一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用

摘要

本发明公开了一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，包括以下步骤：1)菌体裂解；2)镍柱亲和纯化；3)酶切；4)镍柱穿透；5)C18‑100A柱纯化；6)C18‑300A反向色谱纯化；7)旋蒸与冻干。本发明提供的可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，采用镍亲和层析法从表达产物中分离Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白，再用酶切将重组特立帕肽从Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白中释放出来，通过三步层析方法制备纯化的重组特立帕肽，简化了纯化过程，提高了可溶性重组特立帕肽的纯化效率与纯度，对制备治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药重组特立帕肽有重要帮助。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与制药工程技术领域，具体涉及一种重组特立帕肽的非变性纯化 方法及应用。

背景技术

人甲状旁腺素(Human Parathyroid Hormone,hPTH)是调节血液中钙磷代谢的主要激 素，由甲状旁腺主细胞分泌，是一种由84个氨基酸组成的多肽，它可与甲状旁腺素受体 结合，对骨代谢发挥双向作用。hPTH受体属于G蛋白偶联受体超家族，受体分为I型和 II型。hPTH-I受体主要分布于骨骼及肾，hPTH-II受体分布于脑和胰腺。甲状旁腺素的N 端肽链与hPTH-I受体结合发挥促进骨细胞生长的作用，而C端肽链与hPTH-II受体结合， 可发挥促进骨细胞凋亡的作用。

人甲状旁腺素1-34肽(hPTH1-34)，又称特立帕肽，是甲状旁腺素在人体内代射的天 然降解产物，由人内源性甲状旁腺素N端的1-34位氨基酸组成。与天然完整的由84个氨基酸组成的hPTH分子相比，特立帕肽保留了完整hPTH促成骨细胞生长的作用，去掉了 促进骨细胞凋亡作用。因此，特立帕肽及其类似物是开发能有效治疗骨质疏松、骨折药物 的潜在候选靶分子，具有广阔的临床应用前景。

由于特立帕肽是一个小分子短肽，不含二硫腱，采用基因工程原核重组表达法进行制 备具有生产规模大、生产成本低、生产周期短等明显优势，是特立帕肽制备最常用方法之 一。由于甲状旁腺素是一个真核细胞分子，在大肠杆菌中进行表达易形成包涵体，需要采 用变性条件先将含特立帕肽的包涵体进行变性溶解，然后在变性条件下通过层析方法进行 纯化和复性。目前，最常用的重组特立帕肽纯化方法多为变性条件的包涵体纯化方法。由 于变性条件包涵体纯化方法需要使用大量的变性剂，如尿素、盐酸胍等，不仅存在生产成 本高、生产周期长、易造成环境污染的缺点，而且生产出来的重组特立帕肽的产量低、纯 度差，不能满足大规模商业化生产的需要。因此，迫切需要开发以可溶性表达的重组特立 帕肽为主的工程菌及发酵、纯化工艺，以提高重组特立帕肽的生产效率。

为解决现有技术以包涵体形式表达重组特立帕肽的纯化困难问题，申请人构建了一种 将甲状旁腺素1-34肽与硫氧还蛋白进行融合表达的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，该菌株经过特定的发酵工艺发酵可获得高可溶性表达水平的硫氧还蛋白甲 状旁腺素1-34肽融合蛋白[Trx-hPTH(1-34)]的发酵产物，本发明在此基础上发明了一种 可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，可以在非变性条件下将重组特立帕肽从Trx-hPTH (1-34)融合蛋白中完整地释放出来，并能有效去除重组表达的特立帕肽中的杂质，获得 的重组特立帕肽纯度可以达至99％以上，从而提高重组特立帕肽的生产效率，为商业化特 立帕肽原料药的生产创造了条件。

发明内容

为解决现有技术中以包涵体形式纯化重组特立帕肽的方法中存在的技术问题，本发明 的目的在于提供一种重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用。

为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：

一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，包括以下步骤：

1)菌体发酵、裂解、离心：将发酵的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵细菌菌体进行裂解，离心，收集裂解产物上清液；

2)镍柱亲和纯化：将步骤1)所得样品上镍亲和层析柱，洗脱结合在镍亲和层析柱上 的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，得到亲和纯化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白；

3)酶切：使用肠激酶对步骤2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白进行切割，使得重组特立帕肽从融合蛋白中释放下来；Trx-hPTH(1-34)融合蛋白经过切割后产生两个肽段：Trx部分肽段和重组特立帕肽hPTH(1-34)；

4)镍柱穿透：将步骤3)所得酶切产物上一个新的镍亲和层析柱，带有6×His标签的 Trx部分肽段结合在镍亲和层析柱上，重组特立帕肽穿过镍亲和层析柱，收集穿透峰，得到初步纯化的重组特立帕肽；

5)C18-100A柱纯化：将步骤4)所得重组特立帕肽样品上C18-100A柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得90％以上纯度的重组特立帕肽hPTH(1-34)；

6)C18-300A反向色谱纯化：取步骤5)C18-100A柱纯化的重组特立帕肽蛋白样品上C18-300A反向色谱柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得99％以上纯度的重组特立帕肽；

7)旋蒸与冻干：将步骤7)所得样品进行加温，负压旋蒸，去除残留乙腈，然后进行真空冷冻干燥。

进一步的，步骤1)中菌体裂解的步骤为：将发酵细菌菌体与柱平衡缓冲液混合、重悬，随后在冰浴条件下剪切、裂解，离心后收集裂解产物上清液，过滤；所述柱平衡缓冲 液的组分包括：25mM Tris-HCl和1-10mM咪唑，柱平衡缓冲液的pH值为7-9。

进一步的，步骤2)中镍柱亲和纯化的步骤为：将步骤1)所得样品上镍亲和层析柱，步骤1)所得样品与层析胶的体积比为1:1-2，上柱结束后先以柱平衡缓冲液洗柱，柱平衡缓冲液体积为镍亲和层析柱柱床体积的2-3倍，以去除未与层析胶结合的杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，收集洗脱峰，得到亲和纯化的Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白，所述洗脱缓冲液的组分包括：50mM醋酸钠和0.5M NaCl，洗脱缓冲液的pH 为2-6。

进一步的，步骤3)中酶切步骤为：将步骤2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白溶液 与10×酶切缓冲液按体积比10：1的比例进行混合，调节溶液的pH值至6-8，随后加入 肠激酶，于4-37℃条件下孵育3-24h后进行酶切，每1IU肠激酶对应加入0.2-2mg Trx-hPTH (1-34)融合蛋白。

进一步的，步骤4)中，镍亲和层析柱的镍亲和胶与步骤3)所得酶切产物的质量比为1000：20-60；通过洗柱液洗柱，用于冲洗非特异吸附的特立帕肽；所述洗柱液的组成 包括：20mM Tris和10-40mM咪唑，pH 8.0。

进一步的，步骤5)中C18-100A柱纯化的步骤为：用2M醋酸钠、乙腈和去离子水 来调节步骤4)获得的初步纯化的重组特立帕肽溶液，使醋酸钠的终浓度达到50mM、乙 腈浓度达至5％，调节溶液pH值为5.5-6.5；装C18-100A柱，层析胶与样品的质量比为 100:0.5-1.0；以10％浓度的乙腈洗柱，再以含50mM NaAc和10％乙腈的平衡液平衡柱； 将初步纯化的特立帕肽溶液上C18-100A柱，上样结束再以5个柱体积平衡液洗柱，然后 用100％乙腈进行梯度洗脱，洗脱梯度15％逐步增加到35％，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE 分析和有关物质含量分析。

进一步的，步骤6)中C18-300A反向色谱纯化的步骤为：采用稀释液按1:3体积比稀释步骤5)所得特立帕肽样品，装C18-300A柱，胶与样品的质量比为100：0.5-1，以10％ 的乙腈洗柱，以去除封柱用的有机溶剂，采用平衡液平衡柱，随后上样，上样结束再以 不少于5个柱体积的洗柱液进行洗柱，然后加入100％乙腈进行梯度洗脱，洗脱梯度由 18％逐步增加到25％，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE分析和有关物质含量分析，获得纯 度>99％的重组特立帕肽。

进一步的，步骤7)中旋蒸与冻干的步骤为：旋蒸过程的加温温度为25-50℃；负压压 力≥0.08Pa；冷冻干燥工艺参数为：

预冻：-36℃、180min；升华：-20℃、1200min，真空度0-60Pa，升温速率30min、10℃；二次升华：-5℃、600min，真空度0-60Pa，升温速率30min、10℃；解析升华: 25℃、1080min，真空度0-60Pa，升温速率30min、10℃。

本发明公开了一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法在制备用于治疗骨质疏松 症和骨折患者药物的原料药特立帕肽中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明建立了非变性条件高纯度重组特立帕肽的纯化方法，简化了纯化过程，提 高了重组特立帕肽的纯化效率与纯度；

2)本发明建立了一种通过镍柱亲和层析-酶切-镍柱穿透将重组特立帕肽从Trx-hPTH (1-34)融合蛋白中释放并初步纯化的方法，该过程不需要使用变性剂；

3)本发明建立了一种通过C18-100A和C18-300A依次吸附、洗脱，然后进行旋蒸的方法来去除重组特立帕肽中杂质的方法。

附图说明

图1为本发明的工作流程框图；

图2为本发明的发酵细菌菌体裂解物SDS-PAGE分析电泳图；图1a为表达产物裂解上清；图2a为表达产物裂解沉淀物；图3a为表达产物裂解上清液的超滤剩余物；图4a 为表达产物裂解上清液的超滤滤过物；图5a为蛋白质标准分子量标志物；

图3为本发明镍亲和层初步纯化样品SDS-page电泳图；图1b为表达产物裂解上清液 上柱样品；2b、3b、4b分别为穿透峰；5b为洗脱峰；6b为人血清白蛋白对照物；M为蛋 白质标准分子量标志物；

图4为本发明Trx-hPTH(1-34)融合蛋白酶切产物SDS-page电泳图；图1c为酶切前rx-hPTH(1-34)融合蛋白；2c为酶切产物；3c为HSA；4c为蛋白标准分子量标志物；

图5为本发明酶切产物镍亲和层析柱穿透样品SDS-PAGE分析电泳图；图1d为 Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的酶切产物；图2d为酶产物离心后的沉淀物；图3d为柱穿透 峰；图4d为柱冲洗峰；图5d为蛋白质标准分子量标志物；

图6为本发明C18-100A柱纯化特立帕肽有关物质分析色谱图；

图7为本发明C18-100A柱纯化特立帕肽有关物质分析峰谱表；

图8为本发明C18-300A柱纯化特立帕肽有关物质分析色谱图；

图9为本发明C18-300A柱纯化特立帕肽有关物质分析峰谱表。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技 术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

如图1-9所示，一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，本发明所用重组特立帕 肽表达产物来源于工程菌：pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)的发酵产物，该融合蛋白由硫氧还蛋白(Trx)、连接肽和特立帕肽(hPTH(1-34))组成，在硫氧还蛋 白与特立帕肽之间的连接肽中带有一个6×His标签和一个肠激酶酶切位点(DDDDK)， 而肠激酶酶切位点正好位于特立帕肽N端的上游。因此，可以采用镍亲和层析法从表达产 物中分离Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，再用肠激酶酶切将重组特立帕肽从Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白中释放出来，然后通过进一步的层析方法制备纯化的重组特立帕肽。

工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)的制备方法包括以下步骤：、构 建编码大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)与人甲状旁腺素1-34肽(hPTH(1-34))的融合蛋白(Trx-hPTH(1-34)的基因序列、酶切连接、构建表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组 表达质粒、诱导表达。

本发明设计了一个编码大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)与人甲状旁腺素1-34肽(hPTH(1-34))的融合蛋白(Trx-hPTH(1-34)的基因序列，全长599个碱基，该基因序列的5’ 端为编码Trx的基因序列，3’端为编码hPTH(1-34)的基因序列，编码Trx肽段的基因 序列与编码hPTH(1-34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，编码Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白基因片段完全由人工合成，全长为599个碱基，其核苷酸序列为SEQ IN NO：3。

为方便重组人甲状旁腺素1-34肽的纯化，在Trx与hPTH(1-34)之间引入一个编码连接肽的DNA序列，该序列中有编码6个组氨酸(6×His)的序列和编码肠激酶酶切位点(DDDDK)的序列，其中，肠激酶序列C端与hPTH(1-34)的N端直接相连，对编码 Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的DNA进行大肠杆菌密码子优化。

为了方便下一步的克隆操作，在Trx-hPTH(1-34)融合蛋白基因序列的5’端引入一个Nco I的酶切位点，在其3’端引入一个Xho I的酶切位点。Trx-hPTH(1-34)融合蛋白 由194个氨基酸组成，理论分子量为21332.18Da，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的核甘酸序 列为SEQ IN NO:1，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IN NO:2，Trx-hPTH (1-34)融合蛋白，其编码核苷酸序列插入在一种表达载体和细胞宿主系统。

本发明的表达载体可以是真核细胞表达载体、酵母表达载体，亦可以是大肠杆菌表达 载体，本发明优选的表达载体是大肠杆菌表达载体，其中，大肠杆菌表达载体可为pGEX 系列、pET系列、pMAL系列、pQE系列、pTrc99a系列、pTrcHis系列、pBV220系列、 pTXB系列、pLLP-ompA系列、pIN-III-ompA系列等，优选pET表达质粒系列，更优选 pET28b(+)。

本发明提供了表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒的构建方法，包括以下 步骤：

1)、首先通过化学合成方法制备一条多聚核苷酸序列片段(Trx-hPTH(1-34))，即编 码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列。该序列含有编码人甲状旁腺素1-34肽[hPTH(1-34)]的核苷酸序列、编码硫氧还蛋白(Trx)以及编码中间连接肽的核苷酸序列，该 多聚核苷酸序列的5’端带有限制内切酶Nco I位点，其3’端带有限制内切酶Xho I位点；

2)、用Nco I、Xho I对步骤1)合成的Trx-hPTH(1-34)基因片段及表达载体pET28b(+)DNA进行限制酶切，酶切产物进行琼脂糖DNA电泳，采用胶回收试剂盒纯化经过 酶切的Trx-hPTH(1-34)DNA片段和表达载体pET28b(+)DNA片段，用T

本发明提供了表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将纯化的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)转化到大肠杆菌宿主菌中进行诱导表达，优选的大肠杆菌宿主菌是E.coli BL21(DE3)。 具体地，将重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)转化到商业化途径获得的大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，通过卡那霉素筛选及蛋白质诱导表达获得能表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，表达Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020年11月23日。

本发明提供了一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，为一种高 水平表达可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵方法，包括以下工艺步骤：

(1)种子活化：将保存在-70℃的工程菌工作种子取出后，置于4℃解冻，随后经分区划线接种到含35μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。

(2)一级种子制备：从LB固体平板上挑取100个单个菌落接种到100ml含卡那霉素35μg/ml的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养3-5h，测定OD

(3)二级种子制备：将一级种子液按1：10-100的比例接种至含卡那霉素35μg/ml的新鲜液体LB培养基中，30-37℃、200rpm培养4-8h，至OD

(4)发酵培养：配制发酵培养基，按1:100的比例接种二级种子液进行发酵培养；

按质量体积百分比计，发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油 1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、 氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0；发酵过程中温度控制在37℃，通过搅拌速度、通气流 量、罐压控制DO>30％，通过补加氨水控制pH在6.9-7.1。

(5)补料：当罐内DO大幅上升至50-70％时开始流加补料，补料液总体积为发酵培养基的十分之一，补料液分为补料I和补料II，补料I的体积是补料II的2倍，补料I流 加结束后接着进行补料II的流加；

补料培养基的组分包括：

补料液I：7％酵母粉，蛋白胨7％，甘油7％

补料液II：7％酵母粉，甘油7％。

(6)诱导：当OD

(7)菌体收集：发酵结束，采用连续离心机对发酵液进行离心，收集菌体，-20℃保存。

本发明公开的编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列、表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)、表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工 程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，还公开了一种提高Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白可溶性表达的发酵方法，可用于生产用于治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料 药人甲状旁腺素1-34(又称为特立帕肽)。表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质 粒及工程菌中不含氨苄青霉素基因，工程菌发酵过程中不需要使用β-内酰胺类抗生素，可 降低环境污染，本发明提供的发酵工艺可使发酵产物中可溶性Trx-hPTH(1-34)融合蛋白 在其总表达量中占比大于80％，可采用非变性条件纯化Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，有助 于提高生产效率。

本发明采用如下步骤制备重组特立帕肽初步纯化产物：

1)菌体裂解

采用低温机械剪切、超声裂解或均质机的方法将发酵的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋 白的发酵细菌菌体进行裂解，离心，收集裂解产物上清液；

2)镍柱亲和纯化

将裂解产物上清液上镍亲和层析柱，用洗脱缓冲液洗脱特异性结合在镍亲和层析柱上 的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白；

3)酶切

用牛肠激酶对Trx-hPTH(1-34)融合蛋白进行切割，使重组特立帕肽从融合蛋白中释 放下来；

4)穿透

将步骤3)的酶切产物上一个新的镍亲和层析柱，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白经肠激酶酶切后，产生两个肽段，其中一个是Trx部分肽段，另一部分为重组特立帕肽。Trx部 分由于带有6×His标签，酶切产物上镍亲和层析柱时这部分蛋白会结合在镍亲和层析柱上， 而另一部分的重组特立帕肽因不带有6×His标签，则从镍亲和层析柱上穿过，收集穿透液 即为初步纯化的重组特立帕肽；

5)C18-100A柱纯化

取镍亲和纯化的特立帕肽样本上C18-100A柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得90％以上 纯度的rhPTH(1-34)；

6)C18-300A反向色谱纯化

取C18-100A柱纯化的rhPTH(1-34)蛋白样品上C18-300A反向色谱柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得纯度在99％以上的特立帕肽；

7)旋蒸与冻干

将纯化的特立帕肽样品装入旋转蒸发瓶中，加温进行负压旋蒸，去除残留乙腈，然后 进行真空冷冻干燥。

步骤1)中，发酵细菌菌体与柱平衡缓冲液混合的重量(g)：体积(ml)比为1：5，并且2-4℃预冷；柱平衡缓冲液包括25mM Tris-HCl和1-10mM咪唑，咪唑浓度优选为5mM； 柱平衡缓冲液的pH值为7-9，优选pH为8.0。

步骤1)中，将重悬的发酵细菌菌液在冰浴中用剪切机剪切菌体，C档，剪切30min，然后在冰浴中以超声功率为1200W、每超声2s暂停2s的条件进行持续超声25min，裂 解菌体。以14400×g、4℃离心30min，收集裂解产物上清液，丢弃可能含包涵体的沉淀 物；用0.45μm滤膜对裂解产物上清液进行过滤。

步骤2)中，将过滤后的裂解产物上清液样品上镍亲和层析柱，样品重量与镍亲和层 析柱的层析胶体积比为1:1-2，上柱结束后先以柱平衡缓冲液洗柱，以去除未与层析胶结 合的杂蛋白，洗柱用柱平衡缓冲液体积为柱床体积的2-3倍；再用洗脱缓冲液洗脱 Trx-rhPTH(1-34)融合蛋白，收集洗脱峰，得到亲和纯化的Trx-rhPTH(1-34)融合蛋白。 所述洗脱缓冲液包括50mM醋酸钠和0.5M NaCl，洗脱缓冲液的pH为2-6，优选pH值 为4.0。

步骤3)中，将步骤2)所获的Trx-rhPTH(1-34)融合蛋白与10×酶切缓冲液按体积比为10:1混合，用1M Tris溶液调节酶切体系的pH值。加入肠激酶，在磁力搅拌下于合 适的温度孵育一段时间，进行行酶切；其中，10×酶切缓冲液包括200mM Tris和20mM CaCl

步骤4)中，将步骤3)的酶切产物上一个新的镍亲和层析胶柱，该镍亲和层析胶柱镍亲和胶与样本的质量比为1000：20-60。

步骤4)中，Trx-hPTH(1-34)融合蛋白经肠激酶酶切后，收集穿透峰，再用洗柱液(20mM Tris和10-40mM咪唑；pH 8.0)冲洗非特异吸附的特立帕肽，优选的咪唑浓度 为20mM，收集冲洗峰，合并穿透峰与冲洗峰即获得初步纯化的重组特立帕肽。

步骤5)中，用2M醋酸钠、乙腈和水来调节步骤4)获得的初步纯化的重组特立帕肽溶液，使醋酸钠的终浓度达到50mM，乙腈浓度达至5％，用醋酸调节pH值至5.5-6.5， 优化的pH值为6.0；随后装C18-100A柱，层析胶的质量(g)与样品量(g)的比例为 100:0.5-1.0，以10％的乙腈洗柱，再以pH 6.0、含50mM NaAc和10％乙腈的平衡液平衡 柱；将初步纯化的特立帕肽溶液上柱，上样结束再以5个柱体积采用pH 6.0、含50mM NaAc和10％乙腈的平衡液洗柱，然后用100％乙腈进行梯度洗脱，洗脱梯度从15％逐步增 加到35％，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE分析和有关物质含量分析。

步骤6)中，用pH 2.3、含50mM Na

步骤7)中，旋蒸过程的加温温度为25-50℃，优选35℃；负压压力≥0.08Pa；冷冻干燥工艺参数为：

预冻：-36℃、180min；升华：-20℃、1200min，真空度0-60Pa，升温速率30min、 10℃；二次升华：-5℃、600min，真空度0-60Pa，升温速率30min、10℃；解析升华: 25℃、1080min，真空度0-60Pa，升温速率30min、10℃。

实施例1

将发酵的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵细菌菌体进行裂解，离心，收集裂解 产物上清液：

取工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)的发酵细菌菌体1000g，用5L柱平衡缓冲液(含25mM Tris-HCl和5mM咪唑；pH 8.0)悬浮；将重悬的菌液在冰浴 中用剪切机剪切菌体，挂C档，剪切30min；然后在冰浴中以超声功率为1200W、每超 声2s暂停2s的条件持续超声25min，裂解菌体；以14400×g、4℃离心30min，收集 裂解物上清液，随后用0.45μm滤膜对裂解物上清液进行过滤，分别取裂解物上清液、沉 淀物、滤过物及超滤剩余物进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，1为裂解上清；2为 裂解沉淀物；3为超滤剩余物；4为滤过物；5为蛋白质标准分子量标志物。从图2可以 看出裂解物上清液中含有大量的目的蛋白Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，沉淀物中目的蛋白 较少。因此，发酵产物中的目的蛋白主要是可溶性蛋白，存在于裂解物上清液中，适合 进行非变性条件的镍亲和层析纯化。

实施例2

Trx-hPTH(1-34)融合蛋白镍柱亲和层析纯化：

用柱平衡缓冲液(含25mM Tris-HCl、5mM咪唑；pH 8.0)按照100ml/min的流速平衡柱，然后将超滤物按100ml/min的流速进行上样，当UV280上升至1500以上时，开始 收集穿透峰(穿透收集开始、中间和结束三个阶段，留样为2、3、4)；上样结束，再用 3L柱平衡缓冲液洗柱，当UV280低于100则停止洗柱；用洗脱缓冲液(50mM醋酸钠、 0.5M NaCl；pH 4.0)按50ml/min的流速进行洗脱，当UV280大于200时，开始收集洗 脱峰(如遇到收集峰有拐点时，换瓶进行收集)；测定收集峰的OD280和OD260，并送 样进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，1为上柱样品，2、3、4分别为穿透峰，5为 洗脱峰，6为HSA；M为蛋白质标准分子量标志物。从图3可以发现，3个穿透峰中均没 有目的蛋白，目的蛋白只存在于洗脱峰中，纯度较高。

实施例3

Trx-hPTH融合蛋白的酶切：

取Trx-hPTH融合蛋白样品25g，加入10×酶切缓冲液(0.5M Tris-HCl溶液和20mMCaCl

实施例4

镍柱穿透：

将酶切产物离心，收集上清液。按50ml/min的流速上一新的镍亲和层析柱，当UV280 上升到10左右时，开始收集穿透峰，上样结束后，再用洗柱液(20mM Tris-HCl、20mM咪唑；pH 8.0)冲洗3个柱体积，收集冲洗峰，并穿透峰合并，测定OD260和OD280；送 样进行SDS-PAGE分析。结果如图5所示，1为酶切产物，2为酶产物沉淀，3为穿透峰， 4为冲洗峰，5为蛋白质标准分子量标志物。图5显示目的蛋白主要存在于穿透峰中，冲 洗峰没有目的蛋白。

实施例5

C18-100A柱纯化：

将镍亲和层析柱初步分离纯化的Trx-rhPTH(1-34)融合蛋白穿透样品，共计6.3L，用2M醋酸钠、乙腈和水的混合溶液来调节，使醋酸钠的终浓度达到50mM、乙腈浓度达 至5％，用醋酸调节pH值达6.0；用10％乙腈以15mL/min流速冲洗C18-100A柱，冲洗 时间为30min；用10个柱体积的流动相A(10％乙腈、50mM醋酸钠；pH 6.0)平衡柱， 流速15mL/min。将镍亲和层析柱初步分离纯化的Trx-rhPTH(1-34)融合蛋白穿透样品以 15mL/min流速上样；上样完毕后，用5个柱体积的流动相A(pH 6.0、含50mM NaAc 和10％乙腈)洗柱，流速为15mL/min；随后用流动相B(100％乙腈)梯度洗脱，洗脱梯 度由从15％逐步增加到35％，总时间40min，流速为15mL/min。根据UV220监测图谱来 收集各洗脱峰，测定各样本的OD280和OD260值，送样进行有关物质分析，结果如图6 和图7所示。从图7可以看出，经C18-100A柱纯化的特立帕肽样品的纯度达到98％，最 高杂质含量为0.56％，纯化效果较好。

实施例6

C18-300A柱纯化：

取C18-100A反向色谱柱纯化的rhPTH(1-34)蛋白样品，用pH 2.3、含50mM Na

实施例7

旋蒸与冻干：

设置旋转蒸发仪的水浴锅的水温，当水温达到35℃，将混合好的样品到入1000ml的 旋蒸瓶中，并安装到旋转蒸发仪上，设定转速50rpm，开启循环水式多用真空泵，开始旋转蒸发。当真空度达到0.09MPa时开始计时，计时15min后旋转蒸发结束。用分光光度 计测量样本的OD280值，并计算总蛋白量(rhPTH(1-34)的吸光系数为1.34，蛋白浓度 的值＝OD280/1.34)。将旋蒸浓缩好的溶液到入干热灭菌好的烧杯后，转移到超净工作台内 分装到灭好菌的中硼硅玻璃管制注射剂瓶中，按5ml/瓶进行分装，然后进行真空冷冻干燥， 冻干条件设定如表1所示。冻干结束后，取样进行质量检验，检测结果显示产品质量符合WHO、USP及进口注册质量标准的要求。

表1

本发明构建了一种将甲状旁腺素1-34肽与硫氧还蛋白融合蛋白表达的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)并首创提出了一种提高Trx-hPTH(1-34) 融合蛋白可溶性表达的发酵方法，该菌株经过特定的发酵工艺发酵可获得高可溶性表达水 平的硫氧还蛋白甲状旁腺素1-34肽融合蛋白(Trx-hPTH(1-34))的发酵产物。本发明在 此基础上发明一种可溶性特立帕肽的非变性纯化方法，可以在非变性条件下将重组特立帕 肽从Trx-hPTH(1-34)融合蛋白中完整地释放出来，并能有效去除重组表达的特立帕肽中 的杂质，获得的重组特立帕肽纯度可以达至99％以上，从而提高重组特立帕肽的生产效率，为商业化特立帕肽原料药的生产创造了条件。

本发明未具体描述的部分采用现有产品或现有技术即可，在此不做赘述。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说 明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。