一种提高植物耐盐抗旱性、改良土壤的微生物固定化微球制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种提高植物耐盐抗旱性、改良土壤的微生物固定化微球制备方法及应用。该方法包括：1)向短小芽孢杆菌的液体菌剂中添加吸附剂；2)溶解包埋剂；将1)和2)混合加入交联剂中，即得。本发明制得的固定化微球有效活菌数为33.7亿cfu/g、包埋率为62％、膨胀率为1.10、机械强度为100％。该固定化微球能明显缓解植物对旱盐胁迫的耐受性，能显著促进植物生长，提高植物产量和品质，活化土壤、增加土壤肥力。本发明为从“化学农业”向“生态农业”转化提供了解决方法，也解决了传统液体微生物菌肥有效活菌数低、保存期短的技术障碍，为高效短小芽孢杆菌固定化微球工业化生产提供技术支撑和理论指导。

说明书

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种提高植物耐盐抗旱性、改良土壤的微生物固定化微球制备方法及应用。

背景技术

土壤盐渍化是世界范围内面临的重要环境问题,在干旱半干旱地区尤为严重。据估计有20％的灌溉土地受到盐渍化的影响,干旱半干旱区将近50％的灌溉土地有不同程度的盐渍化问题,全球范围内大约有10×10

微生物肥料是以活性微生物的生命活动导致作物得到所需养分的一种新型肥料生物制品，推广应用微生物菌肥可以大大减少化学农药、化肥的使用量，减少环境污染，提高作物品质，是农业可持续发展的必然之路；但是传统的液体菌剂易受到生产工艺、外部环境、稳定性等因素的影响而使其有益微生物的存活率低、保存时间短，很难达到国家标准；而传统的固体菌剂较多以泥炭为载体，尽管保存期较液体菌剂会相对延长，但是所用的载体大多不可再生，且对土壤的作用也十分有限，使用过多也会使资源枯竭。因此寻找针对性提高干旱和盐渍化地区土壤肥力、增强植物对旱盐胁迫的耐受性、提高微生物菌剂存活率和保存期的方法迫在眉睫。

微生物固定化微球是利用物理或化学手段将游离微生物限定在特定载体内，使其高浓度富集，而且能有效降低有益微生物与外界环境接触。

发明内容

本发明针对目前水资源短缺和土壤盐渍化日益严重的现状，以及微生物肥料技术所存在的不足，提供一种提高植物抗旱耐盐能力、改善土壤微生态的短小芽孢杆菌固定化微球的制备方法及其应用，利用这种固定化微球可以显著提高植物的抗旱耐盐性、提高植物的产量和品质、提高土壤肥力，同时也可以有效解决现有微生物菌肥有效活菌数低、保存期短的问题。

本发明用到的短小芽孢杆菌G5是本实验室前期从野生甘草中获得的，已被证实具有提高植物抗逆性、增强植物产量的作用。目前所应用的短小芽孢杆菌菌剂大多是液体菌剂或添加载体的固体菌剂，用微生物固定化技术，以生物炭为载体，采用吸附-交联-包埋的方法制备菌剂的方法还未见报道，制得的微生物固定化微球既有效的保护了功能微生物菌群，使其在盐旱地区提高植物产量，同时向土壤中加入生物炭，起到改良土壤，增强土壤肥力的协同增效作用。

第一方面，本发明要求保护一种微生物固定化微球的制备方法。

本发明所要求保护的微生物固定化微球的制备方法，为吸附-包埋-交联法，具体可包括如下步骤：

(A)制备短小芽孢杆菌的液体菌剂；

(B)向所述短小芽孢杆菌的液体菌剂中添加吸附剂进行吸附，得到体系甲；

(C)将包埋剂溶解，得到体系乙；

(D)将所述体系甲和所述体系乙混合后加入交联剂中进行交联，进而得到所述微生物固定化微球。

在本发明的具体实施方式中，步骤(A)中，所述短小芽孢杆菌具体为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16879。

步骤(A)中，所述短小芽孢杆菌的液体菌剂可为将所述短小芽孢杆菌接种到改良后的发酵培养基中进行培养后得到的。所述改良后的发酵培养基的pH为7.0，溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽糖4.0％，大豆蛋白胨3.0％，KH

进一步地，进行所述培养的温度为34℃，时间为42h。

更进一步地，所述步骤(A)具体可按照如下进行：将活化的所述短小芽孢杆菌单菌落接入NA培养基，置于控温摇床，30℃，170rpm培养24h，然后接种2％(体积百分含量)至所述改良后的发酵培养基中，摇床转速230rpm，培养温度34℃，培养42h，所得所述液体菌剂。

其中，所述短小芽孢杆菌可按照包括如下步骤的方法进行活化：将所述短小芽孢杆菌菌株转接到NA固体培养基，37℃恒温培养48h。

步骤(A)中，所述短小芽孢杆菌的液体菌剂中所述短小芽孢杆菌的含量可为495亿cfu/mL。

步骤(B)中，所述吸附剂可为如下中的任意一种或多种：生物炭、草炭、蛭石；

进一步地，所述吸附剂为生物炭，所述生物炭在所述体系甲中的质量分数可为2-8％(如2-6％，再如4-6％)。

在本发明的一个优先实施方案中，所述生物炭在所述体系甲中的质量分数具体为6％。

步骤(C)中，所述体系甲和所述体系乙的体积比为(1-3):4，如1:1、1:2、1：3、2:3或3:4。

进一步地，所述体系甲和所述体系乙的体积比为(2-3):4。

在本发明的一个优先实施方案中，所述体系甲和所述体系乙的体积比为3:4。

步骤(C)中，所述包埋剂可为聚乙烯醇、海藻酸钠中的任一种或将两种混合。

进一步地，所述包埋剂为聚乙烯醇和海藻酸钠按照质量比1:1混合。

更进一步地，聚乙烯醇和海藻酸钠在所述体系乙中的质量分数均为2-6％；

在本发明的一个优先实施方案中，聚乙烯醇和海藻酸钠在所述体系乙中的质量分数均为3％。

在本发明的具体实施方式中，所述步骤(C)是按照如下进行的：将聚乙烯醇在80-100℃下完全溶解后，加入海藻酸钠溶解混合均匀，冷却到40℃，得到所述体系乙。

步骤(D)中，所述交联剂可为质量分数为2％-8％的氯化钙溶液。

进一步地，所述交联剂可为质量分数为3％-5％的氯化钙溶液。

在本发明的一个优先实施方案中，所述交联剂具体为质量分数为4％的氯化钙溶液。

步骤(B)中，进行所述吸附的条件可为150-230rpm(如200rpm)震荡孵育12-24h(如12h)。

步骤(D)中，进行所述交联的条件可为搅拌12-24h(如24h)。

步骤(D)中，在进行所述交联后还可包括洗涤(用水洗涤)和烘干(40℃)的步骤。

步骤(D)中，所述交联剂可用特定方法滴入，如用注射器或蠕动泵滴入。

第二方面，本发明要求保护一种微生物固定化微球。

本发明所要求保护的微生物固定化微球，是采用前文所述方法制备得到的。

进一步地，所述微生物固定化微球的直径为2-3mm，每g所述微生物固定化微球中所述短小芽孢杆菌的有效活菌数为(2-4)×10

第三方面，本发明要求保护前文所述的微生物固定化微球在如下任一中的应用：

P1、缓解植物对干旱胁迫和/或盐胁迫的耐受性；

P2、促进植物生长；

P3、提高植物产量和/或品质；

P4、活化土壤、增加土壤肥力。

其中，所述“缓解植物对干旱胁迫和/或盐胁迫的耐受性”具体可体现为在干旱胁迫和/或盐胁迫情况下，施用了前文所述的微生物固定化微球的所述植物与对照(未施用所述微生物固定化微球和任何微生物菌剂)相比，生长促进、产量和/或品质提高、土壤活化、土壤肥力增加。

其中，所述“活化土壤、增加土壤肥力”可体现为如下中的全部或部分：增加土壤中酶的活性、增加土壤中速效氮和/或速效磷的含量、提高土壤中细菌数量。所述“增加土壤中酶的活性”可体现为增加所述植物根际土壤中脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和/或过氧化氢酶的活性。所述“促进植物生长”可体现为促进如下指标中的全部或部分提高：根长、茎长、根粗、茎粗和干重。

在本发明的实施例中，所述植物具体为圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Voigt)。

本发明所制的微球微环境相对封闭，具有缓释性能，屏蔽不良外界因素，能有效提高有益微生物存活数量。经本发明制得的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)G5固定化微球的有效活菌数为33.7亿cfu/g(国家标准液体颗粒型微生物菌剂要求有效活菌数(cfu)，≥1.0亿cfu/g)；包埋率为62％；膨胀率为1.10，机械强度为100％。制得固定化微球能明显缓解植物对旱盐胁迫的耐受性，能显著促进植物生长，提高植物产量和品质，能起到活化土壤、增加土壤肥力，即增加土壤中酶的活性、增加土壤中速效氮、速效磷的含量，显著提高土壤中细菌数量的作用。

本发明为提高西北干旱半干旱盐渍化地区植物生长、作物产量和品质以及作物种植从“化学农业”向“生态农业”转化提供了一种解决方法，本发明也解决了传统液体微生物菌肥有效活菌数低、保存期短的技术障碍，为短小芽孢杆菌固定化微球工业化生产和获得提高植物耐盐抗旱、提高土壤肥力的长保存期、高包埋率的缓释微生物菌肥提供技术支撑和理论指导。

保藏说明

菌株名称：短小芽孢杆菌

拉丁名：Bacilluspumilus

参椐的生物材料(株)：G5

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年12月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16879

附图说明

图1为本发明制得的微生物固定化微球。

图2为不同处理组间甘草牵牛幼苗的根长、茎长、根粗、茎粗的统计结果。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图3为不同处理组间牵牛干重的结果。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图4为不同处理组间甘草幼苗发芽率牵牛根际土脲酶活。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图5为不同处理组间牵牛根际土蔗糖酶活。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图6为不同处理组间牵牛根际土磷酸酶活。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图7为不同处理组间牵牛根际土过氧化氢酶活。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图8为不同处理组间牵牛根际土壤中细菌总数的影响。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图9为不同处理组间牵牛根际土速效氮的影响。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

图10为不同处理组间牵牛根际土速效磷的影响。图中，-B表示对照组、+Q表示使用市售“琦微”微生物菌剂、+G2表示使用本发明固定化微球。

各图中，CK表示未经任何胁迫处理；D表示干旱胁迫处理；S表示盐胁迫处理。不同小写字母间表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所涉及的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)G5是从采集来的乌拉尔甘草中分离得到的一株内生菌，经过形态学和生理生化特性鉴定，以及通过16SrDNA核糖体数据库的比对，其同源性最高的菌种为CTSP17；EU855198、CTSP18；EU855199、CTSP19；EU855200、CTSP20；EU855201，最终鉴定该菌株G5为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。该菌株已经于2018年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.16879。

实施例1、短小芽孢杆菌G5固定化微球的制备

1、菌种活化

将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)G5(CGMCC No.16879)菌株转接到NA固体培养基，37℃恒温培养48h，备用。

2、发酵培养制备液体菌剂

挑取单菌落，接入装量为250mLNB培养基的250mL三角摇瓶中，置于控温摇床，30℃，170rpm培养24h，接种2％(v/v)至本课题组前期改良后的短小芽孢杆菌专用发酵培养基(pH为7.0，溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽糖4.0％，大豆蛋白胨3.0％，KH

所得液体菌剂中短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)G5的含量具体为495亿cfu/mL。

3、固定化微球的制备

(1)取步骤2所得的液体菌剂添加吸附剂(生物炭)于摇床上200rpm吸附12h，得到体系甲。

(2)将聚乙烯醇(PVA)在80-100℃下完全溶解后，加入海藻酸钠(SA)溶解混合均匀，冷却到40℃后，得到体系乙。

(3)将体系甲与体系乙以一定比例混合均匀，然后特定方法(注射器或蠕动泵)滴入CaCl

4、固定化微球性能评价

(1)有效活菌数：采用稀释平板法。

(2)膨胀率的测定：选取固定化小球100个测其直径D，浸泡在去离子水中12h后测其直径为D12，膨胀率系数X为：D

(3)机械强度的测定：将固定化小球100颗放人250mL锥形瓶中，加入100mL去离子水，于200rpm，30℃恒温振荡24h后完好小球占原小球总数的比率。

(4)固定化微球包埋率的测定：固定化微球总的活菌数占包埋前活菌数总数的百分比即为包埋率。计算包埋前的菌落总数A，称量制备完成后的固定化小球总质量m

4、正交实验优化短小芽孢杆菌固定化微球最佳条件

通过查阅相关文献确定步骤3中影响微生物固定化效果的4个影响因素，即：

步骤(1)中吸附剂(生物炭)在所述体系甲中的质量分数；

步骤(2)中包埋剂质量配比(SA：PVA)；

步骤(3)中CaCl

步骤(3)中体系甲和体系乙的体积比(简称甲乙比)。

选用4因素3水平L

表1、固定化微球正交实验因素与水平

正交实验结果的极差分析与方差分析如表2、表3所示。

表2、正交实验结果与极差分析

表3、正交实验结果方差分析

由机械强度的试验结果可得各因素对机械强度没有影响，因此不再分析。结合极差分析和方差分析(表2和表3)可得：对于因素A，其对包埋率和膨胀率的影响较大，对有效活菌数无显著影响，因此选A

本方案对短小芽孢杆菌固定化微球制备工艺以有效活菌数、包埋率、膨胀率、机械强度为考察指标，优化后的工艺为：吸附剂质量分数为6.0％、包埋剂海藻酸钠与聚乙烯醇配比为1:1(海藻酸钠与聚乙烯醇在所述体系乙中的质量分数均为3.0％)、氯化钙浓度为4.0％、体系甲和体系乙的体积比为3:4，由此工艺得到固定化微球的粒径为2-3mm，有效活菌数为33.7亿cfu/g，包埋率为62％，膨胀率为1.10，机械强度为100％。本发明制得的微生物固定化微球如图1所示。

短小芽孢杆菌G5液体菌剂有效活菌数为425亿cfu/mL，但是在前期货架期考察时发现保存80d时有效活菌数只有0.99亿cfu/mL；经本发明制得的短小芽孢杆菌G5固定化微球菌剂保存6月后有效活菌数仍大于1亿cfu/g；与液体菌剂相比，本发明向土壤中施入了生物炭，在缓解植物胁迫的同时又起到改良土壤的作用。

实施例2、短小芽孢杆菌G5固定化微球对植物及其根际土壤的作用

一、材料

受试对象：为圆叶牵牛(Pharbitispurpurea(L.)Voigt)及其根际土壤。

液体微生物固定化菌肥：实施例1最优工艺制备的短小芽孢杆菌G5的固定化微球(粒径为2-3mm，有效活菌数为33.7亿cfu/g，包埋率为62％，膨胀率为1.10，机械强度为100％)。

二、实验设计

通过沙培室内盆栽实验，采用完全随机设计，盐基采用中性盐NaCl，浓度为50mmol/L；干旱采用10％PEG。

处理分别为：

对照CK：未使用任何肥料，未经任何胁迫处理；

CK+Q：使用市售“琦微”微生物菌剂，未经任何胁迫处理；

CK+G2：使用本发明固定化微球，未经任何胁迫处理。

D：干旱胁迫，未使用任何肥料；

D+Q：干旱胁迫，使用市售“琦微”微生物菌剂；

D+G2：干旱胁迫，使用本发明固定化微球；

S：盐胁迫，未使用任何肥料；

S+Q：盐胁迫，使用市售“琦微”微生物菌剂；

S+G2：盐胁迫，使用本发明固定化微球。

市售菌剂和本发明所得固定化微球均通过混拌的方法施入土壤，施用量为0.1g菌剂/100g土壤。

挑选水浸泡后健康饱满的牵牛种子，播种于盛有高压灭菌后沙子的发芽杯(95+55)/2×125cm)，每盆播种15粒，室内自然光培养，每天用称重法加蒸馏水至恒重。

自播种后20天开始，每隔10天采样一次，采集植株及根际土壤进行个指标测定。测定指标包括主根长、株高、主根粗、主茎粗、生物量；根际土壤细菌总数，磷酸酶、蔗糖酶、脲酶及过氧化氢酶酶活；土壤速效氮、速效磷含量。

三、测定方法

1、生长指标测定：用直尺测定牵牛根长、茎长；游标卡尺测定根粗、茎粗；分析天平测定干重。

2、牵牛根际土壤脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法。

3、牵牛根际土壤蔗糖酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法。

4、牵牛根际土壤磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法。

5、牵牛根际土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法。

6、牵牛根际土壤细菌总数的测定采用稀释平板法。

7、牵牛根际土壤速效氮含量测定采用碱解扩散法。

8、牵牛根际土壤速效磷含量测定采用碳酸氢钠法。

四、实验结果

由图2可知，不同处理组牵牛幼苗接种固定化微球40天内均表现出明显的促生作用。在正常条件下，与对照相比，接种固定化微球牵牛幼苗的根长提高了21.4％；在干旱胁迫下，接种固定化微球牵牛幼苗的根长、茎长、根粗、茎粗较对照分别提高了13.4％、17.7％、20.3％、12.6％；在盐胁迫下，接种固定化微球牵牛幼苗的根粗、茎粗与对照相比分别提高了9.3％、53.6％。本发明制备的固定化微球可显著促进植物幼苗生长，其促生效果与市售菌剂基本一致。

植物干重的大小基本上可以为农产品和中药材的产量提供一定的理论依据，由图3可知，不同处理组牵牛幼苗接种固定化微球后的干重均有所增加。在正常条件下，接种固定化微球20天牵牛幼苗的干重比对照提高了21.1％；在干旱胁迫下，接种固定化微球20天牵牛幼苗的干重较对照提高了14.9％；在盐胁迫下，接种固定化微球20天牵牛幼苗的干重较对照提高了9.9％。

土壤肥力是土壤为植物生长发育提供所需的物理、化学、生物需求的能力，与土壤里的酶和理化性质息息相关。植物根际是植物、土壤和微生物相互作用的特殊生态系统，因此，植物根际土壤酶活性评价和微生物数量的多少是评价土壤肥力的关键指标。由图4可知，在正常条件下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤脲酶活性比对照提高了136％；在干旱胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤脲酶活性比对照提高了94％；在盐胁迫下接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤脲酶活性比对照提高了110％。

由图5可知，在正常条件下接种固定化微球40天的牵牛幼苗根际土壤蔗糖酶活性比对照提高了698％；在干旱胁迫下，接种固定化微球30天的牵牛幼苗根际土壤蔗糖酶活性比对照提高了284.3％；在盐胁迫下，接种固定化微球30天的牵牛幼苗根际土壤蔗糖酶活性比对照提高了61.5。

由图6可知，在正常条件下接种固定化微球40天的牵牛幼苗根际土壤磷酸酶活性比对照提高了94.3％。

由图7可知，在正常条件下接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤过氧化氢酶活性比对照提高了84.0％；在干旱胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤过氧化氢酶活性比对照提高了43.7％；在盐胁迫下，接种固定化微球30天的牵牛幼苗根际土壤过氧化氢酶活性比对照提高了155.5％。

由图8可知，在正常条件下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤中细菌总量比对照提高了661.9％；在干旱胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤中细菌总量比对照提高了108.8％；在盐胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际土壤中细菌总量比对照提高了198.8％。

土壤速效养分是指土壤为植物生活提供的所必需的养分，能够直接被植物吸收或者在短时间内能够转化进而被植物吸收利用。土壤速效氮和速效磷是衡量土壤有效氮素和供磷能力的关键指标。由图9可知，在正常条件下，接种固定化微球40天的牵牛幼苗根际速效氮含量比对照提高了53.8％；在干旱胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际速效氮含量比对照提高了68.5％；在盐胁迫下，接种固定化微球30天的牵牛幼苗根际速效氮含量比对照提高了43.7％。

由图10可知，在正常条件下，接种固定化微球40天的牵牛幼苗根际速效磷含量比对照提高了55.6％；在干旱胁迫下，接种固定化微球40天的牵牛幼苗根际速效氮含量比对照提高了70.2％；在盐胁迫下，接种固定化微球20天的牵牛幼苗根际速效氮含量比对照提高了54.8％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。