一种用大孔树脂法制备葛根素的方法

摘要

本发明涉及一种用大孔树脂法制备葛根素的方法，其具体步骤如下：在50℃的条件下，取粉碎葛根5kg，加入70％甲醇溶液2L，常温超声提取20min；常规滤纸过滤1次，重复两到三次，合并滤液，减压浓缩至干得，用水溶解干燥物并定容至600mL，得葛根素提取液；用盐酸或氢氧化钠溶液调节葛根素提取液pH值至6.0，在20℃的条件下，与NKA‑2型大孔树脂混合吸附11h，三层纱布过滤1次得饱和吸附的大孔树脂；将饱和吸附的大孔树脂在45℃下，用80％甲醇，pH值为8下解吸11h后，收集葛根素解吸液，通过高效液相色谱检测其纯度。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种用大孔树脂法制备葛根素的方法，属于天然产物加工技术领域。

背景技术

葛根为豆科植物野葛的干燥根，习称葛根，是卫生部批准的药食同源植物。葛根的分布极为广泛，中国大部地区有产，主要分布于辽宁、河北、河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖南、湖北、重庆、四川、贵州、云南、山西、陕西、甘肃等地，主要生长于山坡草丛或较为阴湿的地方。

葛根含有丰富的异黄酮类、三萜类、芳香类等化合物，其中异黄酮类为主要有效成分。葛根具有解肌退热、生津止渴等功效，在临床上对心脑血管疾病、抗衰老、解酒护肝等具有特殊的疗效。

现代化学研究表明，葛根中存在的主要有效化学成分为黄酮类化合物葛根素、黄豆苷等成分，其中葛根素是本属的特有成分。葛根素是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成份黄酮苷，具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用，其制剂葛根素注射剂临床用于治疗心脑血管疾病及视网膜血管病、眼底病及突发性耳聋等。

葛中的黄酮类化合物主要分布于根部，葛根中黄酮类物质的提取主要是根据相似相溶原理来完成的，黄酮类化合物的极性较大，一般需要极性较大的水、甲醇等溶液来完成提取。目前提取黄酮类化合物的方法众多，有酶解法、碱提酸沉法、加热回流法、亚临界水提取法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等方法，每种方法都有各自的优缺点。中药粗提物中的成分十分复杂，含有许多杂质化合物，因此分离纯化黄酮类化合物是葛根研究的重要步骤。目前，黄酮类化合物分离纯化常用的方法有：结晶与重结晶法、大孔树脂吸附法、凝胶色谱法、离子交换树脂法、超滤法等方法。

大孔吸附树脂是20世纪60年代开始发展的一种有机高聚物吸附剂，多为苯乙烯型或丙酸酯型，根据极性大小，可以将树脂分为非极性、中极性、极性三种。利用大孔吸附树脂对待分离物质的吸附作用和筛选作用达到分离目的的，其吸附作用是由于范德华力或产生氢键的结果，则筛选作用是由树脂本身的多孔性结构决定的。

大孔吸附树脂的理化性质较稳定，在水、酸、碱及常用有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)中均不被溶解，且具有选择性好、流体阻力小、吸附容量大、解吸容易、再生容易等优点。自发展以来，已被广泛应用于工业脱色、废水处理、药物分析、临床鉴定、药物分离提纯等领域。

本方案以葛根为原料，使用大孔吸附树脂法纯化葛根素，分别进行了大孔吸附树脂的筛选、单因素对吸附量与解吸量的影响实验、正交实验、验证实验等步骤，为大孔吸附树脂纯化葛根素的研究进展提供分离纯化工艺及数据参考。

发明内容

本发明提供一种大孔吸附树脂法制备葛根素的方法，其具体步骤如下：

(1)在50℃的条件下，取粉碎葛根5kg，加入70％甲醇溶液2L，常温超声提取20min；

(2)常规滤纸过滤1次，滤渣再加入70％甲醇溶液2L，常温超声提取20min，重复两到三次，合并滤液，减压浓缩至干得，用水溶解干燥物并定容至600mL，得葛根素提取液；

(3)用盐酸或氢氧化钠溶液调节葛根素提取液pH值至6.0，在20℃的条件下，与NKA-2型大孔树脂混合吸附11h，三层纱布过滤1次得饱和吸附的大孔树脂；

(4)将饱和吸附的大孔树脂在45℃下，用80％甲醇，pH值为8下解吸11h后，收集葛根素解吸液，通过高效液相色谱检测其纯度。

所述盐酸或氢氧化钠溶液优选为0.1mol/L盐酸或0.1mol/L氢氧化钠溶液。

所述减压浓缩优选为45-55℃。

技术效果

1、通过NKA-2型大孔树脂快速纯化葛根素，大大提高了其生产时间，也降低了其生产成本。

2、本发明方法简单、易于规模化生产。

附图说明

图1：葛根素的标准曲线图；

图2：吸附率与解吸率柱形图；

图3：pH值对吸附率的影响曲线；

图4：树脂质量对吸附率的影响曲线；

图5：吸附时间对吸附率的影响曲线；

图6：吸附温度对吸附率的影响曲线；

图7：解吸时间对解吸率的影响曲线；

图8：解吸液浓度对解吸率的影响曲线；

图9：解吸液PH值对解吸率的影响曲线；

图10：解析温度对解吸率的影响曲线；

图11：供试样品中葛根素高效液相色谱图。

具体实施方式

下面用本发明的实施实例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。

实施例1

1、标准溶液的配制：准确称量10mg葛根素标准品，用70％甲醇溶解并定容至100mL。此时，葛根素标准使用液的浓度为100μL/mL。吸取相应体积的使用液，配制浓度梯度为5、10、20、30、50μL/mL的标准溶液系列，放入高效液相色谱仪中进行检测，绘制标准曲线。

2、色谱参考条件：色谱柱：ODSC

3、葛根素提取液的制备：在50℃的条件下，取粉碎葛根5kg，加入70％甲醇溶液2L，常温超声提取20min，常规滤纸过滤1次，滤渣再加入70％甲醇溶液2L，常温超声提取20min，重复两到三次，合并滤液，减压浓缩至干得，用水溶解干燥物并定容至600mL，得葛根素提取液。吸取0.5mL提取液至25mL容量瓶中，定容，上机检测葛根素的浓度，备用。

4大孔树脂的筛选：

4.1大孔树脂的预处理：将HPD-100、HPD-500、AB-8、D301R、NKA-2、D101六种大孔树脂按照料液比1:2的比例加入乙醇，浸泡24h。用乙醇清洗树脂至无浑浊状态后，用蒸馏水洗至无乙醇味，备用。

4.2树脂含水量的测定

用滤纸吸干大孔树脂表面水分，准确称量2.0000g大孔树脂，70℃下干燥24h，至树脂呈松散状态。

4.3大孔树脂对葛根素的静态吸附及解析特性的测定

(1)静态吸附测定

分别准确称取2g经过预处理的六种大孔树脂(HPD-100、HPD-500、AB-8、D301R、NKA-2、D101)，置于六个带塞锥形瓶中。分别加入50mL的葛根素提取液，摇匀后室温下静置吸附24h。准确吸取1mL吸附后提取液，用70％甲醇定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机检测吸附后溶液中葛根素浓度，计算大孔树脂的吸附量与吸附率。

Q＝(C

Q：吸附量；E：吸附率；C

(2)静态解吸测定

将上述饱和吸附的大孔树脂滤去吸附后提取液，置于带塞锥形瓶中。加入50mL70％甲醇溶液，摇匀，室温下静置解吸24h。准确吸取1mL解吸液，用70％甲醇定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机检测解吸液中葛根素的浓度，计算大孔树脂的解吸量与解吸率。

D＝C

E：解吸率；D：解吸量；C

5、大孔树脂静态吸附葛根素实验

5.1单因素实验

(1)pH值对葛根素静态吸附的影响

分别准确称量2g大孔树脂置于六个带塞锥形瓶中，加入50mL稀释后葛根素提取液。用0.1mol/L盐酸或0.1mol/L氢氧化钠溶液将提取液pH值分别调至4、5、6、7、8、9，在温度为25℃条件下，静置吸附24h。准确吸取1mL吸附后提取液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定吸附后溶液中葛根素的浓度，计算其吸附量与吸附率。

(2)树脂质量对葛根素静态吸附的影响

分别准确称量1、2、3、4、5、6g大孔树脂置于六个带塞锥形瓶中，加入50mL葛根素提取液。在温度25℃条件下，静置吸附24h。准确吸取1mL吸附后提取液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定吸附后溶液中葛根素的浓度，计算其吸附量与吸附率。

(3)吸附时间对葛根素静态吸附的影响

分别准确称量2g大孔树脂置于十三个带塞锥形瓶中，加入50mL葛根素提取液。温度25℃条件下，每隔1h准确吸取1mL吸附后提取液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定吸附后溶液中葛根素的浓度，计算其吸附量与吸附率。

(4)吸附温度对葛根素静态吸附的影响

分别准确称量2g大孔树脂置于六个带塞锥形瓶中，加入50mL葛根素提取液。分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，静置吸附24h。准确吸取1mL吸附后提取液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定吸附后溶液中葛根素的浓度，计算其吸附量与吸附率。

5.2正交试验

表1静态吸附实验正交实验水平因素表

6大孔树脂静态解吸葛根素实验

按照吸附实验的最佳条件，进行葛根素静态吸附实验，三层纱布过滤1次制备饱和吸附树脂，备用。

6.1单因素实验

(1)解吸时间对葛根素静态解吸的影响

称取2g上述饱和吸附的大孔树脂，加入60％甲醇溶液50mL，在温度为25℃条件下静置解吸，每隔1h准确吸取1mL解吸液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定解吸后解吸液中葛根素的浓度，计算其解吸量与解吸率。

(2)解吸温度对葛根素静态解吸的影响

将上述饱和吸附的大孔树脂滤去提取液，加入60％甲醇溶液50mL，在温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下静置解吸5h。准确吸取1mL解吸液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定解吸后解吸液中葛根素的浓度，计算其解吸量与解吸率。

(3)解吸液浓度对葛根素静态解吸的影响

将上述饱和吸附的大孔树脂滤去提取液，加入浓度为50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇溶液各50mL，在温度为25℃条件下静置解吸5h。准确吸取1mL解吸液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定解吸后解吸液中葛根素的浓度，计算其解吸量与解吸率。

(4)pH值对葛根素静态解吸的影响

将上述饱和吸附的大孔树脂滤去提取液，加入60％甲醇溶液50mL，将解吸液pH调至4、5、6、7、8、9，在温度为25℃条件下静置解吸5h。精密吸取1mL解吸液，用70％甲醇溶液定容至25mL，过0.45μm滤膜，上机测定解吸后解吸液中葛根素的浓度，计算其解吸量与解吸率。

7.2正交试验

表2静态解吸实验正交实验水平因素表

8结果与分析

8.1葛根素的标准曲线

由图1可知，葛根素的标准曲线方程为y＝8440x+37334，相关系数R

8.2大孔树脂的筛选

由图2可知，吸附率最好的是NKA-2，D301R次之，HPD-500大孔树脂的解吸率虽为最大但其吸附率偏低，不宜选取。综合比对，本实验将选取NKA-2大孔树脂用作分离纯化葛根素研究。

8.3单因素实验对大孔树脂吸附葛根素效果的影响

(1)pH值对葛根素静态吸附的影响

从图3中可以看出，随着pH值增大，吸附率增大，在pH值为7时达到最大，而随着pH继续大，吸附率呈现下降趋势。这可能是由于黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，在酸性条件下呈分子状态，以氢键方式被吸附，因而树脂对其吸附力较强。而在碱性条件下，H质子易被强碱俘获，使得黄酮分子上的酚羟基上的氢解离形成酸根离子，从而减弱与树脂的结合能力使得吸附率下降。由此，将选择提取液pH为6、7、8三个水平进行下一实验。

(2)树脂质量对葛根素静态吸附的影响

如图4所示，树脂质量越大，吸附率越高。当树脂质量为3g时，吸附率的增幅趋于平缓，说明树脂质量在3g后对吸附率的影响减弱。因此，将选取树脂质量为2g、3g、4g三个水平进行下一实验。

(3)吸附时间对葛根素静态吸附的影响

如图5所示，随着时间的推移，吸附率在增大，在10h时达到最大。接下来的实验将选取9h、10h、11h三个水平进行。

(4)吸附温度对葛根素静态吸附的影响

如图6所示，温度升高，吸附率上升，但在达到25℃后开始下降。所以，将选择20℃、25℃、30℃三个水平继续实验。

8.4正交试验优化葛根素静态吸附工艺

表3吸附正交实验表

由极差R可得，ABCD四个因素对葛根素静态吸附效果的影响大小为：A>B>D>C，即树脂质量>吸附时间>pH值>吸附温度。

则，大孔树脂对葛根素吸附的最佳工艺为A

8.5单因素实验对大孔树脂解吸葛根素效果的影响

(1)解吸时间对葛根素静态解吸的影响

由图7可知，解吸时间对解吸率影响总体上呈上升趋势，在11h时，解吸率最高，其后解吸率虽有下降，但也只是小幅度的。因此，将选择10h、11h、12h三个水平实验。

(2)解吸液浓度对葛根素静态解吸的影响

由图8可知，随着解吸液甲醇的浓度增大，解吸率呈现先上升后下降的趋势，在浓度为80％时解吸率最高。其原因可能是解吸液浓度升高后树脂吸附的杂质等开始溶出，和葛根素竞争结合甲醇，使有效成分降低，解吸率下降

(3)pH值对葛根素静态解吸的影响

从图9上看到，解吸液pH值对解吸率影响在pH值为7处有个峰值。所以，将选择pH为6、7、8三个水平完成正交实验。

(4)解吸温度对葛根素静态解吸的影响

由图10得，解吸率在温度为40℃时有个峰值，则，选择40℃两侧值进行实验，即35℃、40℃、45℃三个水平。

8.6正交试验优化大孔树脂解吸葛根素工艺

表4解吸正交实验表

由极差R可得，ABCD四个因素对葛根素静态解吸效果的影响大小为：C>D>A>B，即解吸温度>pH值>解吸时间>解吸液浓度。

所以，大孔树脂对葛根素解吸的最佳工艺为A

8.7验证实验

称取10g样品，按照提取工艺制备葛根素提取液，按照表5中所确定的最优化静态吸附工艺进行实验，使用高效液相色谱仪检测。结果，吸附率为69.81％。随后，将树脂滤出，按照表6中所确定最优化静态解吸工艺进行实验，使用高效液相色谱仪测定。结果，解吸率为99.87％。