流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法

摘要

本发明提供流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法，涉及免疫分析技术领域。该流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法包括以下步骤：S1、采集体液标本；S2、评估标本质量与数量；S3、进行常规细胞群分类、多标记免疫分型、细胞因子分析与肿瘤标志物检查；S4、结果分析。本发明，运用直接荧光标记细胞表面抗体及核酸的技术结合常规细胞检查等方法联合检测分析，可用于检测良恶性肿瘤、炎症、细菌及结核感染等多种疾病，疾病的检测范围广泛，具有较高的临床诊断鉴别意义；本发明可采用多种体液检测，如尿液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液等，取材方便、简单、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，具体为流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法。

背景技术

现有免疫分析技术采用通过获取流式样本中每个细胞在以细胞表面不同抗原分子量为坐标轴的坐标系中的位置坐标；根据所述位置坐标将所述流式样本中的细胞分为多个细胞群；识别所述多个细胞群各自的细胞种类；判断每个所述细胞群中细胞的所述位置坐标是否处于该所述细胞群的细胞种类所对应的预设范围内；以及当判断结果为所述细胞群中存在细胞的所述位置坐标不处于该所述细胞群的细胞种类所对应的预设范围内，确定该所述细胞群为异常群。DNA倍体技术通过获取流式样本中与正常细胞不同峰值，位置坐标不处于正常细胞群所对应的预设范围内来判定异常细胞群。细胞因子检测通过捕获微球与样本表面六种特异性抗体结合，再与PE标记的荧光抗体结合，形成双抗体夹心复合物，检测复合物的荧光强度，可得六种抗体的含量。

然而，现有技术存在以下缺点：

1.目前血液分析在疾病诊断过程中较为滞后，该三种检测方法(免疫分型、DNA倍体、细胞因子)在疾病的发生发展中,体液的异常结果较血液表现更早、更有价值；

2.目前三种方法独立检测，缺乏综合评估疾病的手段，无法高效、准确的判定是何种疾病，诊断范围较小；

3.传统病理诊断需手术取组织活检，成本高，风险大，对患者损伤大，痛苦多，现使用细针穿刺采取少量穿刺样本即可进行分析；

4.体液细胞普通显微镜下检测：形态学不典型，且细胞数量及质量不定，异常细胞容易漏检或由于主观意识错误判断细胞性质。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法，解决了现有技术中存在的缺陷与不足。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、采集体液标本；

S2、评估标本质量与数量；

S3、进行常规细胞群分类、多标记免疫分型、细胞因子分析与肿瘤标志物检查；

S4、结果分析。

优选的，所述体液标本包括但不限于为尿液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液、阴道分泌液、穿刺组织块。

优选的，所述评估标本质量与数量，具体如下：

1)观察采集时间，标本采集后四小时内送检为符合条件的新鲜标本；

2)观察标本采集量，样本量大于10ml为符合条件标本；

3)运用希森美康全自动模块式血液体液分析系统XN-2000，选择体液模式上机，若白细胞数大于100x10

优选的，所述常规细胞群分类，具体如下：

1)运用希森美康全自动模块式血液体液分析系统XN-2000，选择体液模式上机，获得白细胞数、红细胞数、白细胞五分类；

2)将体液标本1300r/min离心5分钟后，去上清，将沉渣涂片瑞姬氏染色后，生物显微镜下观察分类计数。

优选的，所述多标记免疫分型，具体如下：

1)将体液标本1300r/min离心5分钟后，去上清，加2mlPBS,混匀，1300r/min离心5分钟，去上清，重复洗3次后留沉渣；

2)取三管流式管，其中1号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD320ul、PE-CD16/56 20ul、PerCP-CD45 20ul、PE-CY7-CD8 5ul、APC-CD19 5ul、APC-CY7-CD4 5ul；2号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD7 20ul、PE-CD117 20ul、PE-CY7-CD19 5ul、APC-CD2 5ul、APC-CY7-CD45 5ul；3号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD45RA 20ul、PE-CD34 20ul、PerCP-CD520ul、PE-CY7-CD13 5ul、APC-CD45RO 5ul、APC-CY7-CD14 5ul,混匀，避光静置15分钟，加2ml特殊破膜剂，破膜剂包括二甘醇30％-50％、甲醛20％-30％、甲醇30％-40％混合液，混匀，避光静置10分钟，1300转离心5分钟，弃上清，加2mlPBS，混匀，1300转离心5分钟，弃上清，加1号3号试管加500ulPBS，2号试管加500ul特殊染料，混匀；

3)运用BDFACSCanto Ⅱ流式细胞仪BDFACSDiva Software软件进行分析，设定不同的横纵坐标通道标记获取两两标记物之间的关系图，调整仪器电压及补偿，使得仪器到达合适的工作条件，从而获得不同标记所示细胞群的数量及是否存在异常细胞；

4)将在BDFACSDiva Software软件中的实验数据导出，运用ModFitLT4.1分析软件导入含有PI染料的实验组实验数据，1号门圈中分析的所有细胞，减少细胞碎片，2号门设定纵坐标为SSC-A，横坐标为APC-CY7-CD45，圈住部分细胞群反复分析，观察是否存在异常细胞群。

优选的，所述反设门技术，具体如下：将在ModFit LT4.1分析软件检测到的异常细胞峰及框内异常细胞群，在BDFACSDiva Software软件中选择同样横纵坐标选择同样位置细胞群P9。

优选的，所述细胞因子分析，具体如下：

1)将体液标本1300r/min离心5分钟后，取上清，调电压，流式管中加入100ul校准微球(D)和400ulPBS，充分混匀；运用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪上机BDFACSDivaSoftware软件分析，在parameter中，FSC和SSC设为Log，调整FSC和SSC的电压，使P1圈住beads群；调节APC通道电压，使P2在APC上的mean值大约在70000；将下述1:2浓度校准管细胞因子检验，观察图中六分群是否刚好处于最右侧，若有偏差则调整FITC电压，使得其处于最右侧；

2)将上述获取的电压用于下述校准曲线的实验电压，校准曲线设定：计算所需实验人份数n＝10个标准品+1个阴性对照；打开定量标准品B，将标准品转移到离心管中，并标记该管为最高浓度；2ML样本稀释液G重悬标准品，室温下放置15分钟；用吸头轻轻混匀标准品，避免剧烈震荡，取10根实验管为最高浓度，分别标记1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512，每管加入300μl样品稀释液G；5、将捕获微球混合液A用低速离心机200g离心5分钟，小心吸走上清，吸入与所吸走上清同样体积的微球缓冲液H，涡旋充分混匀后，避光孵育30分钟；标准品管中加入25μl梯度稀释好的标准品、25μl的微球混合液、25μl的荧光检测试剂，所有实验管涡旋充分混匀后，室温下避光孵育2.5小时；每管实验管中加入1mlPBS溶液，200g离心5分钟，小心吸去上清，每管加入100μlPBS溶液，静置等待检验；荧光检测将实验管按照标准品、阴性对照、样品管的顺序依次在校准好状态的流式细胞仪上进行荧光检测，要求每个实验管经涡旋混匀3-5s后立即检测；将检测完成后的结果导入FCAP.GUI.exe软件，设定最高浓度2500pg/ml；

3)获得校准曲线样本检验：取捕获微球混合液A50ul，200g离心五分钟，吸走上清，加等体积的微球缓冲液H，混匀，避光静置30分钟，混匀，取流式管加25ul混合液、25ul体液上清、25ul荧光检测试剂，混匀，避光2.5小时，加1ml PBS溶液，200g离心5分钟，吸走上清，加100ul PBS溶液，混匀，运用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪上机BD FACSDiva Software软件进行分析，将所得实验数据导入FCAP.GUI.exe软件，运用上述校准曲线分析获得结果。

优选的，所述肿瘤标志物检查，具体如下：将体液标本1300r/min离心5分钟后，取上清，运用全自动电化学发光免疫分析仪C702进行CEA、CA199、CA125检验。

优选的，根据所述结果分析及报告单模式判断是炎症反应性还是肿瘤反应性，从细胞免疫分型、DNA倍体、细胞因子、肿瘤标志物多方面建立模型为临床提供参考依据。

(三)有益效果

本发明提供了流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法。具备以下有益效果：

1、本发明，运用直接荧光标记细胞表面抗体及核酸的技术结合常规细胞检查等方法联合检测分析，可用于检测良恶性肿瘤、炎症、细菌及结核感染等多种疾病，疾病的检测范围广泛，相比目前由于主观意识错误判断细胞性质，更标准化、更具有较高的临床诊断鉴别意义；本发明可采用多种体液检测，如尿液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液等，取材方便、简单、成本低。

2、本发明，实现了膜上打洞技术使得可以膜内外同时检测，只需将抗体标记与样本混合、静置、离心即可，操作简单、省时、可实现常规检测。

3、本发明，建立了反设门技术方案，使得更加准确的找到异常细胞群所在位置明确其性质，攻克传统方法少量肿瘤细胞容易漏检问题。

附图说明

图1为本发明免疫分型1号管图形示意图；

图2为本发明免疫分型2号管图形示意图；

图3为本发明DNA倍体实验图形示意图；

图4为本发明P9异常细胞群示意图；

图5为本发明体液样本肿瘤细胞数量较少造成传统方法DNA倍体异倍体假阴性结果示意图；

图6为本发明体液样本肿瘤细胞数较少应用反设门技术DNA倍体异倍体阳性结果示意图；

图7为本发明APC通道电压调整至70000示意图；

图8为本发明2500pg/ml调整PE通道电压示意图；

图9为本发明细胞因子校准曲线图；

图10为本发明细胞因子检测结果示意图；

图11为本发明流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

如图1-11所示，本发明实施例提供流式细胞术在体液细胞免疫分析中联合检测的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、采集体液标本，体液标本包括但不限于为尿液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液、阴道分泌液、穿刺组织块；

S2、评估标本质量与数量，具体如下：

1)观察采集时间，标本采集后四小时内送检为符合条件的新鲜标本；

2)观察标本采集量，样本量大于10ml为符合条件标本；

3)运用希森美康全自动模块式血液体液分析系统XN-2000，选择体液模式上机，若白细胞数大于100x10

S3、进行常规细胞群分类、多标记免疫分型、细胞因子分析与肿瘤标志物检查；

常规细胞群分类，具体如下：

1)运用希森美康全自动模块式血液体液分析系统XN-2000，选择体液模式上机，获得白细胞数、红细胞数、白细胞五分类；

2)将体液标本1300r/min离心5分钟后，去上清，将沉渣涂片瑞姬氏染色后，生物显微镜下观察分类计数；

多标记免疫分型，具体如下：

1)将体液标本1300r/min离心5分钟后，去上清，加2mlPBS,混匀，1300r/min离心5分钟，去上清，重复洗3次后留沉渣；

2)取三管流式管，其中1号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD320ul、PE-CD16/56 20ul、PerCP-CD45 20ul、PE-CY7-CD8 5ul、APC-CD19 5ul、APC-CY7-CD4 5ul；2号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD7 20ul、PE-CD117 20ul、PE-CY7-CD19 5ul、APC-CD2 5ul、APC-CY7-CD45 5ul；3号试管包括标本沉渣50ul，荧光抗体FITC-CD45RA 20ul、PE-CD34 20ul、PerCP-CD5 20ul、PE-CY7-CD13 5ul、APC-CD45RO 5ul、APC-CY7-CD14 5ul,混匀，避光静置15分钟，加2ml特殊破膜剂，破膜剂包括二甘醇30％-50％、甲醛20％-30％、甲醇30％-40％混合液，混匀，避光静置10分钟，1300转离心5分钟，弃上清，加2mlPBS，混匀，1300转离心5分钟，弃上清，加1号3号试管加500ulPBS，2号试管加500ul特殊染料(主要成分碘化丙啶)，混匀；

3)运用BDFACSCanto Ⅱ流式细胞仪BDFACSDiva Software软件进行分析，设定不同的横纵坐标通道标记获取两两标记物之间的关系图(CD3标记T淋巴细胞，CD16/56标记NK细胞，CD45标记淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，CD8标记抑制/细胞毒性T细胞，CD4标记辅助T细胞，CD19标记B淋巴细胞，CD7标记T淋巴细胞、NK细胞，CD117标记髓系幼稚细胞，CD2标记T淋巴细胞、NK细胞，CD45RA标记未致敏的T淋巴细胞，CD45RO标记记忆性的T淋巴细胞，CD34标记干、祖细胞，CD5标记T淋巴细胞，CD13标记粒细胞、单核细胞，CD14标记单核细胞)，调整仪器电压及补偿，使得仪器到达合适的工作条件，从而获得不同标记所示细胞群的数量及是否存在异常细胞，如图1、图2；

4)将在BDFACSDiva Software软件中的实验数据导出，运用ModFitLT4.1分析软件导入含有PI染料的实验组(即图1、2号管)实验数据，1号门圈中分析的所有细胞，减少细胞碎片，2号门设定纵坐标为SSC-A，横坐标为APC-CY7-CD45，圈住部分细胞群反复分析，观察是否存在异常细胞群，所得结果如图3；

反设门技术，具体如下：

1)实现膜内外同时标记，根据膜内的DNA标记分析出目标细胞群，同时反设门分析膜上相应的细胞群，根据相应细胞群再次标记一次完成精准分析DNA；

2)将在ModFit LT4.1分析软件图3中检测到的异常细胞峰及框内异常细胞群，在BDFACSDiva Software软件图1中选择同样横纵坐标选择同样位置细胞群P9(图4)，DNA分析可得图5；

3)由此可见，如图5、图6，从传统方法检出的单个峰阴性结果，经反设门方法检验后检出为多个峰的异倍体阳性结果，进而更准确判断是否存在异常细胞群，降低了肿瘤细胞量少情况下漏检的概率；

细胞因子分析，具体如下：

1)将体液标本1300r/min离心5分钟后，取上清，调电压，流式管中加入100ul校准微球(D)和400ulPBS，充分混匀；运用BDFACSCanto Ⅱ流式细胞仪上机BDFACSDivaSoftware软件分析，在parameter中，FSC和SSC设为Log，调整FSC和SSC的电压，使P1圈住beads群；右击以下双参数图，show population选择P1门；调节APC通道电压，使P2在APC上的mean值大约在70000(如图7)；将下述1:2浓度校准管细胞因子检验，观察图中六分群是否刚好处于最右侧，若有偏差则调整FITC电压，使得其处于最右侧(如图8)；

2)将上述获取的电压用于下述校准曲线的实验电压，校准曲线设定：计算所需实验人份数n＝10个标准品+1个阴性对照；打开定量标准品B，将标准品转移到离心管中，并标记该管为最高浓度；2ML样本稀释液G重悬标准品，室温下放置15分钟；用吸头轻轻混匀标准品，避免剧烈震荡，取10根实验管为最高浓度，分别标记1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512，每管加入300μl样品稀释液G；5、将捕获微球混合液A用低速离心机200g离心5分钟，小心吸走上清，吸入与所吸走上清同样体积的微球缓冲液H，涡旋充分混匀后，避光孵育30分钟；标准品管中加入25μl梯度稀释好的标准品、25μl的微球混合液、25μl的荧光检测试剂，所有实验管涡旋充分混匀后，室温下避光孵育2.5小时；每管实验管中加入1mlPBS溶液，200g离心5分钟，小心吸去上清，每管加入100μlPBS溶液，静置等待检验；荧光检测将实验管按照标准品、阴性对照、样品管的顺序依次在校准好状态的流式细胞仪上进行荧光检测，要求每个实验管经涡旋混匀3-5s后立即检测；将检测完成后的结果导入FCAP.GUI.exe软件，设定最高浓度2500pg/ml；

3)获得校准曲线(如图9)样本检验：取捕获微球混合液A50ul,200g离心五分钟，吸走上清，加等体积的微球缓冲液H，混匀，避光静置30分钟，混匀，取流式管加25ul混合液、25ul体液上清、25ul荧光检测试剂，混匀，避光2.5小时，加1ml PBS溶液，200g离心5分钟，吸走上清，加100ul PBS溶液，混匀，运用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪上机BD FACSDivaSoftware软件进行分析如图10，将所得实验数据导入FCAP.GUI.exe软件，运用上述校准曲线分析获得结果；

肿瘤标志物检查，具体如下：将体液标本1300r/min离心5分钟后，取上清，运用德国罗氏全自动电化学发光免疫分析仪C702进行CEA、CA199、CA125检验；

S4、结果分析及报告单模式如图11所示，判断是炎症反应性还是肿瘤反应性，从细胞免疫分型、DNA倍体、细胞因子、肿瘤标志物多方面建立模型为临床提供参考依据。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个引用结构”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。