一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法

摘要

本发明公开了一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，包括纯化培养、菌种选育和菌种保藏；所述纯化培养使用马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基；所述菌种选育的培养过程由恒温培养改为变温培养；所述菌种保藏采用甘油冷冻管超低温保藏法；培养基改进为使用马铃薯葡萄糖琼脂粉，培养基成分更稳定，且更方便操作；选育菌种的培养过程改进为28℃—28.5℃—29℃变温培养，利于菌株的生长及定向选育；菌种保藏上将平板放冰箱(4℃)保存3‑4天后再进行冷冻管(甘油管)制备，菌种表达更为稳定，利于获得稳定的高产菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体的说，尤其涉及一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法。

背景技术

柔红霉素(Daunorubicin，DNR)，又称道诺霉素(Daunomycin)，是从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)培养物中分离得到的一种蒽环类抗生素。化学名为：10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧基-α-L来苏己吡喃基)-氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-乙酰基-1-甲氧基-5，12萘二酮的盐酸盐。柔红霉素是上世纪八十年代意大利FarmitaliaCarloErba公司上市的抗生素类药物，DNR分子含多种功能基团，其糖苷配基(又称道诺霉酮Daunomycinone)是荧光发色团，环A处于半椅式构象，C8原子几乎伸出环平面外。配基为脂溶性，通过环上羟基与水溶性的氨基糖(道诺糖胺Daunosamine)相连接，氨基糖的氨基的碱性和配基上羧基的酸性使DNR分子呈两性。此外，分子又同时具有氧化和还原基团。所有这些化学特征使DNR在体内表现出复杂的生化效应，DNR广泛应用于癌症化疗，对多种实验肿瘤有显著疗效，如对小鼠艾氏腹水癌、肝癌AH130、大鼠骨髓瘤(腹水型)均有抑制作用；对艾氏腺癌(实体型)、肉瘤180、Walker 256瘤亦有抑制作用，临床上DNR主要用于治疗急性非淋巴细胞性白血病，对儿童白血病有良好的缓解作用，DNR的作用对象包括DNA、膜磷脂及蛋白质，DNR嵌入DNA分子，干扰复制与转录过程，并通过TopII媒介或氧自由基诱导DNA链断裂。DNR与膜磷脂作用影响胞内信息通路，与多种蛋白质间也存在相互作用，并诱导细胞凋亡。

随着时代的发展，人类对药品质量的要求越来越高，柔红霉素中杂质的毒性较强，所以原料的纯化成为制备柔红霉素的关键，特别是杂质B和柔红霉素的分子结构比其他杂质更接近，当基团R为-CHOH-CH3时为杂质B，当基团R为-CO-CH3时为柔红霉素，因此传统工艺中杂质B通常难以去除。根据欧洲药典EP6.0杂质B允许限度为1.5％，而其他杂质的允许限度为0.5％。传统工艺仅能使杂质B＜1.5％，鉴于杂质B毒性较强，其含量亦有待于降至0.5％以下。

目前，柔红霉素基因工程菌株的处理方法不能满足菌株在生产柔红霉素过程中对纯化、培养和保藏的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，包括纯化培养、菌种选育和菌种保藏；

所述纯化培养使用马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基；

所述菌种选育的培养过程由恒温培养改为变温培养；

所述菌种保藏采用甘油冷冻管超低温保藏法。

优选的，所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基包括以下质量份的原料：马铃薯200-210份、葡萄糖20-22份、琼脂15-20份、蒸馏水1000-1050份。

优选的，所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基制作方法为：按质量份称取蒸馏水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，然后将称取的马铃薯、葡萄糖、琼脂依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌53-57min，搅拌的同时进行超声波处理。

优选的，所述变温培养过程为：将菌种接种到所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基中，置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制分为前中后期且温度分别为28℃、28.5℃、29℃，培养直至单菌落的直径为0.8-1.0mm。

优选的，甘油冷冻管超低温保藏法步骤为：用无菌的接种环挑取菌种一环，划线于适宜的琼脂斜面上，置于28-29℃下培养10-12天，待菌落生长充分后，放置2-4℃下保存3-4天后进行冷冻管保藏。

有益效果：本发明的有益效果是：本发明提供的一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，培养基改进为使用马铃薯-葡萄糖琼脂粉，培养基成分更稳定，且更方便操作；选育菌种的培养过程改进为28℃—28.5℃—29℃变温培养，利于菌株的生长及定向选育；菌种保藏上将平板放冰箱(4℃)保存3-4天后再进行冷冻管(甘油管)制备，菌种表达更为稳定，利于获得稳定的高产菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

本实施例的一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，包括纯化培养、菌种选育和菌种保藏；所述纯化培养使用马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基；所述菌种选育的培养过程由恒温培养改为变温培养；所述菌种保藏采用甘油冷冻管超低温保藏法。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基包括以下质量份的原料：马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂15份、蒸馏水1000份。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基制作方法为：按质量份称取蒸馏水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，然后将称取的马铃薯、葡萄糖、琼脂依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌53min，搅拌的同时进行超声波处理。所述变温培养过程为：将菌种接种到所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基中，置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制分为前中后期且温度分别为28℃、28.5℃、29℃，培养直至单菌落的直径为0.8mm。甘油冷冻管超低温保藏法步骤为：用无菌的接种环挑取菌种一环，划线于适宜的琼脂斜面上，置于28℃下培养10天，待菌落生长充分后，放置2℃下保存3天后进行冷冻管保藏。

实施例2

本实施例的一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，包括纯化培养、菌种选育和菌种保藏；所述纯化培养使用马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基；所述菌种选育的培养过程由恒温培养改为变温培养；所述菌种保藏采用甘油冷冻管超低温保藏法。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基包括以下质量份的原料：马铃薯205份、葡萄糖21份、琼脂17.5份、蒸馏水1025份。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基制作方法为：按质量份称取蒸馏水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，然后将称取的马铃薯、葡萄糖、琼脂依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌55min，搅拌的同时进行超声波处理。所述变温培养过程为：将菌种接种到所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基中，置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制分为前中后期且温度分别为28℃、28.5℃、29℃，培养直至单菌落的直径为0.9mm。甘油冷冻管超低温保藏法步骤为：用无菌的接种环挑取菌种一环，划线于适宜的琼脂斜面上，置于28.5℃下培养11天，待菌落生长充分后，放置3℃下保存3.5天后进行冷冻管保藏。

实施例3

本实施例的一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，包括纯化培养、菌种选育和菌种保藏；所述纯化培养使用马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基；所述菌种选育的培养过程由恒温培养改为变温培养；所述菌种保藏采用甘油冷冻管超低温保藏法。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基包括以下质量份的原料：马铃薯210份、葡萄糖22份、琼脂20份、蒸馏水1050份。所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基制作方法为：按质量份称取蒸馏水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，然后将称取的马铃薯、葡萄糖、琼脂依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌57min，搅拌的同时进行超声波处理。所述变温培养过程为：将菌种接种到所述马铃薯葡萄糖琼脂粉培养基中，置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制分为前中后期且温度分别为28℃、28.5℃、29℃，培养直至单菌落的直径为1.0mm。甘油冷冻管超低温保藏法步骤为：用无菌的接种环挑取菌种一环，划线于适宜的琼脂斜面上，置于29℃下培养12天，待菌落生长充分后，放置4℃下保存4天后进行冷冻管保藏。

本发明提供的一种柔红霉素的高产基因工程菌株的处理方法，培养基改进为使用马铃薯-葡萄糖琼脂粉，培养基成分更稳定，且更方便操作；选育菌种的培养过程改进为28℃—28.5℃—29℃变温培养，利于菌株的生长及定向选育；菌种保藏上将平板放冰箱(4℃)保存3-4天后再进行冷冻管(甘油管)制备，菌种表达更为稳定，利于获得稳定的高产菌株。

以上所描述的实施例是本发明的优选实施方式，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。