一种人脐带间充质干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括采集储运脐带，华通氏胶组织分离，细胞提取及培养，细胞传代及保种冻存；本发明采用的分离方法为将脐带外膜与血管剔除，得到纯净的华通氏胶组织，保证分离的间充质干细胞纯度更高、数量更多；本申请利用二步酶消化法大大缩短了原代细胞的制备周期，且细胞活性好，增殖能力强，具有良好的分化潜能，分离效率高，尤其可满足大规模实验研究及临床应用的细胞需求。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞与再生医学领域，涉及干细胞的分离与培养技术，具体涉及一种从人脐带中分离提取培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞是一类特殊干细胞，具备强大的自我更新和多向分化潜能。间充质干细胞因其在免疫调节与组织修复方面的巨大潜能已获得医学各领域的高度关注。间充质干细胞取材来源甚广，可从骨髓、滑膜、脂肪、脐血、脐带等组织中分离获得。此外，经特殊诱导可以向骨细胞、内皮细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种组织细胞分化。目前间充质干细胞的主要研究来源是骨髓，而一方面骨髓获取难度大，另一方面从骨髓中制备的间充质干细胞增殖分化活性受年龄增长的影响，且存在病毒易感性，故寻找间充质干细胞骨髓替代来源的需求日益迫切。

研究表明，从人脐带华通氏胶组织中可提取获得大量高纯度的间充质干细胞。脐带具有来源丰富，取材方便、不受限，不存在伦理争议等优势，为间充质干细胞的获取提供了新的来源途径。与骨髓源性间充质干细胞一样，脐带来源细胞同样具有低免疫原性、调节免疫炎症、促进组织损伤修复等的功能特点，有望作为一项有效的治疗策略广泛应用于临床。

但如何从脐带华通氏胶组织当中高效分离获得较为纯净的间充质干细胞仍是阻滞当前研究进展的主要问题。目前，从脐带华通氏胶组织中提取间充质干细胞的主流方法包括蛋白酶消化法与组织块贴壁法。传统的蛋白酶消化法主要通过应用胶原酶、透明质酸酶及中性蛋白酶联合作用以获取细胞，消化时间达6小时及以上，不仅延长了细胞体外分离时间，且易导致细胞活性受影响(BeeravoluN, et al.Isolation and Characterizationof Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta.JVis Exp.2017；(122):55224；Zhang Z,et al. Human Umbilical Cord Mesenchymal StemCells Inhibit T Follicular Helper Cell Expansion Through the Activation ofiNOS in Lupus-Prone B6.MRL-Faslpr Mice. Cell Transplant.2017；26(6):1031-1042.)。组织块贴壁法虽然具有工艺简单、成本低的优势，但其细胞获取周期长，且细胞获得率低，难以满足大规模实验研究及临床应用的需求，严重影响实验进展。

发明内容

本发明针对上述不足，提供一种更为高效的脐带间充质干细胞分离培养方法，该简化了操作工艺，缩短了酶作用时间，无需特殊消化工具，可大大缩短原代细胞的分离周期，快速获得大量高纯度且活性高的间充质干细胞。

本发明是通过以下步骤实现的：

一种从脐带华通氏胶组织中提取培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采集储运脐带：无菌条件下获取脐带，初步清理脐带内动静脉血后橡皮筋结扎脐带两端，浸泡于无菌生理盐水中，低温(0-4℃)保存转运，6h内进行处理；

(2)华通氏胶组织分离：用无菌生理盐水反复冲洗，去除脐带表面及血管内残存血液，然后用无菌剪刀将脐带分为3-4cm左右小段，再将小段脐带放在生理盐水浸湿的无菌纱布上，用眼科剪自浅层纵向剪开脐带外膜组织，固定一侧外膜，手术刀刮取剥离华通氏胶与外膜，后用止血钳剔除血管，过程中保证组织湿润；最后用无菌生理盐水冲洗分离后的华通氏胶组织再剪碎成1-3mm

(3)细胞提取及培养：

(3.1)向剪碎的组织块中加入胶原酶溶液进行第一次消化，胶原酶溶液与组织块体积比优选1：1；37℃孵育消化30min后，3000×g，离心8-10min，弃去上清，取沉淀；所述胶原酶溶液是将12500U/mL的Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国) 溶液100uL溶于3.9mL DMEM/F12配制成而成，Ⅱ型胶原酶的浓度为 312.5U/mL；

本步骤应用胶原酶消化组织，以达到分离细胞的目的，短时间消化后得到大量原代细胞，且对细胞活力不产生影响。

(3.2)向所得沉淀中加胰蛋白酶(gibco，美国)进行第二次消化，37℃孵育消化30min后加入等体积的无菌细胞保护液终止消化，100目滤网过滤，收集滤液并离心，离心力为3000×g，离心8-10min；弃去上清，保留细胞沉淀；

胰蛋白酶与沉淀的体积比优选1：1，4.胰蛋白酶的浓度优选为0.25％；

细胞保护液配方为：以体积比计，20％FBS(gibco，美国)，1％双抗(Hyclone，美国)，DMEM/F12(gibco，美国)补足余量；如50mL细胞保护液是通过向 39.5mLDMEM/F12中加入10mLFBS和0.5mL双抗配制而成。

(3.3)用无菌的细胞保护液重悬步骤(3.2)获得的细胞沉淀并均匀接种于T-75 培养瓶中，2-3天后半量换液，5-6天后全量换液；

(4)细胞传代及保种冻存：细胞融合达80％以上时，消化传代，细胞悬液均匀分至无菌培养瓶中，补足细胞保护液，于37℃，5％(体积比)CO

优选的，上述从脐带华通氏胶组织中提取间充质干细胞的方法中，步骤(4) 所述传代冻存是指：将细胞以冻存液重悬后，于程序性降温盒(Biosharp，中国) 中在-80℃冻存，24小时后转入液氮中长期保存；所述冻存液由体积比为90％FBS 和10％DMSO混合配制而成(Yuan,X.,et al.Mesenchymal stem cell therapy induces FLT3L and CD1c(+)dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients. Nat Commun 2019.10(1):2498.)，即1mL冻存液由0.9mL FBS(gibco,美国)和 0.1mLDMSO(Sigma,美国)配制而成。

经过上述方法分离所得P0代间充质干细胞经培养后应用CD34-FITC、 CD44-APC、CD45-APC、CD90-PE、CD73-PE、CD105-FITC标记抗体进行流式细胞表面标志物检测(检测方法参见文献：Beeravolu,N.,et al.Isolation and Characterization of MesenchymalStromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta.J Vis Exp2017.122；Araujo,A.B.,et al.Isolation of human mesenchymal stem cells fromamnion,chorion,placental decidua and umbilical cord: comparison of fourenzymatic protocols.Biotechnol Lett 2018.40(6):989-998.)， CD34与CD45低表达；CD44、CD90、CD73与CD105高水平表达，证明所获得间充质干细胞具备良好的三系分化潜能，即成骨、成脂、成软骨性能。

本申请的有益效果如下：

(1)本发明方法去除脐带外膜及期待血管，可以分离出纯净的华通氏胶组织，既可有效避免分离过程中出现污染，又能确保最终获取的脐带间充质干细胞的纯度，获得的间充质干细胞数量多、纯度高、增殖分化能力强。

(2)本发明利用胶原酶溶液包含高浓度的Ⅱ型胶原酶(常规使用浓度为250U/mL)，在保证细胞增殖分化活性的前提下，有效提高分离效率。酶浓度适当提高后，细胞分离效率大大提高，可得到更多量的原代细胞，且细胞的增殖分化活性高。

(3)本发明应用两种蛋白酶进行消化，在保证有效消化脐带组织块的同时缩短酶作用时间，尽可能减少化学成分对组织细胞活性状态的影响，且最终得到的细胞数量多、纯度高、增殖能力强，大大提高了间充质干细胞分离率。

(4)本发明应用高浓度FBS进行原代细胞的培养(常规细胞保护液的配方是：DMEM/F12+10％FBS+1％双抗)，使原代细胞离体后可以获取高度营养保持细胞活力，保证了细胞增殖分化。

附图说明

图1为实施例1培养方案的具体流程图。

图2为对比例1的华通氏胶组织块贴壁培养图。

图3为实施例1和对比例1P0代间充质干细胞不同时间段的细胞融合度曲线。

图4为实施例1P0-P5代间充质干细胞的增殖曲线。

图5为实施例1与对比例1所述方法分离所得P0代细胞培养2天的图片。

图6为实施例1与对比例1所述方法分离所得P0代细胞培养5天的图片。

图7为实施例1所得P0代间充质干细胞进行流式细胞检测结果图。

图8为成骨诱导染色与茜素红对照染色检测结果图。

图9为成脂诱导染色与油红“O”对照染色检测结果图。

图10为成软骨诱导染色与阿利辛兰对照染色检测结果图。

具体实施方式

为了更好的阐明本发明的构思与优点，下面将对本发明进行进一步说明。除非特殊说明，下列实施例中的实验方法，通常是按照常规条件或按照厂商(产品说明书)所建议的条件进行实施检测。

实施例试剂、培养基来源/配方：

胰蛋白酶购自gibco，美国；

细胞保护液：以体积比计，细胞保护液中包括20％FBS(gibco，美国)， 1％双抗(Hyclone，美国)，再以DMEM/F12(gibco，美国)补足余量；如50mL 细胞保护液是通过向39.5mLDMEM/F12中加入10mLFBS和0.5mL双抗配制而成。

胶原酶溶液：将12500U/mL的Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)溶液100uL溶于3.9mLDMEM/F12配制成而成，其中Ⅱ型胶原酶的浓度为312.5U/mL；

为Ⅱ型胶原酶溶于DMEM/F12配制而成，Ⅱ型胶原酶浓度为312.5U/mL

细胞保护液：DMEM/F12+20％FBS+1％双抗

冻存液：以体积比计，冻存液是由90％FBS和10％DMSO混合配制而成，即1mL冻存液由0.9mL FBS(gibco,美国)和0.1mLDMSO(Sigma,美国)配制而成；该冻存液的配制方法也可以参见文献“Yuan,X.,et al.Mesenchymal stem cell therapy induces FLT3L and CD1c(+)dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients.Nat Commun2019.10(1):2498.”中公开的配制方法；

程序性降温盒：购自Biosharp，中国；

含FBS完全培养基：以体积比计，DMEM/F12+20％FBS+1％双抗。

实施例1：

如图1所示，一种从脐带华通氏胶组织中提取间充质干细胞的方法，步骤如下：

(1)采集储运脐带：无菌条件下获取脐带，初步清理人脐带内动静脉血后橡皮筋结扎脐带两端，浸泡于无菌生理盐水中，低温(0-4℃)保存转运，6h内进行处理；

(2)华通氏胶组织分离：用无菌生理盐水反复冲洗，去除脐带表面及血管内残存血液，然后用无菌剪刀将脐带分为3-4cm左右小段，再将小段脐带放在生理盐水浸湿的无菌纱布上，用眼科剪自浅层纵向剪开脐带外膜组织，固定一侧外膜，手术刀刮取剥离华通氏胶与外膜，后用止血钳剔除血管，过程中保证组织湿润；最后用无菌生理盐水冲洗分离后的华通氏胶组织再剪碎成1-3mm

(3)细胞提取及培养：

(3.1)向步骤(2)剪碎的组织块中加入胶原酶溶液进行第一次消化，所加入的胶原酶溶液与组织块的体积比为1：1；

37℃孵育消化30min后，3000×g，离心8min，弃去上清，取沉淀；

(3.2)向步骤(3.1)所得沉淀中加胰蛋白酶(浓度0.25％)进行第二次消化，37℃孵育消化30min后加入等体积的无菌细胞保护液终止消化，100目滤网过滤，收集滤液并离心，离心力为3000×g，离心8min；弃去上清，保留细胞沉淀；

胰蛋白酶与沉淀的体积比为1：1；

(3.3)用无菌的细胞保护液重悬步骤(3.2)获得的细胞沉淀并均匀接种于T-75 培养瓶中，过夜贴壁的细胞即为P0代细胞，2天后半量换细胞保护液，5天后全量换细胞保护液；

(4)细胞传代及保种冻存：细胞融合达80％以上时，消化传代，细胞悬液均匀分至无菌培养瓶中，补足细胞保护液，于37℃，5％(体积比)CO

本实施例中，所述传代冻存是指：将细胞以冻存液重悬后，于程序性降温盒中在-80℃冻存，24小时后转入液氮中长期保存。

对比例1：爬壁法提取培养间充质干细胞

一种从脐带华通氏胶组织中提取间充质干细胞的方法，步骤如下：

(1)采集储运脐带：无菌条件下获取脐带，初步清理脐带内动静脉血后橡皮筋结扎脐带两端，浸泡于无菌生理盐水中，低温保存转运，6h内进行处理；

(2)用无菌生理盐水反复冲洗，去除脐带表面及血管内残存血液，然后用无菌剪刀将脐带分为3-4cm左右小段，再将小段脐带放在生理盐水浸湿的无菌纱布上，用眼科剪自浅层纵向剪开脐带外膜组织，固定一侧外膜，手术刀刮取剥离华通氏胶与外膜，后用止血钳剔除血管，过程中保证组织湿润；最后用无菌生理盐水冲洗分离后的华通氏胶组织再剪碎成1-3mm

(3)细胞培养：取15-20块组织块放入T-75培养瓶，加入适量含FBS完全培养基，于37℃，5％CO

(4)细胞传代及保种冻存：细胞融合达80％以上时，消化传代(传代前的细胞定义为P0代细胞)，细胞悬液均匀分至无菌培养瓶中，补足新鲜的含FBS完全培养基、，于37℃，5％CO

实施例2细胞培养检测试验

观察实施例1和对比例1获得的P0代间充质干细胞生长状况并绘制不同时间段细胞融合度曲线，其结果如图3所示，可见实施例1方法细胞融合更快。

根据实施例1P0-P5代间充质干细胞进行细胞计数并绘制生长曲线，结果如图4所示。

选取实施例1和对比例1P0代培养3天后的细胞和P0代培养6天后的细胞进行显微镜下观察、拍照，如图5所示，图5中，A为实施例1，B为对比例1，可见培养至第2天实施例1已有约20％细胞贴壁，而对比例1未见有细胞爬出。

显微镜下观察实施例1和对比例1P0代培养5天后的图片，如图6所示，A 为实施例1，B为对比例1；可见实施例1细胞融合度已达80％以上，而对比例 1仅有约1％的细胞贴壁。

将实施例1中所获得的P0代间充质干细胞经培养后进行流式检测分析细胞表面标志物表达情况，结果如图7所示，图7中，A-F分别为CD90、CD45、CD105、 CD73、CD44、CD34检测结果示意图；可见，通过实施例1方法获得的人脐带间充质干细胞纯度较高，CD73、CD105、CD90、CD44呈阳性表达；而CD45、 CD34则呈阴性表达(检测方法参见文献：Beeravolu,N.,etal.Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from HumanUmbilical Cord and Fetal Placenta.J Vis Exp 2017.122；Araujo,A.B.,etal.Isolation of human mesenchymal stem cells from amnion,chorion,placentaldecidua and umbilical cord: comparison offour enzymatic protocols.BiotechnolLett 2018.40(6):989-998.)，这说明实施例1获得的充质干细胞具有较好的分化能力。

将实施例1中所获得的间充质干细胞经培养后取P3代细胞进行三系分化鉴定，参照人脐带间充质干细胞诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司，美国)说明书具体操作步骤对细胞进行成骨(Cyagen公司，货号：HUXUC-90021)、成脂(Cyagen公司，货号：HUXUC-90031)、成软骨(Cyagen公司，货号： HUXUC-90042)诱导分化及染色，结果如图8-10所示：图8为成骨诱导染色(图 8B)与茜素红对照染色(图8A)，图9为成脂诱导染色(图9B)与油红“O”对照染色(图9A)，图10为成软骨诱导染色(图10B)与阿利辛兰对照染色(图 10A)(Dominici,M.,etal.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.TheInternational Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy2006.8(4):315-317)，可见，通过实施例1方法获得的人脐带间充质干细胞具备良好的多向分化潜能，能够定向分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。

以上实验结果证明了实施例1应用的二步酶消化法工艺简单，大大缩短了原代细胞的制备周期，且获得的细胞活性好，增殖能力强，具有良好的多向分化潜能，分离效率高，为满足大规模实验研究及临床应用提供了充足的细胞来源。

以上展示了本发明的技术路线及优势特点，较为具体详实。本技术领域的人员应当理解，以上仅为本发明中较优的实施案例，而非依此来限制本发明，且在本发明的精神和原理基础上所进行的任何变形和修改，均应纳入本发明的要求保护范围内。