一种靶向治疗易损斑块的相变型多模态纳米造影剂

摘要

本发明公开了一种靶向治疗易损斑块的相变型多模态纳米造影剂，包含壳膜和被壳膜包裹的核心，所述壳膜为PLGA‑PEG‑PLGA，所述核心为PFH和Fe3O4，所述壳膜上连接有CS(壳聚糖)，CS上连接有DS(硫酸葡聚糖)，该多模态纳米造影剂对易损斑块显示出显著的靶向治疗作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药及诊断领域，具体涉及一种相变型靶向治疗易损斑块多模态纳米造影剂。

背景技术

心血管疾病是全球范围内主要的死亡原因，绝大多数心血管事件(例如中风和心肌梗塞)是由高危易损的动脉粥样硬化斑块破裂引起的。当前的动脉粥样硬化斑块的临床治疗主要包括改变生活方式，降低胆固醇的药物，血压监测，抗血栓药物和外科手术，目前尚无针对高危易损斑块的特异性治疗方法，也没有可用的临床方法可以评估斑块的易损性，并在心血管事件发生之前特异性治疗易损斑块。

巨噬细胞与斑块炎症密切相关，与稳定斑块相比，易损斑块中含脂质巨噬细胞的数量明显增加，可以用作治疗靶点，对有破裂风险的易损斑块进行特殊治疗，减少严重的心血管和脑血管疾病的发生。目前，用于诱导巨噬细胞凋亡的大多数方法是药物，但是基于药物的方法的作用相对较慢且可控性较差。

本发明人的课题组曾利用LIFU辐照引起的ADV(声滴汽化)治疗另一种血管性疾病——血栓，如CN109316608A公开的方法，并深入探讨了治疗的机理和功效。结果显示ADV可以引起一系列活跃的物理过程，例如振荡、膨胀、收缩、塌陷，同时在声波作用下会在液体中产生微小气泡，从而引起发光和次谐波的现象，导致血栓内部损坏，导致血栓松动并提高后续溶栓治疗的功效。但如果将该溶栓的方法直接用于斑块，产生斑块内部结构的破坏和斑块的结构松散，会增加斑块破裂和导致栓塞的风险，反而加速疾病的发展。从理论上讲，ADV可通过破坏巨噬细胞的超微结构，从而诱导巨噬细胞凋亡来治疗易损斑块，但ADV对于易损斑块是一把双刃剑，如何调整ADV的治疗条件，使其能够诱导巨噬细胞可控的凋亡以稳定和消减斑块而非引起巨噬细胞大量坏死导致斑块破裂，是至关重要的问题。

通过分子靶向技术使用分子影像学可以准确确定斑块的组成和活性，并具有识别易损和高风险斑块的潜力。超声影像学，对血管疾病的成熟应用是成像，可以有效地诊断和评估动脉壁病变。然而，难以检测深部和小血管结构中的斑块并用US确定斑块的组成。磁共振成像(MRI)具有较高的软组织分辨率的优势，多参数和多方向成像可用于定性和定量分析，甚至用于深、小的血管结构，以弥补这一不足。MR分子影像学具有安全、无放射性、不用碘对比剂、多平面成像、高组织分辨力、可重复检查等优点，使得动脉粥样硬化斑块的无创影像学研究取得飞速进展。

载药系统的独特优势之一是能将多种功能整合到一个体系中，能确保疾病的“诊疗一体化”。目前国内外关于易损斑块诊疗一体化的分子影像探针报道甚少，本发明尝试利用纳米粒同时实现对动脉粥样硬化易损斑块的诊断及治疗，在早期检测的同时实施靶向治疗，有效稳定斑块，抑制其进一步进展恶化。

CN110404082A 1公开一种超声相变型双模态显像纳米造影剂，包括壳膜及包裹其中的核心，核心包括Fe

CN109316608A一种低强度聚焦超声响应型相变溶栓纳米粒，包括壳体聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，壳体上嵌入有四氧化三铁(Fe3O4)，壳体内包裹有全氟己烷PFH，壳体上连接有用于靶向纤维蛋白的CREKA多肽。解决现有技术中载药纳米粒因载药量受限或者药物失活而造成溶栓效果不佳的问题。但本发明人发现，该相变溶栓纳米粒溶栓的治疗条件及机制若用于斑块治疗时容易导致斑块破裂，造成血管栓塞，加剧病情进展。

为此，本发明人提供了一种新的治疗易损斑块的纳米造影剂，利用低强度聚焦超声(LIFU)辐射引起的声滴汽化(ADV)效应，它具有强大的组织穿透能力，能够诱导易损斑块中的巨噬细胞凋亡，并达到特异性物理治疗易损斑块，在此基础上研究不同LIFU辐照强度治疗易损斑块的效应，实现对易损斑块安全有效的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向治疗易损斑块的相变型多模态(NIRF/MR)纳米造影剂，该造影剂通过NIRF及MRI可用于诊断动脉粥样硬化斑块及治疗进展的监测，同时可对易损斑块产生治疗作用。

为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

在一实施方案中，本发明的一种靶向治疗易损斑块的相变型多模态纳米造影剂(Fe-PFH-P/CS-DS)，包含壳膜和被壳膜裹的核心，所述壳膜为PLGA-PEG-PLGA，所述核心为PFH及Fe3O4，其特征在于：所述壳膜上连接有CS(壳聚糖)，CS上连接有DS(硫酸葡聚糖)。

在上述实施方案中，本发明的纳米造影剂，PLGA-PEG-PLGA与CS的重量比为PLGA-PEG-PLGA：CS＝5：6，PLGA-PEG-PLGA与的Fe

在上述实施方案中，本发明的纳米造影剂，其造影剂的纳米粒径为250～260，优选为255.9±2.95nm；其造影剂的电位为-15～-20，优选为-16.32±0.96mV。

本文中，Fe-PFH-P/CS-DS为靶向治疗易损斑块的相变型多模态(NIRF/MR)纳米造影剂的示意化学结构，其中Fe代表Fe

在上述实施方案中，本发明的纳米造影剂，其壳膜上可进一步连接药物、核酸或基因。

另一实施方案中，本发明还提供了一种靶向治疗易损斑块的相变型多模态(NIRF/MR)纳米造影剂剂的制备方法，包括：

1)制备Fe(Fe

2)将PVA溶液和CS溶液混合作为外水相，将上步的内水相倒入所述外水相中进行乳化，生成棕色溶液；

3)在棕色溶液中加入异丙醇，连续搅拌，直到Fe-PFH-P/CS纳米粒的表面固化和有机溶剂完全挥发；

4)Fe-PFH-P/CS纳米粒溶解在水中形成分散液，在冰浴下加入DS，通过静电吸附作用生成Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒。

上述本发明的制备方法，步骤2)中，所述PVA溶液为浓度为4％的PVA水溶液；所述CS溶液为浓度为2％的CS稀醋酸溶液，其中，溶剂为浓度为3％的稀醋酸；步骤3)中，所述异丙醇与水的混合溶剂，其异丙醇的体积百分比为2％。

本发明构建了一种用于特异性靶向巨噬细胞表面SR-A的的纳米粒，该纳米粒壳材料中引入PEG，减少RES系统对纳米粒的吞噬，延长纳米粒的血循环半衰期，有利于对血管性疾病(动脉粥样硬化斑块、血栓)的靶向；同时携带PFH，在纳米粒靶向至易损斑块的巨噬细胞并被巨噬细胞内吞后，通过一定条件的LIFU辐照诱导纳米粒中的PFH发生液—气相变，实现纳米粒在巨噬细胞内部的定点治疗作用，通过影响细胞内外的渗透压、线粒体损伤等机制诱导巨噬细胞的可控性凋亡，达到稳定易损斑块的效果；通过LIFU辐照强度的探索，确定了2.5W/cm

本发明的靶向治疗易损斑块的相变型多模态(NIRF/MR)纳米造影剂的有益效果(即相比于现有技术的优点)

1.利用载药系统上携带的DS靶向巨噬细胞表面的SR-A，实现对易损斑块的特异性诊断，识别富含巨噬细胞的高危易损斑块，从分子及细胞水平实现对易损斑块的诊断，弥补了传统影像学只能评估斑块引起的管腔狭窄程度而不能判定斑块组分的缺陷。

2.利用PFH的ADV效应，通过LIFU辐照条件的调整，诱导巨噬细胞的可控性凋亡，在稳定易损斑块的同时对斑块还有一定的消减作用，避免因斑块破裂导致的急性心脑血管疾病，并能一定程度缓解因血管狭窄引起的一些临床症状，相比药物治疗及手术治疗来说，该种物理疗法疗效确切、操作简单、安全可控、创伤性小。

3.借助NIRF/MR分子影像学实现对易损斑块的特异性的诊断，并可实时监测PFH的ADV效应对易损斑块的疗效，实现对易损斑块的诊疗一体化。

附图说明

图1为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒形态图，其中，a为纳米粒扫描电镜图，b为DiI红染的纳米粒的激光共聚焦扫描图，c为纳米粒透射电镜图，证实Fe

图2为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的元素映射图，其中，a、b、c、d分别为高分辨透射电镜所示纳米粒的F、S、Fe和F+S+Fe的元素映射图，表明含F元素的PFH及含Fe元素的Fe

图3为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的元素线扫映射图；

图4为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒放置7天的粒径及外观图；

图5为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的超声成像图；

图6为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的声强度定量图；

图7为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的不同时间点相变光镜图；

图8为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的不同时间点相变温度定量图；

图9为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的NIRF成像图；

图10为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的MR成像图；

图11为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在不同时间点靶向巨噬细胞激光共聚焦扫描图；

图12为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在不同时间点纳米粒靶向巨噬细胞扫描电镜图；

图13为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在不同时间点巨噬细胞内吞纳米粒及纳米粒在细胞内的分布图(透射电镜图)；

图14为巨噬细胞对本发明的Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒和非靶向纳米粒的摄取对比激光共聚焦扫描图；

图15a为不同浓度的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒对巨噬细胞毒性影响图；

图15b为Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在辐照与非辐照条件下与对照组对比ADV效应对巨噬细胞活性的影响图；

图16为流式细胞仪测试Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在辐照与非辐照条件下与对照组对比ADV效应对巨噬细胞活性的影响图；

图17为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒与巨噬细胞孵育4小时后，经不同强度LIFU辐照后细胞活死染色荧光图；

图18为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒与巨噬细胞孵育4小时后，经不同强度LIFU辐照后细胞形态变化扫描电镜图；

图19为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒与巨噬细胞孵育4小时后，经不同强度LIFU辐照后细胞内部结构变化透射电镜图；

图20为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒经LIFU辐照后细胞促炎及抗炎因子变化图；

图21中a图为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P/CS非靶向纳米粒对C57小鼠及apoE-/-小鼠主动脉斑块靶向对照切片图，b图Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒靶向主动脉斑块切片免疫组化图；

图22为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒靶向apoE-/-小鼠主动脉斑块并经不同LIFU强度辐照后切片图；

图23中，a图为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P/CS非靶向纳米粒于apoE-/-小鼠体内主动脉荧光成像(NIRF)；b图各主要脏器离体荧光成像；c图小鼠体内主动脉荧光成像定量图；d图各主要脏器离体荧光成像定量图；

图24为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P/CS非靶向纳米粒于apoE-/-小鼠体内主动脉MR成像，a图为定位相，b图为Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P/CS非靶向纳米粒于不同时间点对升主动脉斑块的MR成像对比；

图25为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒应用于apoE-/-小鼠体内斑块治疗效果图：其中，a图为治疗示意图；b图治疗组主动脉大体纵剖图油红O染色；c图为对照组主动脉大体纵剖图油红O染色；d图为治疗组及对照组主动脉管腔狭窄程度变化定量分析；

图26为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒应用于apoE-/-小鼠体内斑块治疗效果横断面切片油红O染色图；

图27为本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒对C57小鼠的体内毒性分析。

具体实施方式

以下实施例仅是代表性的，用于进一步说明和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1超声相变型溶斑块纳米造影剂的制备

将50mg PLGA-PEG-PLGA添加到2mL二氯甲烷中后，添加100μL Fe

纳米造影剂理化性质表征：

为了表征Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒造影剂，在其制备过程中，在第一步制备Fe-PFH-P纳米粒工艺中，当PLGA-PEG-PLGA溶解在二氯甲烷中时，用DiI或DiR对纳米粒进行荧光染色标记。整个制备过程在4℃的冰水浴中进行。最后，将制备好的Fe-PFH-P(DiI或DiR)/CS-DS纳米粒用双蒸水洗涤3次，以除去未结合的物质，稀释至10mL(浓度为5mg/mL)并在4℃下保存以备后用。

用激光粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments，Ltd.，Worcs，UK)检测纳米粒的的大小，多分散指数(PDI)和Zeta电位。使用原子吸收光谱仪(Hitachi Z-5000型，日立株式会社，东京，日本)分析纳米粒的Fe

图1-4结果：通过显微镜观察，本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(即纳米造影剂)呈表面光滑、粒径较均一的球形，透射电镜显示Fe

实施例2体外实验

纳米粒超声成像：

将Fe-P/CS-DS和Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(5mg/mL)放入凝胶模具中，并用LIFU仪器(海夫医疗技术有限公司，重庆，中国)在2.5W/cm

图5-8的结果表明：和不含PFH的Fe-P/CS-DS相比，本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在B型超声成像模式下，在各个时间点(0、2、5、10、20分钟)都显示出了更强的声强，在对比增强超声(CEUS)模式下，于10分钟时，本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒显示出了更强的声强；光镜显示随时间延长，纳米粒相变越发明显，于10分钟时最明显，而20分钟时部分相变纳米粒发生爆破，导致纳米粒数量减少，这和纳米粒相变引起的超声成像声强变化趋势是一致的；整个过程最高温度为33℃，说明这不会导致由过高温度诱发的组织损伤。

纳米粒近红外荧光(NIRF)成像：

将Fe-PFH-P(DiR)/CS-DS纳米粒稀释至不同浓度(0、2、4、6、8、10mg/mL)；抽取每个样品200μL放在96孔板中，获取NIRF图像；使用Living Image 5.0软件测量荧光强度。结果见图9。

图9结果：随着本发明的纳米粒浓度逐渐增高，荧光成像强度逐渐增强，但当Fe-PFH-P(DiR)/CS-DS纳米粒浓度大于8mg/mL时，发生了自淬灭现象，荧光强度反而降低，这表明Fe-PFH-P(DiR)/CS-DS纳米粒可以在浓度低于8mg/mL时用作有效的NIRF造影剂。

纳米粒MR成像：

将Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒与1％琼脂溶液混合以产生不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL)的纳米粒，使用7.0T MRI扫描仪(BioSpec 70/20USR，布鲁克，莱比锡，德国)小鼠线圈，进行T2*加权成像。数据传输到ADW4.6图像工作站，并且Research R2*软件包用于测量R2*值，获得纳米粒MR成像图，结果见图10。

图10的结果表明：本发明的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒可有效降低T2*信号，为很好的磁共振负性对比剂。

体外细胞摄取：

将LPS激活的RAW 264.7细胞与Fe-PFH-P(Dil)/CS-DS纳米粒(1mg/mL)孵育不同时间(0.5、2和4小时)。将细胞用PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤，再用DAPI染色10分钟，通过CLSM观察RAW 264.7细胞，并使用ImageJ计算荧光定量图，结果见图11，说明随着孵育时间延长，越来越多的纳米粒靶向至巨噬细胞并被巨噬细胞内吞；将激活的RAW 264.7细胞与非靶向纳米粒Fe-PFH-P(DiI)/CS孵育4小时作为对照组，观察巨噬细胞对靶向和非靶向纳米粒摄取的差异，激光共聚焦扫描图结果见图14，表明相对非靶向纳米粒，本发明的靶向纳米粒能够更有效的靶向至巨噬细胞被被其内吞。将细胞用PBS洗涤3次并用胰蛋白酶消化，然后将细胞悬液置于1.5mL尖头的Eppendorf(EP)管中并离心成沉淀(1000rpm，5分钟)，用1mL 2.5％戊二醛固定液(4℃)固定，脱水，通过SEM(图12)和TEM观察细胞(图13)，以观察RAW 264.7细胞对Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒对的摄取机制，SEM显示在0.5小时，大量呈球形的纳米粒靶向至巨噬细胞表面，在2小时及4小时，可观察到由于巨噬细胞吞噬纳米粒引起的细胞膜内陷；TEM显示内吞后的纳米粒主要分布于细胞质中的内吞囊泡中，且随时间延长内吞的纳米粒越多。

ADV效应对细胞的毒性：

用CCK-8法评估不同浓度Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL纳米粒)与RAW 264.7细胞孵育不同时间后(4、12及24小时)对的细胞的毒性，结果见图15a，显示不同浓度的纳米粒和RAW 264.7细胞孵育不同时间后，其细胞活性始终维持在高水平，表明本发明的纳米粒本身对细胞的毒性是微小的。为了验证RAW 264.7细胞中内吞的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒的相变以及ADV对细胞活性的影响，将细胞随机分为六组(用新鲜培养基处理的对照组，仅使用LIFU组，仅用Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒处理组，Fe-PFH-P/CS纳米粒联合LIFU辐照处理组，Fe-P/CS-DS纳米粒联合LIFU辐照组和Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒联合LIFU辐照组，纳米粒的浓度均为1mg/mL，用量100μL)，孵育4小时后，用LIFU以2.5W/cm

为了探讨不同强度的LIFU照射引起的ADV效应对细胞活性的影响，将与Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(1mg/mL)孵育4小时的细胞进行不同强度的LIFU(0、0.5、2.5、4W/cm

将RAW 264.7细胞与Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(1mg/mL)孵育4小时后，再用不同的LIFU强度(0、0.5、2.5、4W/cm

将RAW 264.7细胞接种在96孔板中，随机分为4组(对照组、Fe-PFH-P/CS组、Fe-P/CS-DS组和Fe-PFH-P/CS-DS组)。将新鲜培养基添加至对照组(100μL/孔)。将Fe-PFH-P/CS、Fe-P/CS-DS和Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(1mg/mL，100μL/孔)分别与细胞孵育4小时，用LIFU以2.5W/cm

实施例3动物实验

斑块模型建立及靶向评估：

通过高脂喂养建立apoE-/-小鼠主动脉易损斑块模型。为了验证Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒在离体斑块上的靶向作用，选择正常C57小鼠作为对照组，apoE-/-模型小鼠作为实验组。将非靶向纳米粒(Fe-PFH-P/CS)和靶向纳米粒(Fe-PFH-P/CS-DS)与离体的C57小鼠主动脉及apoE-/-小鼠主动脉孵育4小时，用普鲁士蓝染定位巨噬细胞中含铁的纳米粒。免疫荧光染色检测巨噬细胞。结果见图21。图21a显示在apoE-/-模型小鼠主动脉斑块区域，可见大量含Fe被蓝染的Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒，而其余对照组中未见明显蓝染纳米粒；图21b显示Fe-PFH-P(DiI)/CS-DS纳米粒(红色荧光)与巨噬细胞(绿色荧光)的共定位。巨噬细胞细胞核(蓝色荧光)周围可见红色荧光的纳米粒，部分纳米粒向斑块内部渗透。

ADV效应对离体斑块的治疗作用：

将离体的apoE-/-小鼠主动脉与Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(5mg/mL)孵育4小时，用PBS冲洗后放置于琼脂糖模型中。用LIFU以0.5、2.5和4W/cm

apoE-/-小鼠体内NIRF和MRI成像：

NIRF成像，小鼠尾静脉注射200μL Fe-PFH-P(DiR)/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P(DiR)/CS非靶向纳米粒(8mg/mL)。通过空气栓塞在不同时间点(0、0.5、2、4小时)随机处死6只小鼠，并获得离体的主动脉的NIRF图像以证明靶向纳米粒Fe-PFH-P(DiR)/CS-DS的体内靶向分布。注射后24小时，处死小鼠并获取离体器官的荧光图像，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，结果见图23。

图23a显示随时间延长，靶向组中主动脉弓区域可见越发明显的红色荧光，说明靶向纳米粒聚集于此并有良好的NIRF成像效果，而在非靶向组中，这一效应并不明显，图23c为相应的荧光定量图；图23b显示在靶向及非靶向组中，发红色荧光的纳米粒都是主要聚集在肝脏及脾脏中，说明纳米粒在体内主要经肝脏及脾脏摄取代谢，图23d为相应的荧光定量图。

MR成像，小鼠尾静脉注射Fe-PFH-P/CS-DS靶向纳米粒及Fe-PFH-P/CS非靶向纳米粒(5mg/mL，200μL)，使用Bruker7.0 T MRI扫描仪获得0、0.5、2、4小时小鼠的T2*加权图像，在每个时间点观察T2*信号的变化和信号降低区域的面积，结果见图24。

结果显示依据图24a中定位相扫描小鼠升主动脉，随时间延长，Fe-PFH-P/CS-DS靶向组中主动脉上呈混杂信号的附壁斑块上有越来越多的呈低信号的纳米粒靶向，主动脉管腔内低信号区域逐渐扩大；而在非靶向组中，未观察到明显变化。

ADV效应对体内易损斑块的治疗：选取apoE-/-模型小鼠，治疗期间接受正常饮食。每5天用LIFU治疗小鼠，共4次。具体的治疗步骤如下：将小鼠麻醉并仰卧固定在无菌手术板上，并去除胸部和腹部的毛发。静脉注射200μL的Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(5mg/mL)。注射后4小时，使用LIFU在心脏上方区域以2.5W/cm

体内安全性评估：将Fe-PFH-P/CS-DS纳米粒(200μL，10mg/mL)经尾静脉注入C57小鼠体内。在不同的时间点(注射前和注射后1、5、7天)对3只小鼠实施安乐死，并收集0.8mL血液用于血常规分析和生化分析。收集小鼠的主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺和脑)并用4％多聚甲醛固定以进行H&E染色，结果见图27。结果显示各时间点的小鼠的血常规分析和生化分析各数值均在正常范围内；各脏器组织切片均未见明显异常改变，说明了该纳米粒的体内安全性。