一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e及其逆转录引物、扩增引物和应用

摘要

本发明公开评估冠心病预后分子标志物miR‑302e及其逆转录引物、扩增引物和应用，评估冠心病预后分子标志物miR‑302e核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，逆转录引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物为序列表中SEQ ID No.3和SEQID No.4所示，评估冠心病预后分子标志物miR‑302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。miR‑302e作为评估冠心病预后新的分子标志物，可评估冠心病预后，并对冠心病患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是冠心病上的一大创新，经济和社会效益巨大。

说明书

技术领域

本发明涉及心血管病分子生物学技术领域。具体地说是一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e及其逆转录引物、扩增引物和应用。

背景技术

目前心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)已成为我国城乡居民第一大死亡原因，2016年统计表明CVD死亡率仍居各病之首，高于肿瘤及其他疾病，农村为45.01％，城市为42.61％，且我国CVD患病率及死亡率仍处于上升阶段。

微小RNA(microRNA或miRNA)是一类约22个核苷酸组成的小分子非编码RNA，通过与靶基因转录生成的mRNA 3’端非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)结合后，于转录后水平调控该基因的表达及功能，广泛参与各种生理病理过程。miRNAs在心血管疾病中的表达、功能、作用机制研究是近年来国内、外学者关注的热点。

研究发现微小RNA-302e(miR-302e)在血小板、血浆中均高表达，主要参与调控血小板、内皮细胞功能，在血栓性CVD的发生、发展的病理生理过程中起着非常重要的作用，可作为评估血小板活化以及抗血小板药物疗效及冠心病(coronray heart disease，CHD)预后的新型生物学标记物。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供评估冠心病预后分子标志物miR-302e及其逆转录引物、扩增引物和应用，可有效解决制备评估冠心病预后的试剂盒的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e，为非编码RNA，其转录本长度为17个核苷酸，该核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e的逆转录引物，逆转录引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示。

一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e的扩增引物，扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物为序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，所述的评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e的逆转录引物、上述特异性扩增引物、内参基因U6表达的特异性扩增引物序列，其上游引物和下游引物序列为序列表中SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6、从血浆中提取miRNA以及进行逆转录和荧光定量PCR的试剂。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，所述的评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：

(1)从冠心病或健康者中抽提总RNA所用试剂：包括Trizol液20mL、氯仿80mL、异丙醇80mL、抑制RNA降解溶剂40mL、体积分数为75％的乙醇30mL，DEPC水10mL；

(2)以总RNA为模板进行逆转录所用试剂：包括评估冠心病预后分子标志物miR-302e的逆转录引物：浓度为10μM，30μL；内参基因U6的下游引物：浓度为10μM，30μL；逆转录反应缓冲液5×RT Buffer 150μL；逆转录酶M-MLV浓度200U/μL，50μL；

(3)将cDNA实时定量PCR：包括miRNA-302e实时荧光定量PCR特异性引物：浓度均为3μM，各25μL；内参基因U6表达的特异性扩增引物：浓度均为3μM，各25μL；实时荧光定量SYBR染料SYBR Green qPCR Mix 500μL；无RNA酶的水25μL。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法为：

(1)血浆RNA的抽提；

(2)miRNA-302e RNA的逆转录；

(3)利用miRNA-302e的特异性引物进行实时定量PCR；

(4)miRNA-302e表达量的数据分析：采用相对定量方法2^-△△Ct法。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，在步骤(1)中：

(1-1)取100μL血浆加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，充分混合均匀；

(1-2)室温放置5分钟，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡30秒，然后再12000转/分钟离心10分钟；

(1-3)取上层水相于一新的EP管中，加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀；室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟；

(1-4)小心地弃去上清液，加入1mL的体积分数为75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟；重复操作一次；

(1-5)弃去上清液，室温或真空干燥5～10分钟；用50μL DEPC水将RNA溶解；

(1-6)RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μL RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好；最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，在步骤(2)中，使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒进行miRNA-302e RNA的逆转录：

(2-1)去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RT Buffer、DEPC水在温度为15-25℃条件下解冻，解冻后迅速置于冰上；使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底；RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却；按0.5μg的Total RNA，2μL的5×gDNA Eraser Buffer和DEPC-treated Water补充到总体积10μ在冰上配制反应混合液，最后加入RNA样品；

(2-2)在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟；迅速置于冰上放置备用；

(2-3)逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应；逆转录体系包括：4μL的5×RT Buffer；浓度为10μM体积为1μL的目的基因miRNA-302e逆转录引物或内参基因U6下游引物；2μL的BeyoRT

(2-4)42℃孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上；

(2-5)得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。

上述评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，在步骤(3)中：

(3-1)融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast

(3-2)冰浴上设置PCR反应体系，PCR反应体系包括：BeyoFast

(3-3)用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底；

(3-4)将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应；PCR反应的程序为：

a.预变性：95℃2分钟；b.变性：95℃15秒；c.退火/延伸：60℃30秒；d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；e.熔解曲线分析：95℃15秒,60℃15秒，95℃15秒；f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。

本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

本发明miR-302e是一种非编码RNA，可有效用于制备评估冠心病预后的试剂盒，miR-302e作为评估冠心病预后新的分子标志物，可及时评估冠心病预后，并及时对冠心病患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是冠心病上的一大创新，经济和社会效益巨大。

通过研究证实miRNA-302e在冠心病中表达下调，低表达miRNA-302e的冠心病患者，其复发率更高。因此，通过检测冠心病患者血浆中miRNA-302e的表达水平，可以对冠心病患者做出预后检查诊断，准确率高达93％以上，并进行及时治疗，降低患者复发率和生存质量，具有深远的临床应用意义和推广应用价值，经济和社会效益巨大。

附图说明

图1本发明实时荧光定量PCR分析miR-302e在健康者与冠心病患者血浆中的表达差异图；

图2为本发明实时荧光定量PCR分析冠心病患者血浆中低表达miR-302e组和高表达miR-302e组在复发率的差异图。

具体实施方式

实施例1、评估冠心病预后分子标志物miR-302e

评估冠心病预后分子标志物miR-302e，为非编码RNA，其转录本长度为17个核苷酸，该核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：UAAGUGCUUCCAUGCUU。

实施例2、该评估冠心病预后分子标志物miR-302e在制备评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。

所述的评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：评估冠心病预后分子标志物miR-302e的逆转录引物，序列为SEQ ID No.2、特异性扩增引物，引物序列为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4、内参基因U6表达的特异性扩增引物序列，其上游引物和下游引物序列为序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、从血浆中提取miRNA以及进行逆转录和荧光定量PCR的试剂。

逆转录引物，SEQ ID No.2：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGCATGGAAGCACTTA

特异性扩增引物，上游引物SEQ ID No.3：

TAAGTGCTTCCATGCTTGTCGTA。

特异性扩增引物，下游引物SEQ ID No.4：

AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

内参基因U6，上游引物SEQ ID No.5：CTCGCTTCGGCAGCACA。

内参基因U6，下游引物SEQ ID No.6：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

评估冠心病预后实时荧光定量PCR检测试剂盒中，包括如下(用于30次反应)：

(1)从冠心病或健康者中抽提总RNA所用试剂：包括Trizol液20mL、氯仿80mL、异丙醇80mL、抑制RNA降解溶剂40mL、体积分数为75％的乙醇30mL，DEPC水10mL；

(2)以总RNA为模板进行逆转录所用试剂：包括评估冠心病预后分子标志物miR-302e的逆转录引物：浓度为10μM，30μL；内参基因U6的下游引物：浓度为10μM，30μL；逆转录反应缓冲液5×RT Buffer 150μL；逆转录酶M-MLV 50μL；

(3)将cDNA实时定量PCR：包括miRNA-302e实时荧光定量PCR特异性引物：浓度均为3μM，各25μL；内参基因U6表达的特异性扩增引物：浓度均为3μM，各25μL；实时荧光定量SYBR染料SYBR Green qPCR Mix500μL；无RNA酶的水25μL。

血浆样本miRNA-302e的检测方法：

1、收集待测冠心病患者或健康者血浆，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、血浆RNA的抽提：

(1)取100μL血浆加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，充分混合均匀。

(2)室温放置5分钟，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡30秒。12000转/分钟离心10分钟。

(3)取上层水相于一新的EP管中(勿中间的沉淀层和下层液混入)，加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。

(4)小心地弃去上清液，加入1mL的75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。

(5)弃去上清液(尽量将残余液体除去)，室温或真空干燥5～10分钟(注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度)。用50μL DEPC水将RNA溶解。

(6)RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μL RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0之间认为RNA纯度很好。最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。

3、miRNA-302e RNA的逆转录：使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒(D7170S)。具体步骤如下。

(1)去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RT Buffer、DEPC-treated Water在室温(15～25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

表1

(2)在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。

(3)逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。

表2

(4)42℃孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。

(5)得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。

4、利用miRNA-302e的特异性引物进行实时定量PCR：特异性引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，包括用于检测miRNA-302e表达的特异性引物，引物序列为SEQID NO.3、SEQ ID NO.4，以及内参基因U6表达的引物序列，引物序列为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6。实时定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast

(1)融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast

(2)冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)，如表3所示；并以内参基因U6为参照，如表4所示。

表3

表4

(3)通常DNA模板的量以1～10ng cDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2～0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10％。96孔板的推荐反应体系为20μL，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。

(4)用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

(5)将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。

(6)PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以伯乐CFX96荧光定量PCR仪为例：

a.预变性：95℃2分钟

b.变性：95℃15秒

c.退火/延伸：60℃30秒

d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环

e.熔解曲线分析(可选)：95℃15秒,60℃15秒,95℃15秒

f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果

三步法只需在退火/延伸后加一步72℃30秒，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。

5、miRNA-302e表达量的数据分析：

本实验数据纳入60例冠心病患者及60例健康者血浆。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^-△△Ct法。具体如下：

首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组血浆样本中的目的基因miRNA-302e的Ct值减去自身内参基因U6的Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct＝Ct(目的基因miRNA-302e)-Ct(内参基因U6)；

然后，将每一组血浆样本每一个目的基因miRNA-302e的△Ct都算好。用本次实验中冠心病患者血浆样本的△Ct减去健康组血浆样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△Ct。

最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。冠心病患者的血浆中miRNA-302e的表达量比健康组低(见图1)，差异具有统计学意义(p＜0.05)。

6、通过对上述实验所纳入的60例冠心病患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况等，随访时间为至少12个月。在所选取的冠心病患者中，选取荧光实时定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与健康者相比较。冠心病患者血浆中miRNA-302e表达低于健康者血浆中的定义为miRNA-302e低表达组，高于的为高表达组。通过分析，miRNA-302e低表达患者复发数量比miRNA-302e高表达组的患者明显高

(见图2)，差异具有统计学意义(p＜0.05)。因此，miRNA-302e可作为冠心病患者预后的特异性分子标志物。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

序列表

<110> 河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）

<120> 一种评估冠心病预后分子标志物miR-302e及其逆转录引物、扩增引物和应用

<141> 2021-01-20

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaagugcuuc caugcuu 17

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaagcat ggaagcactt 60

a 61

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagtgcttc catgcttgtc gta 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacgcttcac gaatttgcgt 20