一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法

摘要

本发明属于生物技术、食品检测领域，具体是一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法。为建立一种高效、快速、准确且经济的检测方法，本发明公开了一种基于PCR‑DGGE检测食品病原菌副溶血弧菌的试剂盒包括引物组、DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。本发明具体是以化学合成的食品病原菌副溶血弧菌的DNA片段作为待测样品的标准参考，当样品条带与标准条带处于同一水平位置时，即可确定样品中含有食品病原菌副溶血弧菌，本发明利用DGGE检测食物中的食品病原菌副溶血弧菌，时间短、实验结果准确、可重复、技术易普及，同时批量分析多个样品。与增菌培养、高通量测序及荧光定量PCR相比，为一种高效快速经济便捷的检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术、食品检测领域，涉及食品病原菌检测相关的凝胶电泳(DGGE)技术，具体是一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法。

背景技术

副溶血弧菌是革兰氏阴性菌，是一种常见的病原菌。副溶血弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。该病菌广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。如果食用了被此菌污染的海鲜，会引发食物中毒。

近年来，人们的生活水平不断日益提高，越来越多的家庭不仅满足于要吃饱，对营养的搭配需求更全面更均衡，所以，越来越多的海鲜产品进入了普通家庭。如何快速的检测海鲜产品中的食品病原菌副溶血氏菌成为了我们目前一个急需解决的问题。目前检测副溶血弧菌主要有以下几种方法：增菌培养：取标本37℃进行培养，后分离培养将标本接种副溶血氏菌选择培养基35℃培养18～24h观察结果。这种方法耗时长，需等待菌的生长，同时紧靠肉眼判断，实验结果不准确。在实时荧光定量PCR中，前期对样本的处理也许24h左右。在突发公共卫生事件中该技术无法做到高通量快速检测，不能起到有效的监测、预防作用，并且在试验结果的判定方面对检测人员的要求比较高。

发明内容

为建立一种实现高效、快速、准确且经济的食品病原菌副溶血氏菌的快速检测方法，本发明公开了一种基于PCR-DGGE检测食品病原菌副溶血氏菌的试剂盒和检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供一种用于食品病原菌副溶血弧菌的快速检测的引物组及DNA片段，所述引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；所述DNA片段为SEQ IDNO：4所示的片段。

进一步，所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。

本发明提供一种用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒，包括上述引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。

进一步，所述PCR缓冲液包括5μl 10×Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH

进一步，所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。

本发明还提供一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的方法，包括以下步骤：

步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；

步骤2，分别以超纯水、化学合成的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水扩增产物作为待测样品的阴性对照，化学合成的DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；

步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；

步骤4，DGGE检测完毕后，将含有化学合成的DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品条带与标准条带在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品为食品病原菌副溶血弧菌感染的样品；当待测样品没有条带或条带与标准条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有感染食品病原菌副溶血弧菌。

进一步，所述步骤1中样品微生物基因组总DNA提取的步骤如下：

(1)用STE缓冲液浸泡样品后，过滤获得滤液；

(2)将滤液12000rpm离心2min以获得菌体，用STE缓冲液洗涤菌体，12000rpm离心2min；

(3)加入STE缓冲液350μl、溶菌酶30μl，吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5h；

(4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5h，完成后取出，冷却至室温，加入NaCl70μl；

(5)加入450μl DNA提取酚试剂，混匀，12000rpm离心10min，取上清液；

(6)加入等体积的体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，离心，取上清液，重复一次；

(7)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀；

(8)用75％乙醇溶液洗涤沉淀，吹洗，静置2min后吸出乙醇；

(9)加入40μl的ddH

进一步，所述步骤3中DEGG检测为：选择10％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为30μl；在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8h。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明利用DGGE检测食物中的食品病原菌副溶血弧菌，时间短、实验结果准确、可重复、技术易普及，同时可批量分析多个样品。与增菌培养、高通量测序及荧光定量PCR相比，为一种高效快速经济便捷的检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例1的检测结果图。

图2为本发明实施例2的检测结果图。

图3为本发明实施例3的检测结果图。

图4为本发明实施例4的检测结果图。

图中M代表化学合成的食品病原菌副溶血弧菌DNA标准分子片段。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1

1.通过化学合成用于食品病原菌副溶血弧菌快速检测的引物组及DNA片段。

引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物；

所述DNA片段序列如SEQ ID NO：4所示。

SEQ ID NO：1为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

SEQ ID NO：2为：ATTACCGCGGCTGCTGG

SEQ ID NO：3为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG

SEQ ID NO：4为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

2.对化学合成的DNA片段用引物对SEQ ID NO：3/2进行PCR扩增，扩增产物作为待测样品的标准。

PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L):1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH

PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，45～50℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。

3.对作为标准的DNA片段进行DGGE检测及验证：

选择浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μL的TEMED及40μL的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，凝胶时间至少3h；加样前，将电泳液温度上升至55℃时，后220V预电泳5min，PCR扩增产物上样量为30μl，后于55℃、85V条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析，见图1。

实施例2

检测带鱼中食品病原菌副溶血弧菌的方法：包括以下步骤：

1.提取带鱼中微生物基因组总DNA

1.1 DNA提取

(1)将样品用手术刀剪成小碎块，用STE缓冲液浸泡样品，后过滤除去肉沫及其他杂质获得滤液；

(2)将滤液在12000rpm下离心2分钟以获得菌体，用STE缓冲液洗涤菌体两次，再在12000rpm下离心2分钟

(3)加入STE缓冲液350μl、溶菌酶30μl，用移液器吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5小时。

(4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5小时。完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。

1.2抽提

(1)加入450μlDNA提取酚试剂，混匀10分钟，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。

(2)加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为25：24：1)抽提，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。重复一次。

1.3 DNA溶解

(1)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀。

(2)用75％乙醇溶液洗涤沉淀两次，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇。

(3)加入40μl的ddH

1.4检测

将1.3所得物质放入4℃恒温箱内保存过夜，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测所提取基因组DNA的大小及完整性，备用。

2.对超纯水，化学合成的DNA片段及带鱼微生物总基因组DNA分别进行PCR扩增

2.1对带鱼提取的总基因组待检测片段的一次扩增

以上一步得到的带鱼中微生物总基因组DNA为模板，用引物对SEQ ID NO：1/2对细菌16S rRNA的待检测片段进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl反应体系，反应条件参照食物食品病原菌性副溶血弧菌16S rRNA基因待检测片段的一次PCR扩增。

2.2 PCR扩增产物的检测和回收

将上述一次扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下切取扩增产物检测胶的相应条带，按照胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。

2.3带鱼中提取的总基因组待检测片段的二次扩增

以上述胶回收产物为模板，用引物对SEQ ID NO：3/2进行16SrRNA基因待检测片段的二次扩增，PCR扩增体系及反应条件参照上述一次PCR扩增的条件。同时以超纯水、化学合成的DNA片段作为模板分别进行PCR扩增，分别作为阴性对照和标准。

3.DGGE分析

选择10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，取40％、60％胶各15ml，分别加入50μl的TEMED及40μl的10％APS，梯度混合制胶。灌完后，轻轻插入梳子，室温下凝固3小时。待完全凝固后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安有板子的DGGE支架放入电泳槽中，待电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样样品为超纯水、化学合成的DNA片段和带鱼的二次PCR扩增产物，上样量为30μl。在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8小时。电泳完毕，将胶放入2.5×Red Plus染液中染色15分钟，然后用紫色托盘放入紫外分析仪中拍照。从图2可以看到带鱼样品条带的与标准条带不在同一位置，表明带鱼样品中不含有食品病原菌性副溶血弧菌。

实施例3

检测某水产厂扇贝肉中食品病原菌副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

1.提取扇贝肉中微生物基因组总DNA

1.1DNA提取

(1)将样品用手术刀剪成小碎块，用STE缓冲液浸泡样品，后过滤除去肉沫及其他杂质获得滤液；

(2)将滤液在12000rpm下离心2分钟以获得菌体，用STE缓冲液洗涤菌体两次，再在12000rpm下离心2分钟

(3)加入STE缓冲液350μl、溶菌酶30μl，用移液器吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5小时。

(4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5小时。完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。

1.2抽提

(1)加入450μlDNA提取酚试剂，混匀10分钟，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。

(2)加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)抽提，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。重复一次。

1.3 DNA溶解

(1)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀。

(2)用75％乙醇溶液洗涤沉淀两次，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇。

(3)加入40μl的ddH

1.4检测

将1.3所得物质放入4℃恒温箱内保存过夜，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测所提取基因组DNA的大小及完整性，备用。

2.对超纯水，化学合成的DNA片段及扇贝肉微生物总基因组DNA分别进行PCR扩增

2.1对扇贝肉提取的总基因组待检测片段的一次扩增

以上一步得到的扇贝肉中微生物总基因组DNA为模板，用引物对SEQ ID NO：1/2对副溶血弧菌16S rRNA的待检测片段进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl反应体系，反应条件参照食物食品病原菌性副溶血弧菌16S rRNA基因待检测片段的一次PCR扩增。

2.2 PCR扩增产物的检测和回收

将上述一次扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下切取扩增产物检测胶的相应条带，按照胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。

2.3扇贝肉中提取的总基因组待检测片段的二次扩增

以上述胶回收产物为模板，用引物对SEQ ID NO：3/2进行16SrRNA基因待检测片段的二次扩增，PCR扩增体系及反应条件参照上述一次PCR扩增的条件。同时以超纯水、化学合成的DNA片段作为模板分别进行PCR扩增，分别作为阴性对照和标准。

3.DGGE分析

选择10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，取40％、60％胶各15ml,分别加入50μl的TEMED及40μl的10％APS，梯度混合制胶。灌完后，轻轻插入梳子，室温下凝固3小时。待完全凝固后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安有板子的DGGE支架放入电泳槽中，待电泳液温度上升至60℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样样品为超纯水、化学合成的DNA片段和扇贝肉的二次PCR扩增产物，上样量为30μl。在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8小时。电泳完毕，将胶放入2.5×Red Plus染液中染色15分钟，然后用紫色托盘放入紫外分析仪中拍照。从图3可以看到扇贝肉样品条带的与标准条带在同一位置，表明扇贝肉样品中含有食品病原菌性副溶血弧菌。

实施例4

检测某水产厂扇贝肉中食品病原菌副溶血氏菌的方法，包括以下步骤：

1.提取扇贝肉中微生物基因组总DNA

1.1 DNA提取

(1)将样品用手术刀剪成小碎块，用STE缓冲液浸泡样品，后过滤除去肉沫及其他杂质获得滤液；

(2)将滤液在12000rpm下离心2分钟以获得菌体，用STE缓冲液洗涤菌体两次，再在12000rpm下离心2分钟

(3)加入STE缓冲液350μl、溶菌酶30μl，用移液器吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5小时。

(4)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5小时。完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。

1.2抽提

(1)加入450μlDNA提取酚试剂，混匀10分钟，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。

(2)加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)抽提，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。重复一次。

1.3 DNA溶解

(1)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀。

(2)用75％乙醇溶液洗涤沉淀两次，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇。

(3)加入40μl的ddH

1.4检测

将1.3所得物质放入4℃恒温箱内保存过夜，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测所提取基因组DNA的大小及完整性，备用。

2.对超纯水，化学合成的DNA片段及扇贝肉微生物总基因组DNA分别进行PCR扩增

2.1对扇贝肉提取的总基因组待检测片段的一次扩增

以上一步得到的扇贝肉中微生物总基因组DNA为模板，用引物对SEQ ID NO：1/2对细菌16S rRNA的待检测片段进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl反应体系，反应条件参照食物食品病原菌性副溶血弧菌16S rRNA基因待检测片段的一次PCR扩增。

2.2 PCR扩增产物的检测和回收

将上述一次扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下切取扩增产物检测胶的相应条带，按照胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。

2.3扇贝肉中提取的总基因组待检测片段的二次扩增

以上述胶回收产物为模板，用引物对SEQ ID NO：3/2进行16SrRNA基因待检测片段的二次扩增，PCR扩增体系及反应条件参照上述一次PCR扩增的条件。同时以超纯水、化学合成的DNA片段作为模板分别进行PCR扩增，分别作为阴性对照和标准。

3.DGGE分析

选择10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，取40％、60％胶各15ml,分别加入50μl的TEMED及40μl的10％APS，梯度混合制胶。灌完后，轻轻插入梳子，室温下凝固3小时。待完全凝固后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安有板子的DGGE支架放入电泳槽中，待电泳液温度上升至60℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样样品为超纯水、化学合成的DNA片段和扇贝肉的二次PCR扩增产物，上样量为30μl。在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8小时。电泳完毕，将胶放入2.5×Red Plus染液中染色15分钟，然后用紫色托盘放入紫外分析仪中拍照。从图3可以看到扇贝肉样品条带的与标准条带在同一位置，表明扇贝肉样品中含有食品病原菌性副溶血弧菌。

序列表

SEQ ID NO：1

actcctacgggaggcagcag

SEQ ID NO：2

attaccgcggctgctgg

SEQ ID NO：3

cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggactcctacgggaggcagcag

SEQ ID NO：4

actcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagtcgtgaggaaggtagtgtagttaatagctgcattatttgacgttagcgacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaat

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcctacgg gaggcagcag 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attaccgcgg ctgctgg 17

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg actcctacgg gaggcagcag 60

<210> 4

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 60

tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagcact ttcagtcgtg aggaaggtag 120

tgtagttaat agctgcatta tttgacgtta gcgacagaag aagcaccggc taactccgtg 180

ccagcagccg cggtaat 197