一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法

摘要

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法。该生物传感器包括熔融连接在一起的两根微纳光纤、固定于所述两根微纳光纤表面的探针单链DNA；两根所述微纳光纤都包括一个均匀腰区、位于所述均匀腰区两侧的锥形过渡区，光功率在所述两根微纳光纤之间耦合传递，所述锥形过渡区形状和所述均匀腰区直径抑制高阶模式传输。本发明的生物传感器结构简单，可操作性强，成本低，体积小，效率高和抗电磁干扰等优势，在转折点附近具有极高灵敏度，在生物化学传感领域具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测的方法和结构，特别涉及一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是生命现象中不可缺少的生物大分子，是遗传信息的载体控制着蛋白质的合成，其结构变化对生物体产生重大影响，与多种遗传疾病的起因相关。生物基因序列随着人类基因组计划的实施越来越多的得到确定，快速测序及准确识别混乱序列的基因检测技术引起各国科研工作者的研究热潮。因此，探索新型、高效、准确的DNA检测技术对于遗传信息的分析具有非常重要的作用。

而随着人类基因组计划的完成，功能基因研究的深入，基因诊断已成为分子生物学和生物医学的重要研究领域，特定序列的检测在基因分析、疾病诊断、食品污染等领域起着重要的作用。核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程，主要包括探针和待测核酸。核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一，可以实现对特异DNA或RNA序列片段进行定性或定量检测，此外可以在文库或基因组文库中筛选出特定的克隆获得某一重组体，确定基因组DNA上特定区域的核苷酸同源顺序等。DNA生物传感器作为一种利用核酸碱基配对原则进行识别的方法，能对特定系列的基因片段实现持续、快速、灵敏和选择性检测，因此如何实现高灵敏度、高通量、低成本等是DNA检测方法发展的重要目标。

发明内容

本发明为解决上述问题，提供一种用于核酸检测的生物传感器及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：

本发明提供一种用于核酸检测的生物传感器，包括熔融连接在一起的两根微纳光纤、固定于所述两根微纳光纤表面的探针单链DNA；两根所述微纳光纤都包括一个均匀腰区、位于所述均匀腰区两侧的锥形过渡区，光功率在所述两根微纳光纤之间耦合传递，所述锥形过渡区形状和所述均匀腰区直径抑制高阶模式传输。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，所述探针单链DNA与目标单链DNA杂交后引起光纤表面折射率的变化。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，所述两根微纳光纤工作在转折点附近区域；所述转折点指所述两根微纳光纤的有效群折射率相等。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，所述两根微纳光纤的有效群折射率相等。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，还包括输入端口和输出端口，所述输入端口和所述输出端口置于所述两根微纳光纤的两端；TE/TM偏振的入射光照射到所述输入端口，所述输出端口观测干涉谱线；通过检测所述干涉谱线波峰或波谷的偏移，对所述光纤表面折射率的变化进行检测。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，所述输入端口为P1和P2，所述输出端口为P3和P4；TE/TM偏振的入射光照射到P1和/或P2，在所述两根微纳光纤中会同时激励起偶模和奇模；所述偶模和所述奇模沿着所述两根微纳光纤进行传输时发生能量交换，在P3和P4观测到所述干涉谱线。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器中，通过多聚赖氨酸吸附法，实现所述探针单链核酸在所述两根微纳光纤表面的固定。

另一方面，本发明还提供一种用于核酸检测的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

S1、以溶剂折射率为参考，计算不同耦合器光纤直径和工作波长下转折点附近的灵敏度曲线；

S2、利用热熔融拉伸方法对两根光纤进行拉伸，通过控制工艺参数得到所需尺寸的光纤耦合器；两根所述光纤都包括一个均匀腰区、位于所述均匀腰区两侧的锥形过渡区，光功率在所述光纤耦合器之间耦合传递，所述锥形过渡区形状和所述均匀腰区直径抑制高阶模式传输；

S3、将光纤耦合器固定在样品池上，通过生物修饰在光纤表面附着一层表面修饰基团，然后固定探针单链核酸。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器的制备方法中，步骤S2中，所述热熔融拉伸方法具体包括如下步骤：

S201、取两根单模光纤，在每根光纤的中间剥除一段保护层，裸露出光纤包层，并将所述光纤包层外表面清洗干净；

S201、将处理好的光纤分别固定到可移动的V型槽内，并将所述两根光纤打结在一起；

S201、对光纤的裸露部位进行加热，并通过V型槽对光纤施以轴线拉力，实现光纤耦合器的拉制。

在本发明提供的用于核酸检测的生物传感器的制备方法中，所述光纤耦合器的所述均匀腰区具有约1μm的直径；所述溶剂具有约1.33的折射率。

相比现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)系统结构简单，可操作性强，成本低，体积小，效率高和抗电磁干扰等优势；

(2)本发明光纤耦合器DNA生物传感器在转折点附近具有极高灵敏度，在生物化学传感领域具有广泛的应用前景；

(3)DNA杂交过程实时监测，对于未来动态研究DNA杂交过程具有非常重要的意义；

(4)本发明传感器具有良好的稳定性和重复性，可实现对DNA高特异性监测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为微纳光纤耦合器传感器示意图；

图2为光纤DNA传感器表面修饰示意图；

图3是微纳光纤耦合器传感器折射率理论曲线，主要是不同耦合器直径对应的灵敏度；

图4是不同浓度DNA溶液对应的波长移动示意图，不同浓度的DNA溶液对应不同的波长峰值，随着浓度的增加发生红移。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

本发明是为了解决目前核酸生物传感器中存在的灵敏度低等问题，提出一种基于微纳光纤耦合器转折点的高灵敏度生物传感器。

光纤耦合器通过两根光纤互相缠绕后高温熔融拉伸，实现光功率在两根光纤波导之间的耦合传递，可通过控制过渡区形状和腰区直径实现高阶模式传输的抑制，从而控制耦合器中传导模式的数目。

图1是本发明提出的微纳光纤耦合器DNA传感器结构示意图，其中包含一个均匀腰区，两个锥形过渡区，输入端口P1和P2，输出端口P3和P4。当偶模和奇模沿着光纤耦合器进行传输时发生能量交换，因此在输出端可以观测到干涉谱线，干涉谱线取决于外界折射率的变化，通过检测波峰或波谷的偏移可以对外界折射率的变化进行检测。根据重叠积分理论，耦合器中两个熔融连接在一起的两根微纳光纤可以视为一种新的波导。当TE/TM偏振的入射光照射到输入端口P1或P2时在该波导中会同时激励起偶模和奇模，输出端口的能量可以表示如下：

式中

β

利用上述公式(4)得到外界折射率产生的灵敏度为：

Δn

发明步骤：

步骤一、根据需求利用数值仿真软件与解析解结合的方法，以溶剂折射率为参考，计算不同耦合器光纤直径和工作波长下转折点附近的灵敏度曲线；

步骤二、利用热熔融拉伸方法对两根光纤进行拉伸，通过控制气体流量、电机速度等参数得到所需直径的光纤耦合器；

步骤三、将光纤耦合器固定在样品池上，通过生物修饰在光纤表面附着一层表面修饰基团，然后固定探针单链DNA。

将不同浓度的目标单链DNA溶液或者目标RNA溶液，加注到样品池上，使用上述方法制备的光纤耦合器，通过峰值波长的移动确定溶液的浓度，并可以实时观察DNA或者RNA杂交过程。

图2为光纤DNA传感器表面修饰示意图，其中，1为多聚赖氨酸PLL，2为探针单链ssDNA，3为目标DNA；微纳光纤耦合器表面功能化的生物敏感膜，具有特异性的识别能力，可以与生物分子发生吸收、吸附等反应，引起传感器表面折射率的变化，通过测量峰值波长移动，可以检测出所需生物样品中的信息。本专利采用多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)吸附法实现微纳光纤耦合器生物传感实验。PLL是一种富含氨基(-NH2)的粘性分子，等电点为10.5，氨基易质子化带有正电荷，能够通过静电作用与阴离子相互吸引。DNA分子中含有大量的磷酸基团，环境pH小于其等电点时，磷酸基团会电离出H+而使DNA带负电。并且由于光纤表面本身带负电荷，微纳光纤耦合器传感器直接浸泡在多聚赖氨酸溶液(0.1％w/v)中1小时，与离子水清洗2-3次，然后浓度为100nM的探针单链DNA溶液中浸泡1小时，之后与目标单链DNA杂交。类似的，本实施例中方法也可以适用于RNA的检测和观察。

本发明具有如下优点：

基于光纤耦合器和光纤解波分复用器的阵列化生物检测方法利用光纤耦合器的多路特性、光纤解波分复用器的多波长分路处理能力以及光纤可阵列化组装、光纤端面易表面处理的特点，可实现高灵敏度，高特异性多餐量同时检测。传感单元阵列化，激发单元、检测单元一体化的结构特点可有效减小阵列检测系统体积大、器件重复利用的劣势，提高检测系统原位和活体检测的能力。

实施例

本实施例中用到的探针ssDNA为：

5’-CGCTGAGGAACGCATAACGTT-3’，

目标ssDNA为：5’-AACGTTATGCGTTCCTCAGCG-3’。

1.微纳光纤耦合器的制作

以水(折射率n＝1.33)为溶剂，通过COMSOL仿真计算得到不同直径和波长下灵敏度的实验曲线如图3所示，选择光纤耦合器直径为1μm。

取两根单模光纤，在每根光纤的中间利用光纤剥皮钳剥除30mm的保护层，用酒精棉将光纤包层清洗干净；将上述处理好的光纤分别固定到可移动的V型槽内，并将两根光纤打结在一起，利用氢氧焰对光纤进行加热并通过V型槽对光纤施以轴线拉力，通过控制氢气流量、电机速度、火焰头尺寸等参数实现直径为1μm的光纤耦合器的拉制；将拉制好的光纤耦合器固定在样品池上备用。

2.DNA生物传感器的实验

将传感器固定在PMMA样品池上，宽谱光源产生的光进入微光纤耦合器的输入端口P1或P2，耦合器的输出端口P3或P4连接光谱仪，通过改变不同浓度的DNA溶液引起光纤传感器表面有效折射率的改变，耦合器的谐振波长发生偏移，从而通过探测光谱仪的波长移动实现不同浓度DNA溶液的检测。

实验步骤如下：

1)微纳光纤耦合器直接浸泡在多聚赖氨酸(PLL)(0.1％w/v，去离子水)溶液中1小时，然后用去离子水清洗2-3次；

2)浓度为100nM的探针单链DNA溶液中浸泡1小时，并清洗2-3次；

3)不同浓度的目标DNA溶液加注到样品池上，并实时监测光谱曲线；

4)重复性实验中利用磷酸盐缓冲液(PBS)和十二烷基硫酸钠(SDS)混合溶液(0.1％w/v，95℃)反复清洗3次，然后用去离子水进行清洗，光纤耦合器传感器可以重复使用。

图4是不同浓度DNA溶液对应的波长移动示意图，不同浓度的DNA溶液对应不同的波长峰值，随着浓度的增加发生红移。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。