用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒

摘要

本发明涉及基因工程及肿瘤学技术领域，提供了用于卵巢癌诊断的miRNA标志物，包括miRNA‑210、miRNA‑200b、miRNA‑21和cel‑miR‑39中的一种或多种；miRNA标志物的序列依次为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。该标志物可以区分卵巢良性卵巢肿瘤和卵巢癌；对鉴定不同FIGO分期的卵巢癌患者有指导作用；并且比常规生物标志物CA125能更好地区分卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者。本发明还提供了基于以上miRNA标志物的用于卵巢癌的诊断试剂盒，在反应体系中加入氧化石墨烯，能显著提高检测卵巢癌时的灵敏度和特异性，提高诊断效率。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及肿瘤学技术领域，具体而言，涉及用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒。

背景技术

卵巢癌是三大妇科恶性肿瘤之一，占女性所有肿瘤疾病的4％。由于卵巢处于盆腔深部故发病隐匿且早期无症状，约70％的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率低于30％，而早期卵巢癌患者5年生存率可达90％以上。因此，越早精确诊断越能在早期有效控制病情并提高临床治疗的有效性。目前的临床实验诊断技术主要利用免疫学检查和病理检查进行卵巢癌的联合诊断。免疫学检查中血清糖类抗原CA125是目前临床应用最多的卵巢癌血清标志物，常用于对晚期卵巢癌进行辅助诊断和监测卵巢癌的复发，近年来也被用于早期诊断卵巢癌。但由于仅50％早期卵巢癌患者血清CA125水平会升高，另存在少数卵巢良性疾病也可伴有血清CA125水平升高，因此血清CA125测定对早期卵巢癌的诊断敏感度、特异度及相关组织特异性均有限，且存在较高的假阳性率。此外，常规的病理检查也存在取样困难等缺点，不适于卵巢癌的早期诊断。因此，迫切需要新的诊断生物标志物和技术来完成卵巢癌的早期诊断。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为18-24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，对约30％人类蛋白的表达具有调节作用，参与调控细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。miRNA在多种肿瘤组织中均有特异性的表达谱，参与肿瘤发生、发展、转移的各个阶段，且每一个阶段都有相应的基因发生改变，同时也有调控这些基因的miRNA发生变化。这些异常表达的miRNA在卵巢癌患者的血浆、血清和其他体液中也能被检测到。由于其在体液中的稳定性和对内源性核糖核酸酶的抵抗力，miRNA有望成为卵巢癌的无/微创诊断和预后生物标志物。

最常用的miRNA检测技术是实时荧光定量PCR(Real-time FluorescenceQuantitative PCR,qRT-PCR)，它是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，通过对循环阈值和标准曲线的分析，进而对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。然而，当模板含量过低时，qRT-PCR易出现假阳性结果及非特异性扩增，导致定量不准确。近年来，有研究旨在提升qRT-PCR的性能，以获得更精确的结果。例如：有研究报道，利用C60可提高qRT-PCR的性能(C60 affects DNA replication in vitro bydecreasing the melting temperature of DNA templates,2009,47,1457-1465)；但C60的制作步骤极复杂，成品C60价格又极高，难以在qRT-PCR应用中推广。又有专利报道将石墨烯应用于传统PCR可提高传统PCR的特异性，改善传统PCR的综合优化效果(专利公开号：CN102978201A)；石墨烯能提高PCR特异性是由于其表面全为sp2共轭区域，能够通过π-π共轭吸附单链DNA，减少PCR过程中非特异性扩增的发生；但相较于传统PCR，qRT-PCR要求更为严格，因为qRT-PCR中使用的荧光染料分子(或基团)本身和sp2区域间能形成π-π共轭从而淬灭荧光染料分子的荧光，可导致qRT-PCR检测不到荧光信号，因而难以直接将石墨烯应用于qRT-PCR。

氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是一种二维碳纳米结构，是由填充在蜂窝晶格中的sp2杂化碳原子构成的基础单层。由于其优异的光学、电学和化学性能，近年来GO在生物医学领域引起了广泛的关注。已有研究确定单链DNA能通过六边形石墨单元和核苷酸间形成的π-π堆积相互作用优先吸附在GO表面，而双链DNA则缺乏对GO的亲和力(GrapheneOxide/Nucleic-Acid-Stabilized Silver Nanoclusters:Functional Hybrid Materialsfor Optical Aptamer Sensing and Multiplexed Analysis of Pathogenic DNAs,Journal of the American Chemical Society,2013,135(32),11832-11839)。此外，由于GO的表面含有丰富的含氧官能团(羟基和环氧基)，因此它对水具有优异的亲和力(Structure and chemistry of graphene oxide in liquid water from firstprinciples,Nature Communications,2020,11,1566)。

目前，尚未见报道将氧化石墨烯应用于qRT-PCR的相关技术。我们利用GO优异的水溶性和与引物和单链DNA的非共价相互作用的特性，开发了一种基于GO的qRT-PCR试剂盒对卵巢癌相关的miRNA进行检测，通过对比miRNA标志物的表达水平来判断受检者是否患有卵巢癌。这一试剂盒的开发有助于卵巢癌患者的早期诊断、判断患者预后和评估抗肿瘤药物疗效。

申请内容

本发明的第一目的在于提供一种用于卵巢癌诊断的miRNA标志物，其可以区分良性卵巢肿瘤和卵巢癌；对鉴定不同FIGO分期的卵巢癌患者有指导作用；并且比常规生物标志物CA125能更好地区分卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者。

本发明的第二目的在于提供一种基于上述miRNA标志物的用于卵巢癌的诊断试剂盒。

本发明的实施例通过以下技术方案实现：本发明的用于诊断卵巢癌的miRNA标志物，miRNA标志物为miRNA-210(CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA)、miRNA-200b(UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA)、miRNA-21(ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTG)、cel-miR-39(GCGTCACCGGGTGTAAATC)中的一种或多种。

进一步地，以上miRNA标志物为人血清miRNA标志物。

本发明还提供了基于卵巢癌的miRNA标志物的诊断试剂盒，该诊断试剂盒的miRNA标志物的检测方法为荧光定量PCR。该荧光定量PCR反应体系包括下述4组中任一一组或多组引物和探针；

miRNA-210的引物的序列为SEQ ID No.5(CGCTGTGCGTTGTGACAGC)和SEQ ID No.6(AGTGCAGGGTCCGAGGTATT)，探针的序列为SEQ ID No.13(HEX-CACTGGATACGACTCAGCCGCTGTC-BHQ1)。

miRNA-200b的引物的序列为SEQ ID No.7(GCGCGTAATACTGCCTGGTAA)和SEQ IDNo.8(AGTGCAGGGTCCGAGGTATT)，探针的序列为SEQ ID No.14(HEX-CACTGGATACGACTCATCATTACCA-BHQ1)。

miRNA-21的引物的序列为SEQ ID No.9(ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTG)和SEQID No.10(TGGTGTCGTGGAGTCG)，探针的序列为SEQ ID No.15(HEX-CAATTCAGTTGAGTCAACATCAGTC-BHQ1)。

cel-miR-39的引物的序列为SEQ ID No.11(GCGTCACCGGGTGTAAATC)和SEQ IDNo.12(AGTGCAGGGTCCGAGGTATT)，探针的序列为SEQ ID No.16(6-FAM-CACTGGATACGACCAAGCTGATTTA-BHQ1)。

进一步的，还包括氧化石墨烯，氧化石墨烯与引物的用量比是7.4～10.9μg：0.01μmol。

本发明中的氧化石墨烯(GO)可以选用普通的氧化石墨烯，也可以选用嵌锰的氧化石墨烯。优选为嵌锰的氧化石墨烯。

本发明中的嵌锰的氧化石墨烯的制备步骤为：(1)在25℃下，取石墨、硝酸钠和浓硫酸，混匀，得到混合物A；(2)在25℃下，取硝酸钠、高锰酸钾和浓硫酸，混匀，得到混合物B，硝酸钠与高锰酸钾的重量比为1:5，硝酸钠与浓硫酸的重量体积比为1:140g/ml；(3)在25℃下，将混合物B加入到混合物A中，反应得到嵌锰石墨烯；(4)将步骤3中得到的嵌锰石墨烯加入双氧水，得到氧化石墨烯。其中嵌锰石墨烯与双氧水的重量体积比为1:5g/ml。

本发明的技术方案至少具有如下有益效果：

1.本发明的用于卵巢癌的诊断试剂盒可以区分良性卵巢肿瘤和卵巢癌。

2.本发明的用于卵巢癌的诊断试剂盒对鉴定不同FIGO分期的卵巢癌患者有指导作用。

3.本发明的miRNA标志物比常规生物标志物CA125能更好地区分卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者。

4.本发明的用于卵巢癌的诊断试剂盒有效地检测了肿瘤相关的核酸生物标志物，显著提高了检测卵巢癌时的灵敏度和特异性，提高了诊断效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的卵巢癌与卵巢良性肿瘤血样的miRNA标志物相对表达水平；

图2为本发明实施例2的不同FIGO分期的卵巢癌与卵巢良性肿瘤血样的miRNA标志物相对表达水平；

图3为本发明实施例3的miRNA标志物和CA125的ROC曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

本发明具体实施方式中使用的试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明实施例中所使用的的氧化石墨烯为嵌锰的氧化石墨烯。

实施例1卵巢癌与卵巢良性肿瘤血样的miRNA标志物相对表达水平

1.材料

miRNA标志物、PCR引物以及探针的组合如下所示：

(1)miRNA标志物：miRNA-210；引物：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；探针：SEQ IDNo.13。

(2)miRNA标志物：miRNA-200b；引物：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；探针：SEQ IDNo.14。

(3)miRNA标志物：miRNA-21；引物：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；探针：SEQ IDNo.15。

(4)miRNA标志物：cel-miR-29；引物：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；探针：SEQ IDNo.16。

(5)氧化石墨烯水溶液：9.9μg/ml。

2.步骤

(1)PCR条件：(1)94℃预变性30s，(2)94℃变性5s，(3)60℃退火30s，步骤(2)～(3)重复45个循环。

(2)PCR模板：从卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者血浆提取miRNA并进行逆转录，以此作为模板。

(3)PCR反应体系1：2×probe mix 12.5μL；引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6(各10mM，0.5μL)；探针(SEQ ID No.13)0.5μL；GO水溶液0.5μL，无菌水补足到25μL。用移液枪连续吹吸7-8次以混合均匀。

PCR反应体系2：2×probe mix 12.5μL；引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)(各10mM，0.5μL)；探针(SEQ ID No.14)0.5μL；GO水溶液0.5μL，无菌水补足到25μL。用移液枪连续吹吸7-8次以混合均匀。

PCR反应体系3：2×probe mix 12.5μL；引物(SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)(各10mM，0.5μL)；探针(SEQ ID No.15)0.5μL；GO水溶液0.5μL，无菌水补足到25μL。用移液枪连续吹吸7-8次以混合均匀。

PCR反应体系4：2×probe mix 12.5μL；引物(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)(各10mM，0.5μL)；探针(SEQ ID No.16)0.5μL；GO水溶液0.5μL，无菌水补足到25μL。用移液枪连续吹吸7-8次以混合均匀。

3.结论

如附图1所示，采用2

实施例2不同FIGO分期的卵巢癌与卵巢良性肿瘤血样的miRNA标志物相对表达水平

1.实验材料以及操作步骤与实施例1相同。

2.结论

如附图2所示，采用2

实施例3miRNA标志物和CA125的ROC曲线

1.实验材料以及操作步骤与实施例1相同。

2.结论

如附图3所示，采用2

miR-210、miR-200b和miR-21的AUC值分别为0.855(95％CI，0.734-0.977；敏感性，77.3％；特异性，90.9％)，0.820(95％CI，0.677-0.964；敏感性，72.7％；特异性，95.5％)和0.775(95％CI，0.632-0.918；敏感性81.8％；特异性68.2％)。另外，三种miRNA联合应用对卵巢癌的诊断具有较高的准确性(AUC为0.955；95％CI为0.890-1.000；敏感性为90.9％；特异性为100％。然而，传统的生物标志物CA125在本研究中不能较好地将卵巢癌患者与良性卵巢肿瘤患者区分开来，AUC值为0.652(95％CI，0.484-0.821；敏感性，45.0％；特异性，61.9％)。表明三种miRNA联合应用比常规生物标志物CA125能更好地区分卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者。

综上，本发明的方法有效地检测了肿瘤相关的核酸生物标志物，显著提高了检测卵巢癌时的灵敏度和特异性，提高了诊断效率。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。