一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基

摘要

本发明公开了一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基20‑40g/L，生长因子5‑15ng/mL，红茶菌发酵液8‑22mg/mL，血清蛋白质3‑20mg/mL，硒代蛋氨酸1‑10ng/mL，阿魏酸钠0.1‑0.4mg/mL，二甲双胍3‑8ng/mL，3'‑脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸5‑12ng/mL，L‑谷氨酰胺150mg/L‑550mg/L，复合维生素30‑110μM，胰岛素12mU/L‑24mU/L。本发明还提供了一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法及应用。本发明公开的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基生物安全性好，能有效提高人骨髓间充质干细胞的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，可及时准确的为医学科研教学及临床应用提供相关需要的骨髓间充质干细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

背景技术

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓基质的主要成份，为骨髓的造血功能提供结构和功能上的支持。这种干细胞是具有自我复制、多向分化潜能的成体干细胞。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时，MSCs还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。骨髓间充质干细胞能够促进造血系统的重建，具有有效的免疫调节功能，能够在体外抑制T-淋巴细胞增殖，延缓移植组织后出现的免疫排斥反应，还可以用于预防和治疗自体干细胞移植(ASCT)产生的移植物抗宿主疾病(GVHD)，避免在器官移植中产生免疫排斥反应，以及治疗自身免疫性疾病，如风湿性关节炎等。但是，骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，大约10

骨髓间充质干细胞的体外培养和扩增通常是在培养基中进行的，培养基的配方对骨髓间充质干细胞的体外培养和扩增的效果和效率影响较大。传统培养基依赖于动物血清，然而，动物血清生物安全性受到人们的普遍质疑。现有的无血清培养基都是在基础培养基上添加纯化的蛋白、激素、生长因子、微量元素、维生素等物质，其特点是化学成分明确，能较好地维持骨髓间充质干细胞的生长，保持骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。但是，这些无血清培养基均不能促进骨髓间充质干细胞贴壁。在体外培养时，骨髓间充质干细胞需要在含血清培养基中贴壁完全后，再更换成无血清培养基进行培养，这样会造成在培养基中残留一定量的动物血清，在严格的意义上说，并未达到真正的无血清培养，在临床应用中仍可能具有很大的风险。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供了一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，该无血清培养基生物安全性好，能有效提高人骨髓间充质干细胞的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，可及时准确的为医学科研教学及临床应用提供相关需要的骨髓间充质干细胞，抑制衰老凋亡，保持细胞稳定性。采用该培养基培养和扩增得到的骨髓间充质干细胞移植后的生存能力强，干性足。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案，一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基20-40g/L，生长因子5-15ng/mL，红茶菌发酵液8-22mg/mL，血清蛋白质3-20mg/mL，硒代蛋氨酸1-10ng/mL，阿魏酸钠0.1-0.4mg/mL，二甲双胍3-8ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸5-12ng/mL，L-谷氨酰胺150mg/L-550mg/L，复合维生素30-110μM，胰岛素12mU/L-24mU/L。

优选的，所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比(1-2):1:(0.8-1.2):2:(1-2)混合而成。

优选的，所述基础培养基为DMEM-F12。

优选的，所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:(2-4)的比例混合的。

优选的，所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:(1-3):(1-2):1:(2-3)混合而成。

优选的，所述红茶菌发酵液为按申请号201711050756.7的中国发明专利实施例1的配方和制备方法制成的红茶菌发酵液。

本发明的另一个目的，在于提供一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

本发明的再一个目的，在于提供一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明提供的一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，该制备方法工艺简单，无需专用设备，操作方便，可重复性好，制备周期短，无环境污染。

（2）本发明提供的一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，克服了传统培养基依赖于动物血清，然而，动物血清生物安全性受到人们的普遍质疑；现有的无血清培养基都是在基础培养基上添加纯化的蛋白、激素、生长因子、微量元素、维生素等物质，其特点是化学成分明确，能较好地维持骨髓间充质干细胞的生长，保持骨髓间充质干细胞的多向分化潜能；但是，这些无血清培养基均不能促进骨髓间充质干细胞贴壁。在体外培养时，骨髓间充质干细胞需要在含血清培养基中贴壁完全后，再更换成无血清培养基进行培养，这样会造成在培养基中残留一定量的动物血清，在严格的意义上说，并未达到真正的无血清培养，在临床应用中仍可能具有很大的风险的缺陷；通过各组分协同作用，使得制成的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基生物安全性好，能有效提高人骨髓间充质干细胞的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，可及时准确的为医学科研教学及临床应用提供相关需要的骨髓间充质干细胞，抑制衰老凋亡，保持细胞稳定性。采用该培养基培养和扩增得到的骨髓间充质干细胞移植后的生存能力强，干性足。

（3）本发明提供的一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，红茶菌发酵液的添加能为干细胞的培养和扩增提供充足的营养；与其它组分协同作用，能有利于细胞的生长和增殖，更有利于保持干性，使得细胞的稳定性好，有效抑制衰老凋亡。

（4）本发明提供的一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，硒代蛋氨酸、阿魏酸钠的添加，协同作用，可有效提高人骨髓间充质干细胞的生存能力和管腔形成能力，能提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效，改善细胞扩增速率和细胞干性。

（5）本发明提供的一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，二甲双胍、3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与生长因子的添加，协同作用，可以替代血清的功能，不需要预先在含血清培养基中先进行贴壁，而后更换无血清培养基，最大可能地减少了血清的残留，同时较好地维持了骨髓间充质干细胞的生长，保持了骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明产品作进一步详细的说明。

本实施例中所需原料均为商业购买；所述红茶菌发酵液为按申请号201711050756.7的中国发明专利实施例1的配方和制备方法制成的红茶菌发酵液。

实施例1

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基20g/L，生长因子5ng/mL，红茶菌发酵液8mg/mL，血清蛋白质3mg/mL，硒代蛋氨酸1ng/mL，阿魏酸钠0.1mg/mL，二甲双胍3ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸5ng/mL，L-谷氨酰胺150mg/L，复合维生素30μM，胰岛素12mU/L。

所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比1:1:0.8:2:1混合而成。

所述基础培养基为DMEM-F12；所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:2的比例混合的。

所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:1:1:1:2混合而成。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

实施例2

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基25g/L，生长因子8ng/mL，红茶菌发酵液12mg/mL，血清蛋白质8mg/mL，硒代蛋氨酸3ng/mL，阿魏酸钠0.2mg/mL，二甲双胍4ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸7ng/mL，L-谷氨酰胺250mg/L，复合维生素50μM，胰岛素17mU/L。

所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比1.3:1:0.9:2:1.3混合而成。

所述基础培养基为DMEM-F12；所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:2.5的比例混合的。

所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:1.5:1.3:1:2.3混合而成。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

实施例3

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基30g/L，生长因子10ng/mL，红茶菌发酵液16mg/mL，血清蛋白质13mg/mL，硒代蛋氨酸6ng/mL，阿魏酸钠0.25mg/mL，二甲双胍6ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸8ng/mL，L-谷氨酰胺350mg/L，复合维生素70μM，胰岛素19mU/L。

所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比1.5:1:1:2:1.5混合而成。

所述基础培养基为DMEM-F12；所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。

所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:2:1.5:1:2.5混合而成。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

实施例4

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基36g/L，生长因子13ng/mL，红茶菌发酵液21mg/mL，血清蛋白质18mg/mL，硒代蛋氨酸9ng/mL，阿魏酸钠0.35mg/mL，二甲双胍7ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸11ng/mL，L-谷氨酰胺450mg/L，复合维生素100μM，胰岛素22mU/L。

所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比1.8:1:1.1:2:1.8混合而成。

所述基础培养基为DMEM-F12；所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3.5的比例混合的。

所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:2.7:1.8:1:2.8混合而成。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

实施例5

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基40g/L，生长因子15ng/mL，红茶菌发酵液22mg/mL，血清蛋白质20mg/mL，硒代蛋氨酸10ng/mL，阿魏酸钠0.4mg/mL，二甲双胍8ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸12ng/mL，L-谷氨酰胺550mg/L，复合维生素110μM，胰岛素24mU/L。

所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按质量比2:1:1.2:2:2混合而成。

所述基础培养基为DMEM-F12；所述DMEM-F12培养液是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:4的比例混合的。

所述生长因子为转化生长因子β1(TGF-β1)、肝素结合表皮生长因子(HB-β)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)按质量比1:3:2:1:3混合而成。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按重量份混合均匀后，过滤除菌，得到用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基。

一种所述用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基在用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增上的应用。

对比例1

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加红茶菌发酵液。

对比例2

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加硒代蛋氨酸和阿魏酸钠。

对比例3

一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其配方与制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加二甲双胍和3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

为了进一步说明本发明的的有益技术效果，对各例所述适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液进行效果测试，测试方法如下：将肿瘤干细胞以同样数量的起始细胞接种到96孔板上( 细胞接种密度为5×10

表1

从表1中可以看出，实施例1-5中的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基较对比例具有更加优异的促进细胞增殖能力，这是各组分协同作用的结果。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。