鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其制品用于制备治疗自闭症药物的用途

摘要

本申请提供鼠李糖乳杆菌Probio‑M9及其制品用于制备治疗自闭症药物的用途，本申请通过以小鼠为动物模型的自闭症研究表明，对BTBR小鼠对社交行为异常和新奇事物偏好障碍具有改善作用，能够有效缓解BTBR小鼠的焦虑行为，该菌株兼具有普通食品属性和生物制药菌种潜力，为缓解和治疗自闭症的提供了新策略及理应用依据，且相对成本较低，具有广阔的应用前景和推广价值。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其制品用于制备治疗自闭症药物的用途。

背景技术

自闭症，病症名孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorders，ASD)是一种神经发育性障碍，其起源于儿童早期，以社会交往交流障碍以及重复刻板行为和兴趣为主要症状，发病率近年全球呈急剧上升的趋势，但该病的病因及发病机理尚未明确。研究表明，ASD存在遗传基础，可在某些因素诱导下发病，可诱导发病的因素包括母体免疫因素、自身免疫紊乱因素及自然环境因素等，并且，发病个体常存在脑发育的异常。但是，ASD的病因及发病机制尚不完全明确。

大多ASD患者都患有其他精神和躯体疾病，例如：多动症、情绪障碍、睡眠问题、消化道功能紊乱、免疫问题以及营养与代谢性问题等。研究表明，ASD患者的消化道问题显著，有些ASD患者的消化道问题具有明显表现，例如，表现为便秘、胃酸反流或腹泻，而有些ASD患者的消化道问题无明显症状，但是对这些ASD患者进行胃镜或肠镜等检查，就会发现消化道有异常。

与没有胃肠道问题的孤独症患者相比，有胃肠道问题的孤独症患者表现出更严重的易怒、焦虑和社交回避等症状。通过基因组检测发现，与健康群体相比，ASD群体的肠道菌群组成，包括菌群种类和数量均存在较大差异。

发明内容

本申请的目的之一是提供鼠李糖乳杆菌Probio-M9用于制备治疗自闭症药物的用途，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9的微生物保藏编号为CGMCC No.18639。

所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9分离自健康妇女母乳，其微生物保藏编号为CGMCCNo.18639，分类命名为：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2019年10月8日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

经研究表明，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有优异的胃肠液耐受性和良好的胆盐耐受性，具备作为益生菌的基本条件。

本申请的目的还在于提供一种用于治疗自闭症的制品，所述制品包含鼠李糖乳杆菌Probio-M9，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9的微生物保藏编号为CGMCC No.18639。

在一种可实现的方式中，基于所述制品的总重量或者总体积，所述制品中所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9的含量为1×10

进一步地，所述制品中包括所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9的活菌菌体。

进一步地，所述制品包括直投式发酵剂、益生菌固体饮料、压片糖果和功能药物辅助材料等功能性保健品。

本申请的另一目的在于提供所述制品用于制备以下药物中至少一种的用途：

(A)缓解或治疗孤独症谱系障碍；

(B)改善社交行为异常；

(C)改善对新奇事物偏好障碍。

在一种可实现的方式中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、冲剂、口服液、注射剂、散剂或者丸剂。

可选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料和/或助剂。

本申请的另一目的是提供所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9用于制备以下药物中至少一种的用途，其中，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9的微生物保藏编号为CGMCC No.18639：

(A)缓解或治疗孤独症谱系障碍；

(B)改善社交行为异常；

(C)改善对新奇事物偏好障碍。

在一种可实现的方式中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、冲剂、口服液、注射剂、散剂或者丸剂。

可选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料和/或助剂。

本申请通过以小鼠为动物模型的自闭症研究表明，鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠对社交行为异常和新奇事物偏好障碍具有改善作用，能够有效缓解BTBR小鼠的焦虑行为，本申请提供的鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其制品对于孤独症谱系障碍的缓解和治疗具有重要意义。该菌株兼具有普通食品属性和生物制药菌种潜力，为缓解和治疗自闭症的提供了新策略及理应用依据，且相对成本较低，具有广阔的应用前景和推广价值。

附图说明

图1A示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交性的影响(D22-23)；

图1B示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交新鲜感的影响(D22-23)；

图2A示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交性的影响(D40-41)；

图2B示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交新鲜感的影响(D40-41)；

图3A示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D22-23)；

图3B示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠错误梳理次数的影响(D22-23)；

图4A示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D39-40)理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D39-40)；

图4B示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠错误梳理次数的影响(D39-40)；

图5A示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠探索时间的影响(D28-31)；

图5B示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠识别指数的影响(D28-31)；

图6A示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠探索时间的影响(D45-48)；

图6B示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠识别指数的影响(D45-48)；

图7A示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的总路程的影响(D24)；

图7B示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域路程的影响(D24)；

图7C示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域时间的影响(D24)；

图7D示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立次数的影响(D24)；

图7E示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立时间的影响(D24)；

图8A示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的总路程的影响(D42)；

图8B示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域路程的影响(D42)；

图8C示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域时间的影响(D42)；

图8D示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立次数的影响(D42)；

图8E示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立时间的影响(D42)。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的进行详细阐述。

首先，对本实例所采用的模型进行简单介绍。本实例所采用的模型为BTBR T～(+)tf/J(简称“BTBR”)小鼠模型，BTBR小鼠是一种近交系小鼠，它不仅具有ASD的核心症状：社交减少、社交场合中发出的超声波少、重度的重复理毛行为，同时还具备与ASD类似的脑发育异常以及免疫生化指标异常，是研究自闭症的主要应用模型。以BTBR小鼠模型进行研究，能够反映待试药物能否对ASD患者起到治疗作用。

本申请以下实施例中所采用BTBR小鼠和正常小鼠均为6月龄鼠，通过动物实验阐释鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其制品对自闭症是否具有缓解效果或治疗效果。

(一)实验方法

1.1实验菌株制剂

鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌粉，其中，活菌含量为2×10

1.2实验动物

实验采用6月龄BTBR小鼠和6月龄正常小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，用于孤独症谱系障碍模型建立。

1.3实验设计

两种小鼠分别随机分为3组，每组13只，分别进行孤独症谱系障碍模型处理，实验方法为：

第一组为正常小鼠组成的B6对照组：采食无菌生理盐水；

第二组为BTBR小鼠组成的BTBR-Vehicle组：采食无菌生理盐水；

第三组为BTBR小鼠组成的BTBR-M9组：采食无菌生理盐水，并且，每天灌胃鼠李糖乳杆菌Probio-M9，每天的灌胃总剂量为5×10

行为学试验时间点：分组前(D-4)，第21次给药后(D22-31)，实验结束前(D39-48)。

实施例

试验方法：

(1)适应阶段：将受测小鼠放入装置中(40cm×60cm×22cm)，任其在3个连通的箱室中自由活动10min，以适应环境。

(2)测试阶段：

取出适应好的受测小鼠，并在左右两侧箱室中随机分别放入空笼子(记为“空笼子”)和带有陌生小鼠的笼子(记为“鼠1”)。

轻轻将之前适应好的受测小鼠由中间的箱室中放入使其在内活动10min，记录受测小鼠在左右两个箱室内分别停留的次数(n

向空笼子内放入另一只陌生小鼠(记为“鼠2”)，然后再次将受测小鼠轻轻放入中间的箱室内。记录接下来的10min内，受测小鼠在左右两个箱室内分别停留的次数(n

图1A示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交性的影响(D22-23)；

图1B示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交新鲜感的影响(D22-23)；

图2A示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交性的影响(D40-41)；

图2B示出三箱社交试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠社交新鲜感的影响(D40-41)。

由图1A和图1B可知，B6对照组受试小鼠社会交往行为正常，有社交新奇偏好，BTBR-Vehicle组受试小鼠在测试第二阶段对熟悉鼠(“鼠1”)的偏好程度明显大于“鼠2”。连续给鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌剂21天后，BTBR-益生菌组受试小鼠的社交行为改善作用，但均不具有统计学差异(P>0.05)。

由图2A和图2B可知，B6对照组受试小鼠社会交往行为正常，有社交新奇偏好，BTBR-Vehicle组受试小鼠在测试第一阶段对空笼的接触时间明显多于陌生小鼠(P<0.05)；鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR社交行为异常具有显著的改善作用。

试验方法：

(1)适应阶段：视频录制行为开始前1h将小鼠从动物房带到测试室，做1h环境适应，房间照亮约40Lux。每次的测试时间为17:00～21:00。实验时将小鼠轻轻移入透明观察箱中(规格L×W×H：20cm×20cm×50cm)中并同时进行数据采集。

(2)测试阶段：将每只小鼠放入一个底部铺有垫料的干净观察箱中，摄像机放置在观察箱的正上方。在低光照条件(约40Lux)下，每次预先适应观察箱10min后，再测试记录小鼠行为10min，整个过程试验人员保持安静并远离测试小鼠，观察者保持标准一致并对组别未知，并对10min内的小鼠重复自我梳理行为进行评分。

具体地，用5min作为一个单元间隔，记录每个间隔内累积理毛时间和正确/错误梳理行为次数(回合)，计算平均累积理毛时间(s)和平均错误梳理次数百分比(％)，其中，使用梳理分析算法分析梳理行为回合，一个回合由头至尾顺序为：爪子、脸、身体、腿、尾巴/生殖器；错误梳理次数百分比(％)＝不遵循正常头颅梳理顺序次数/梳理行为总次数。

结果如图3A、图3B、图4A和图4B所示，其中，

图3A示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D22-23)；

图3B示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠错误梳理次数的影响(D22-23)；

图4A示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D39-40)理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间的影响(D39-40)；

图4B示出理毛试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠错误梳理次数的影响(D39-40)。

由图3A、图3B、图4A和图4B可知，服用鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠平均理毛时间以及错误梳理次数百分比不具有明显改善作用。

试验方法：

(1)适应期：第1天，受试小鼠适应测试房间1h，再将受试小鼠放入旷场箱(箱内无物体)内适应20min。

(2)熟悉期：第2天(适应24h后)，受试小鼠适应测试房间1h，再将受试小鼠放入旷场箱内适应至少5min，再将受试小鼠从旷场箱中取出，放置在干净的临时保持笼中约2min。再在旷场箱内同侧左右两端放置两个大小、颜色和质地完全相同的黄色柱形瓶作为熟悉物体，再将受试小鼠背朝所述熟悉物体放入箱内，记录5min内受试小鼠对熟悉物体探究的情况，计时标准为小鼠鼻或口距离物体2cm范围内探究的时间。

(3)测试期：熟悉期2h后，先随机将旷场箱内的一个黄色柱形瓶换为大小相同的绿色锥形瓶作为新奇物体，再将小鼠背朝物体放入箱内，记录5min内小鼠对新奇物体的探索时间(Tn)和熟悉物体的探索时间(Tf)。以识别指数(RI)作为新奇物体识别能力检测指标，其按照RI＝Tn/(Tn+Tf)进行计算。

结果如图5A、图5B、图6A与图6B所示，其中，

图5A示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠探索时间的影响(D28-31)；

图5B示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠识别指数的影响(D28-31)；

图6A示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠探索时间的影响(D45-48)；

图6B示出新物体识别试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠识别指数的影响(D45-48)。

由图5A、图5B、图6A与图6B可知，服用鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠的认知行为不具有明显改善作用。

试验方法：

在低光照条件(约40lux)下，将受试小鼠置于旷场分析箱适应2min后，用动物自发活动视频分析系统测定10min内旷场分析箱中小鼠站立次数、站立时间，总区域活动距离以及中央区活动距离和活动时间。

站立标准：前2肢均离地，并保持1s及以上。

测试数据包括：总路程、中央区域路程、中央区域时间、站立次数、站立时间。

结果如图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、8A、图8B、图8C、图8D和图8E所示，其中，

图7A示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的总路程的影响(D24)；

图7B示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域路程的影响(D24)；

图7C示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域时间的影响(D24)；

图7D示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立次数的影响(D24)；

图7E示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立时间的影响(D24)；

图8A示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的总路程的影响(D42)；

图8B示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域路程的影响(D42)；

图8C示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠活动的中央区域时间的影响(D42)；

图8D示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立次数的影响(D42)；

图8E示出旷场试验中鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠站立时间的影响(D42)。

从图7E以及图8E所示站立时间的指标来看，不论是vehicle组还是益生菌组，B6对照组小鼠的站立时间显著多于BTBR模型小鼠(P<0.05)。服用鼠李糖乳杆菌Probio-M9在给药结束D24/D42，B6对照组小鼠与BTBR小鼠在旷场总区域运动路程、中央区域运动路程及时间指标上未见明显差异(P>0.05)。

本申请以小鼠为动物模型进行的自闭症研究表明，本申请提供的鼠李糖乳杆菌Probio-M9对BTBR小鼠对社交行为异常和新奇事物偏好障碍有一定的改善作用，能够有效缓解BTBR小鼠的焦虑行为，对于孤独症谱系障碍的缓解和治疗具有重要意义。

进一步地，本申请人认为自闭症与肠道菌群失衡及肠-脑轴异常密切相关，本申请提供的益生菌鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其制品以肠道菌群为靶点能够调节肠道菌群组成，改善肠道屏障完整性，进而减少特定肠道代谢产物的渗漏，重建血清中的代谢产物，有效减少重复和强迫行为，减少焦虑和冲动，改善睡眠和社交能力等与孤独症相关的行为习惯，恢复正常肠道菌群、降低炎症和改善孤独症相关行为症状的方法或可成为自闭症有效辅助治疗方案。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。