调节剂为氯化钠。

作为一个可能的实施方式，所述氯化钠含量为4.5mg/ml。

作为一些可能的实施方式，还包括有以下组分：

D-甘露醇 0.5-3mg/ml。

相应地，本发明还公开了一种重组乙型肝炎抗原冻干疫苗，包括以下组分：

重组乙型肝炎抗原 10-30μg/ml；

以及如上任一项所述的冻干保护剂。

作为一些可能的实施方式，所述重组乙型肝炎抗原含量为20-22μg/ml。

相应地，本发明还公开了一种重组乙型肝炎抗原冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：

用注射用水分别配制如上项所述的冻干保护剂中各原料组分的高浓度母液；

用除菌滤器对所述个原料组分的高浓度母液进行过滤除菌后，2-8℃保存备用。

相应地，本发明还公开了一种重组乙型肝炎抗原冻干疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将重组乙型肝炎抗原的酿酒酵母进行发酵培养表达重组乙型肝炎抗原，收集发酵产物经细胞破碎、离心、超滤和层析等工艺对重组乙型肝炎抗原进行纯化，然后根据需求用PBS(pH7.2)溶液稀释到指定抗原含量2-8℃保存备用；

将采用如上所述的制备方法制备得到的母液依次按处方量加入到重组乙型肝炎抗原中，边加边搅拌直至各原料组分混合均匀；

重组乙型肝炎抗原疫苗的规格确定装量，将上述混合液分装到冻干容器中，然后将分装好的样品进行降温速率为1-3℃/min预冻至-40℃保温2小时以上；

将预冻好的混合液放入冻干机内，设定冻干温度为-30℃，真空度为0.01-0.1mbar进行冷冻干燥24-48小时，提升温度至25℃进行解析干燥12-24小时结束冻干；

将冻干好的样品进行密封保存，冻干样品水分含量控制不高于3％。

本发明的有益效果是：

本发明实施例通过采用甘氨酸0.1-0.5mg/ml；蔗糖10-100mg/ml；吐温80(0.1-0.3mg/ml)；以及若干用于调节渗透压的渗透压调节剂作为重组乙型肝炎冻干保护剂的原料组分，经过除菌过滤后应用于重组乙型肝炎抗原冻干。从而大大提高了重组乙型肝炎抗原的耐热性和安全性，采用了本发明实施例的冻干重组乙型肝炎抗原，冻干损失低于5％，37℃放置1个月抗原含量降低小于20％，能在2～8℃保存24个月；且不会被微生物繁殖污染，大大降低了安全风险。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

下面详细描述本发明提供的重组乙型肝炎抗原冻干保护剂的一个实施例，本实施例主要包括以下原料组分：

甘氨酸 0.1-0.5mg/ml；

蔗糖 10-100mg/ml；

吐温80 0.1-0.3mg/ml；以及

渗透压调节剂。

作为一些可能的实施方式，本实施例中各原料组分可按照以下含量配置：

甘氨酸 0.3-0.5mg/ml；

蔗糖 10-100mg/ml；

吐温80 0.1-0.2mg/ml。

作为一个可能的实施方式，本实施例中各原料组分进一步可按照以下含量配置：

甘氨酸 0.3mg/ml

蔗糖 50mg/ml

吐温80 0.2mg/ml。

作为一种可能的实施方式，本实施例中所述渗透压调节剂可采用氯化钠。具体实现时，渗透压调节剂的含量可根据需要调节的渗透压确定，例如，所述氯化钠含量可以是4.5mg/ml。

作为一些可能的实施方式，本实施例还可以包括以下组分：

D-甘露醇 0.5-3mg/ml。

下面详细描述本发明提供的一种重组乙型肝炎抗原冻干疫苗的一个实施例，本实施例主要包括以下原料组分：

重组乙型肝炎抗原 10-30μg/ml；

以及如前述实施例所述的冻干保护剂。

在一些可能的实施方式中，所述重组乙型肝炎抗原含量范围可以举例为20-22μg/ml。

下面详细描述本发明提供的重组乙型肝炎抗原冻干保护剂的制备方法的一个实施例，本实施例主要包括以下步骤：

用注射用水分别配制如前述实施例所述的冻干保护剂中各原料组分的高浓度母液；

用除菌滤器对所述个原料组分的高浓度母液进行过滤除菌后，2-8℃保存备用。

下面详细描述本发明提供的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗的制备方法的一个实施例，本实施例主要包括以下步骤：

将重组乙型肝炎抗原的酿酒酵母进行发酵培养表达重组乙型肝炎抗原，收集发酵产物经细胞破碎、离心、超滤和层析等工艺对重组乙型肝炎抗原进行纯化，然后根据需求用PBS(pH7.2)溶液稀释到指定抗原含量2-8℃保存备用；

将采用如前述实施例中重组乙型肝炎抗原冻干保护剂的制备方法制备得到的母液依次按处方量加入到重组乙型肝炎抗原中，边加边搅拌直至各原料组分混合均匀；

重组乙型肝炎抗原疫苗的规格确定装量，将上述混合液分装到冻干容器中，然后将分装好的样品进行降温速率为1-3℃/min预冻至-40℃保温2小时以上；

将预冻好的混合液放入冻干机内，设定冻干温度为-30℃，真空度为0.01-0.1mbar进行冷冻干燥24-48小时，提升温度至25℃进行解析干燥12-24小时结束冻干；

将冻干好的样品进行密封保存，冻干样品水分含量控制不高于3％。

为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例采用重组乙型肝炎抗原及其冻干保护剂制备重组乙型肝炎抗原冻干疫苗的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。

实施例1

将重组乙肝抗原按每20μg/ml的比例，按下表所示方式进行配方筛选试验，将各组样品将分装好的样品预冻至-40℃保温2小时以上，放入冻干机内进行冻干。取样检测抗原含量变化，同时将表2.样品置于37℃加速试验4周观察抗原含量变化。

表1、实施例1重组乙型肝炎抗原冻干保护剂原料组分筛选实验表

从冻干样品复溶后的检测结果可以看出，本发明实施例1提供的的重组乙型肝炎保护剂对疫苗中冻干蛋白稳定性具有明显的保护作用。

表2、实施例1重组乙型肝炎抗原冻干保护剂原料组分含量范围实验表

从冻干样品37℃稳定性检测结果可以看出，4周稳定性抗原含量所有样品抗原含量下降不超过20％。蔗糖含量在10-100mg/ml时对冻干蛋白的活性影响不大，均有较好的保护作用；甘氨酸含量为0.1-0.5mg/ml时对冻干蛋白有较好的保护作用，但0.1mg/ml含量略低于0.5mg/ml，因此该组分不宜过低；吐温80含量在0.1-0.3mg/ml对蛋白冻干保护性好，但用量高于0.3mg/ml时活性下降较多。

实施例2

20μg/剂重组乙型肝炎抗原冻干配方，所述该组分配方如下表所示：

将上述配好处方量混合液按每剂重组乙肝抗原1ml进行分装。将分装好的样品预冻至-40℃保温2小时以上，放入冻干机内进行冻干。

将冻干好的样品复溶与冻干前含量进行比较，并将样品进行2-8℃、25℃和37℃的稳定性实验，观察抗原含量变化。

表3、实施例2重组乙型肝炎抗原冻干疫苗稳定性实验表

从表3可以看出，在不同温度下进行稳定性测试，采用本发明实施例2提供的冻干保护剂冻干后的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗中重组乙型肝炎抗原含量在低温和室温下未发生显著变化，37℃条件一个月略微有下降。说明本发明实施例的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗保存稳定性良好。

实施例4

0.02mg/剂重组乙型肝炎抗原冻干配方，所述该组分配方如下表所示：

将上述配好处方量混合液按每剂重组乙肝抗原0.02mg进行分装。将分装好的样品预冻至-40℃保温2小时以上，放入冻干机内进行冻干。

将冻干好的样品复溶与冻干前含量进行比较，并将样品进行2-8℃、25℃和37℃的稳定性实验，观察抗原含量变化。

表4、实施例3重组乙型肝炎抗原冻干疫苗稳定性实验表

从表4可以看出，在不同温度下进行稳定性测试，采用本发明实施例3提供的冻干保护剂冻干后的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗中重组乙型肝炎抗原含量在低温和室温下未发生显著变化，37℃条件一个月略微有下降。说明本发明实施例的重组乙型肝炎抗原冻干疫苗保存稳定性良好。

本发明实施例提供的重组乙型肝炎抗原冻干保护剂及冻干工艺能有效脱去重组乙型肝炎抗原疫苗的水分，使疫苗的稳定性增强从而能显著提高保存环境的变化，室温条件也可长期保存。冻干疫苗含水量低于3％，一般微生物无法繁殖生长，能提高疫苗的安全性。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。