巨噬细胞亚群及其调节剂在急性移植物抗宿主病中的应用

摘要

本发明公开了巨噬细胞亚群及其调节剂在急性移植物抗宿主病中的应用。本发明保护检测巨噬细胞中KLF4转录因子或其编码核酸表达量的物质的如下应用：制备检测aGVHD患者巨噬细胞极化/功能状态、诊断aGVHD，和/或检测巨噬细胞是否发生M1/M2极化失衡的产品。本发明发现KLF4在巨噬细胞中显著下降是M1/M2极化失衡功能改变的生物标志物。本发明可用于检测造血干细胞移植后aGVHD患者巨噬细胞极化及功能状态，对疾病分层诊疗具重要临床意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及巨噬细胞亚群及其调节剂在急性移植物抗宿主病中的应用。

背景技术

急性移植物抗宿主病(aGVHD)仍然是异基因造血干细胞移植的重要合并症。aGVHD通常被认为是一种免疫介导的疾病，具体地说，异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，大大增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标，导致患者相关死亡率增高及医疗费用增高。糖皮质激素是目前aGVHD的一线治疗方案，但是仍有40-60％患者出现激素耐药，且现有二线治疗效果欠佳。因此，aGVHD发病机制的深入阐明及其新型治疗策略的建立是亟待解决的重要临床科学问题。

巨噬细胞由骨髓单核细胞分化成熟而来，单核巨噬细胞系统是体内固有免疫重要组分，具有极强的异质性。单核细胞根据其表型及功能主要分为三个亚型：经典型、中间型和非经典型单核细胞。巨噬细胞受环境刺激也会极化成不同表型和功能的细胞亚群，主要包括经典激活型巨噬细胞(M1)和选择激活型巨噬细胞(M2)，两类巨噬细胞表型及功能迥异。M1/M2极化失衡参与了多种自身免疫学疾病、代谢性及炎症性疾病的发生。功能上，M1可高表达促炎因子，具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性，并介导活性氧诱导的组织损伤，抑制组织再生及愈合；M2表达抗炎因子，具有强大的吞噬能力，可清除碎片及凋亡细胞，促进组织修复及愈合，并具有促血管生成和促纤维化的特性。

Krtippel样因子4(Klf4或称肠道富集的Krtippel样因子)是属于Krtippel蛋白家族的一种含有锌指结构的转录因子。Klf4具有多种生理功能。

目前，并无M1和M2型巨噬细胞在aGVHD发生发展中作用研究。并无通过调控转录因子KLF4表达调节巨噬细胞极化来改善aGVHD外周T细胞所处微环境的正常化、最终改善T细胞功能的报道。因此，提供一种能有效调控巨噬细胞改善免疫效应细胞功能的方法对临床靶向治疗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供巨噬细胞亚群及其调节剂在aGVHD中的应用。

第一方面，本发明要求保护用于检测巨噬细胞中KLF4转录因子或其编码核酸表达量的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备用于检测aGVHD患者巨噬细胞极化和/或功能状态的产品；

(A2)制备用于诊断aGVHD的产品；

(A3)制备用于检测巨噬细胞是否发生M1/M2极化失衡的产品；

(A4)制备用于鉴别诊断移植后急性移植物抗宿主病患者和非急性移植物抗宿主病患者的产品；

(A5)制备用于预测移植后急性移植物抗宿主病是否会发生的产品。

其中，所述aGVHD患者可为造血干细胞移植后aGVHD患者。(A4)中所述移植为造血干细胞移植。所述巨噬细胞极化状态可指巨噬细胞是否发生M1/M2极化失衡。所述巨噬细胞功能状态可指巨噬细胞的吞噬、迁移和/或分泌细胞因子的功能是否异常。

进一步地，在本发明中，巨噬细胞M1/M2极化失衡具体表现为巨噬细胞向促炎表型M1过度极化而减少向M2极化导致M1/M2显著增高。

在所述应用中，用于检测巨噬细胞中KLF4转录因子表达量的物质可包括能够与巨噬细胞中KLF4转录因子特异性结合的物质(如抗体等)，用于检测巨噬细胞中KLF4转录因子编码核酸表达量的物质可包括能够用于扩增或检测KLF4转录因子编码核酸的引物，当然同时还可以包括测序仪等。

在该方面中，所述产品可为检测试剂或试剂盒。

第二方面，本发明要求保护M2型巨噬细胞在如下任一中的应用：

(B1)制备用于预防aGVHD发生的产品；

(B2)制备用于改善aGVHD的产品。

在本发明的具体实施方式中，所述改善aGVHD具体体现为：提高aGVHD患病机体的生存率(期)和/或减轻aGVHD症状。

其中，所述M2型巨噬细胞可为来自于针对aGVHD患病机体而言的供体的M2型巨噬细胞。

在该方面中，所述产品可为药品。

第三方面，本发明要求保护M1型巨噬细胞在如下任一中的应用：

(C1)构建aGVHD病情加剧的动物模型；

(C2)制备用于构建aGVHD病情加剧的动物模型的物质。

在本发明的具体实施方式中，所述aGVHD病情加剧具体体现为：降低aGVHD患病动物生存率(期)和/或加重aGVHD症状。

其中，所述M1型巨噬细胞可为来自于针对患有aGVHD的受体动物而言的供体的M1型巨噬细胞。

第四方面，本发明要求保护能够提高巨噬细胞中KLF4转录因子表达量的物质在如下任一中的应用：

(D1)制备用于抑制急性移植物抗宿主病患病机体T细胞活化的产品；

(D2)制备用于抑制急性移植物抗宿主病患病机体T细胞增殖的产品；

(D3)制备用于预防和/或治疗急性移植物抗宿主病患的产品。

其中，所述能够提高巨噬细胞中KLF4转录因子表达量的物质可为含有KLF4基因的表达盒、重组质粒或重组慢病毒载体。

第五方面，本发明要求保护能够降低巨噬细胞中KLF4转录因子表达量的物质在如下任一中的应用：

(E1)构建促进急性移植物抗宿主病患病机体T细胞活化和/或增殖的动物模型；

(E2)制备构建促进急性移植物抗宿主病患病机体T细胞活化和/或增殖的动物模型的产品。

其中，所述能够降低巨噬细胞中KLF4转录因子表达量的物质为能够干扰KLF4基因表达的干扰序列、或含有所述干扰序列的重组质粒或重组慢病毒载体。

本发明研究发现巨噬细胞向促炎表型M1过度极化，而向M2极化减少导致M1/M2显著增高，进而促进aGVHD外周T细胞活化增殖，是移植后aGVHD患者巨噬细胞极化异常、功能改变的生物学特征。aGVHD小鼠模型回输M1型巨噬细胞促进aGVHD发生发展，而回输M2型巨噬细胞改善aGVHD是预防aGVHD发生的有效措施。巨噬细胞KLF4转录因子在巨噬细胞中显著下降是M1/M2极化失衡功能改变的生物标志物。本方法可用于：①检测造血干细胞移植后aGVHD患者巨噬细胞极化及功能状态，对疾病的分层诊疗具有重要临床意义；②在检测评估患者外周巨噬细胞基础上，通过回输M2型巨噬细胞，从而改善aGVHD，对疾病的精准靶向治疗具有重要意义。

附图说明

图1为aGVHD和非aGVHD患者外周单核细胞，巨噬细胞的比例差异。A为单核巨噬细胞流式典型图。B为经典型单核细胞比例；C为中间型单核细胞比例；D为非经典型单核细胞比例；E为M1型巨噬细胞比例；F为M2型巨噬细胞比例；G为M1与M2的比值。

图2为aGVHD和非aGVHD患者外周血培养所得巨噬细胞的吞噬和迁移能力，胞内细胞因子差异。A为迁移细胞数；B为吞噬细胞比例；C为巨噬细胞中TNF-ɑ水平；D为巨噬细胞中IL-6水平；E为巨噬细胞中TGF-β水平。

图3为aGVHD小鼠分别回输M1和M2型巨噬细胞，小鼠aGVHD靶器官病理切片典型图。

图4为aGVHD小鼠分别回输M1和M2型巨噬细胞，小鼠生存曲线(A)；aGVHD小鼠临床评分(B)和aGVHD小鼠靶器官病理评分(C)。

图5为aGVHD和非aGVHD患者外周血培养所得巨噬细胞转录因子KLF4的基因表达量。

图6为体外通过慢病毒过表达或敲减巨噬细胞转录因子KLF4，对外周T细胞分化增殖的影响。A为过表达或敲减后巨噬细胞转录因子KLF4蛋白水平；B为增殖的CD3

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、不同巨噬细胞亚群及其调节剂在急性移植物抗宿主病中的应用

一、实验材料

1.单克隆抗体：CD68-FITC(BD Biosciences)，CCR2-Alexa Fluor 647(BDBiosciences)，CX3CR1-PerCP/Cy5.5(Biolegend))，CD163-PE/Cy7(Biolegend)，CD14-PE(Biolegend)，CD16-APC/Cy7(Biolegend)，IL-6-APC(BD Biosciences)，TGF-β-BV421(BDBiosciences)，TNF-ɑ-BV650(BD Biosciences)。CD3-APC/H7(BD Biosciences)，CD8-BV510(Biolegend)，CD25-PE/Cy7(Biolegend)，IFN-γ-PerCP/Cy5.5(Biolegend)，IL-4-PE(BDBiosciences)，IL17A-FITC(BD Biosciences)，FoxP3-eFlour660(eBioscience)。

2.DAPI溶液：货号C0065，北京索来宝公司。

3.二乙酰化低密度脂蛋白：DiI-AcLDL，Life Technologies公司。

4.受鼠BALB/c小鼠，供鼠C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

5.重组人M-CSF：Catalog#300-25,美国PEPROTECH公司。

6.人CD14分选磁珠：货号130-050-201，德国Miltenyi公司。

7.溶血素：BD FACSTM Lysing Solution,美国BD公司，4℃保存。

8.胎牛血清(FBS)：美国Gibco公司。

9.RPMI 1640液体培养基：美国Gibco公司。

10.PBE溶液配制：PBS+2％FBS(美国Gibco公司)+EDTA(终浓度2mmol/L)。

11.THP-1细胞系：人单核巨噬细胞系，中国科学院细胞库/干细胞库。

12.KLF4敲减慢病毒、过表达慢病毒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

13.Polybrene：生工生物工程(上海)股份有限公司。

14.本前瞻性临床队列研究共纳入allo-HSCT后符合入组标准的aGVHD患者20例，非aGVHD患者20例。aGVHD患者与非aGVHD患者的基本特征如性别、年龄、移植前基础疾病、化疗次数、危险度评估、预处理方案、移植干细胞来源、总有核细胞剂量和移植后检测时间、巨细胞病毒感染史等类似。

二、实验方法

1、单核巨噬细胞亚群比例的检测

取全血5×10

2、巨噬细胞吞噬功能检测

取单个核细胞于15ml离心管PBS洗涤离心后弃上清，加入80μl美天旎磁珠缓冲液、20μlCD14

3、巨噬细胞迁移功能检测

取5×10

4、巨噬细胞分泌细胞因子检测

体外培养的巨噬细胞中加入100ng/ml脂多糖LPS在37℃孵育24小时，消化并收取细胞置于流式管，加入巨噬细胞表面流式抗体(CD163 5μl、CCR2 5μl、CD68 5μl、CX3CR1 5μl)，室温避光孵育15min。加入PBS2ml混匀，1500rpm离心5分钟。弃上清，加入100μl破膜固定液室温避光孵育15min。加入PBS2ml混匀，1500rpm离心5分钟。弃上清，加入巨噬细胞胞内流式抗体(TNF-ɑ5μl、IL-6 5μl、TGF-β5μl)，室温避光孵育15min后PBS2ml清洗，4h内上机检测，流式图像分析采用Diva 7.0软件。

5、aGVHD小鼠模型建立

断颈处死C57BL/6小鼠，置于盛有75％酒精的金属弯盘内，在超净台内逐层剖开腹腔，取出脾脏，双后肢，置入预先盛有PBE溶液的无菌玻璃皿中。将脾脏置于筛网上，用匀浆棒轻轻研磨脾脏，将得到的研磨液收集入离心管中；用剪刀将双后肢骨头两端剪开小口，以1ml注射器吸取PBE溶液，将针头小心插入骨髓腔，反复冲洗骨髓腔，将得到的冲洗液收集入离心管中。向离心后所得的沉淀中加入约5ml红细胞裂解液，用移液枪轻轻吹打后，室温避光静置8分钟，然后加入5ml培养基终止裂解过程，离心。骨髓细胞加20μlCD90.2磁珠/10

受鼠BALB/C小鼠骨髓移植前一周开始饮用抗生素水，预防感染，条件允许时置入空气层流柜行无菌饲养。移植前一天用

6、转录组测序

将aGVHD以及非aGVHD患者外周培养得到的巨噬细胞按Trizol抽提说明书进行总RNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，并进行质检(OD260/280≥1.9)，Nanodrop分光光度计检测RNA浓度和纯度。使用oligo dT微珠纯化mRNA片段化处理，之后反转录反应合成双链cDNA，双链DNA末端修复及3’末端加‘A’，使用特定的测序接头连接DNA片段两端，高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库。对构建好的文库进行氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”，进行PCR扩增，产生DNA簇，DNA扩增子线性化成为单链。加入改造过的DNA聚合酶(日本TaKaRa)和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类，将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸，统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

7、THP-1细胞系慢病毒感染

1)Polybrene的选择：Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常Polybrene的加入能提高感染效率2～10倍。但是Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合添加Polybrene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳。

2)细胞最佳感染MOI值的测定

MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)是指每个细胞感染的病毒颗粒数。进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI后再进行后续实验。

3)感染操作步骤：

按实验需要将THP-1细胞铺板(例如24孔板)，细胞数以第2天密度约50％为宜，37℃培养过夜。注：对于适用Polybrene的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加0.5ml Polybrene培养基混合物于每孔中(适用于24孔板，其他孔板请相应调整体积)。感染前，从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积培养液(此培养液为混匀有病毒原液的新鲜培养基)。37℃感染4h，4h后补齐培养液至正常体积。

4)为了明确KLF4转录因子是否调控巨噬细胞对aGVHD外周T细胞增殖和活化的作用，本发明利用KLF4过表达病毒LV-KLF4-GFP(KLF4),KLF4敲减病毒LV-KLF4-shRNA-GFP(KLF4-KD)和阴性对照(KLF4-WT)重组慢病毒调节巨噬细胞转录因子KLF4的基因表达水平。

8、THP-1细胞与T淋巴细胞共培养

取单个核细胞于15ml离心管PBS洗涤离心后弃上清，加入80μl美天旎磁珠缓冲液、20μlCD3+磁珠后充分混匀4℃孵育15分钟。孵育后用磁珠缓冲液洗涤细胞，利用分选柱阳选CD3

9、流式检测T淋巴细胞胞内细胞因子分泌

加入1ng/μl的PMA 100μl、1μg/μl的离子霉素2μl、Golgistop 0.7μl，震荡混匀，37℃孵箱孵育4h。1500rpm离心5分钟，弃上清后弹起细胞，加入表面流式抗体(CD3、CD8、CD25)，室温孵育15min。加入PBS2ml混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清后弹起细胞。加入1ml固定液，涡旋混匀，4℃冰箱孵育30min。加入2ml破核膜工作液，2000rpm离心5分钟，弃上清。加入胞内抗体(IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3)，涡旋混匀，4℃冰箱孵育30min。加2ml破核膜工作液，2000rpm离心5分钟，弃上清，加200μl破核膜工作液，弹起细胞。24h内上机检测。流式图像分析采用Diva 7.0软件。Th1细胞表型为CD3

三、结果与分析

1、前瞻性临床队列研究发现aGVHD患者外周巨噬细胞极化失衡，功能异常

通过前瞻性临床队列研究发现aGVHD患者外周巨噬细胞极化失衡，巨噬细胞向M2极化比例显著下降。具体的说，本发明人通过流式检测aGVHD患者外周单核巨噬细胞系统各亚群分布情况(图1中A)，发现与非aGVHD患者相比，aGVHD患者经典型单核细胞比例下降(图1中B)，中间型及非经典型单核细胞比例增高(图1中C和D)；与此同时，aGVHD患者巨噬细胞向M1极化增高(图1中E)，巨噬细胞向M2极化下降(图1中F)，呈现向促炎表型M1方向的巨噬细胞极化失衡状态(图1中G)。我们进一步评估aGVHD患者与非aGVHD患者外周巨噬细胞是否存在功能差异。利用DiI-AcLDL与巨噬细胞体外共孵育检测吞噬能力。如图2中A所示，与非aGVHD患者巨噬细胞迁移能力相比，aGVHD患者巨噬细胞迁移能力显著增强。如图2中B所示，与非aGVHD患者巨噬细胞吞噬功能相比，aGVHD患者巨噬细胞吞噬功能显著下降。最后利用Transwell迁移实验检测不同患者巨噬细胞迁移能力。综上所述，allo-HSCT后aGVHD患者巨噬细胞与非aGVHD患者巨噬细胞相比，不仅存在M1/M2极化比率差异，其功能也存在显著差异，具体表现在aGVHD患者巨噬细胞殖吞噬能力降低及迁移能力增强。巨噬细胞极化的失平衡可以反映局部组织微环境中的炎症状态。巨噬细胞极化后M1、M2两种类型细胞具有完全不一致的细胞因子表达谱。因此，利用流式细胞技术，我们进一步检测不同患者巨噬细胞胞内细胞因子表达水平。如图2中C-E所示，与非aGVHD患者巨噬细胞相比，aGVHD患者巨噬细胞整体高表达TNF-ɑ和IL-6，而低表达TGF-β。

巨噬细胞向促炎表型M1过度极化而减少向M2极化导致M1/M2显著增高，吞噬能力降低及迁移能力增强是移植后aGVHD患者巨噬细胞极化异常、功能改变的生物学特征。

2、M1,M2型巨噬细胞在aGVHD发生发展中的不同作用

通过对aGVHD小鼠模型回输M1,M2型巨噬细胞还发现M1促进aGVHD发生发展，而M2可改善aGVHD。

具体来说，体外磁珠分选C57BL/6供鼠单核细胞，并培养分化为初始巨噬细胞，利用LPS和IFN-γ诱导巨噬细胞极化为M1，IL-4和IL-13诱导巨噬细胞极化为M2。通过回输3×10

3、aGVHD患者巨噬细胞中转录因子KLF4表达降低

本发明进行转录组水平测序及前瞻性临床配对研究发现，与非aGVHD患者相比，aGVHD患者巨噬细胞KLF4转录因子基因表达水平显著下降(图5)。

巨噬细胞KLF4转录因子在巨噬细胞中显著下降是M1/M2极化失衡功能改变的生物标志物。

4、M2通过转录因子KLF4抑制aGVHD外周T细胞活化增值

为了明确KLF4转录因子是否调控巨噬细胞对aGVHD外周T细胞增殖和活化的作用，我们利用重组慢病毒调节巨噬细胞(THP-1细胞)转录因子KLF4的基因表达水平，并与外周CD3

如图6中A，成功利用重组慢病毒调节巨噬细胞KLF4表达。如图6中B-E，过表达巨噬细胞KLF4，可抑制aGVHD外周T细胞活化以及增殖。KLF4是aGVHD患者M1/M2极化失衡功能改变的生物标志物。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。