抗粒细胞表面抗原的抗体在制备病原体感染检测试剂中的应用

摘要

本发明涉及一种抗粒细胞表面抗原的抗体在制备病原体感染检测试剂中的应用，所述的抗粒细胞表面抗原的抗体为：TIM‑3抗体或IL‑10R抗体，所述的病原体感染检测试剂是指检测机体感染病原体后T淋巴细胞释放细胞因子的检测试剂，所述的细胞因子为伽马干扰素。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种抗粒细胞表面抗原的抗体在制备病原体感染检测试剂中的应用。

背景技术

伽马干扰素释放实验(IGRA)被广泛应用在结核分枝杆菌和其它一些病原感染的诊断中。其基本原理是：机体被外来的病原感染后，会产生一系列的免疫应答反应，其中重要的一条免疫途径是细胞免疫。机体内的T细胞受到抗原的刺激致敏，产生效应T淋巴细胞，当这些T细胞再次受到相同抗原刺激时，会发生特异性免疫反应，分泌多种细胞因子如γ-干扰素。检测释放出γ-干扰素的效应T淋巴细胞可用于受试者是否被特定病原感染的诊断。

血液中的粒细胞，对于T淋巴细胞的γ-干扰素释放反应有阻碍作用。传统方法用ficoll密度梯度离心提取含T淋巴细胞的外周血单个核细胞群(PBMC)，并去除粒细胞。但在一些特殊情况下(血液放置时间过长、受试者血中粒细胞数量很高、受到某些药物治疗)，粒细胞的密度可能发生变化，导致传统密度梯度离心不能完全除去粒细胞，混入PBMC中的粒细胞会阻碍T淋巴细胞的γ-干扰素释放反应，造成假阴性。

发明内容

本发明首先涉及抗粒细胞表面抗原的抗体在制备提升检测病原体感染灵敏度的试剂中的应用。

所述的抗粒细胞表面抗原的抗体为：TIM-3抗体或IL-10R抗体；优选的，所述抗体为：(TIM-3抗体： F38-2E2,eBioscience；IL-10R抗体：556012，BD)。

优选的，所述的检测病原体感染指：检测机体感染病原体后，T淋巴细胞释放细胞因子，优选的，所述的细胞因子为伽马干扰素；

优选的，所述的提升检测病原体感染灵敏度指：提升检测病原体感染的伽马干扰素释放实验(IGRA) 的灵敏度；

优选的，所述的提升检测病原体感染灵敏度是指：降低样本中残留的粒细胞阻碍T细胞释放γ-干扰素的效应。

优选的，所述的病原体是指结核分枝杆菌。

本发明还涉及抗粒细胞表面抗原的抗体在制备检测病原体感染的试剂盒中的应用。

所述的抗粒细胞表面抗原的抗体为：TIM-3抗体或IL-10R抗体；优选的，所述抗体为：(TIM-3抗体： F38-2E2,eBioscience；IL-10R抗体：556012，BD)。

所述的病原体感染指：导致T细胞产生细胞免疫记忆的病原体感染，优选的，所述的病原体为：结核分枝杆菌感染。

本发明还涉及一种用于检测病原体感染后T细胞释放的细胞因子的试剂盒：

(1)所述的试剂盒为免疫检测试剂盒；

(2)所述的试剂盒包含TIM-3抗体或IL-10R抗体，和

(3)所述的试剂盒包含用于检测由于病原体的刺激导致T细胞释放的细胞因子的检测抗体；

优选的，

所述的试剂盒为ELISA试剂盒；

所述的病原体为结核分枝杆菌；

所述的细胞因子为伽马干扰素。

本发明的有益效果在于，

通过我们实验证明，粒细胞对于T淋巴细胞的抑制，主要是通过Galectin-9/TIM-3信号通路进行，用 TIM-3抗体阻断Galectin-9/TIM-3信号通路，可以极大降低粒细胞对T细胞反应的影响。此外，用IL-10R抗体封闭T细胞表面的IL-10受体，对于降低粒细胞对于T淋巴细胞的抑制也有正向协同作用。

在分离PBMC进行IGRA实验时，反应体系中加入1-100μg/mL终浓度的TIM-3抗体，或1-100μg/mL 终浓度的IL-10R抗体，或两者联用，能够有效的降低粒细胞干扰，提升检测灵敏度。

附图说明

图1、加入TIM-3抗体(1A)、IL-10R抗体(1B)后，有效降低粒细胞对T细胞分泌γ-干扰素的影响。

具体实施方式

实验材料：

(1)结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫斑点法，用于检测T细胞受结核分枝杆菌特异抗原刺激后分泌的γ-干扰素，希格生物科技有限公司的产品，货号：XG5020000101)

(2)外周血单个核细胞(PBMCs)：自行提取

(3)粒细胞(从健康志愿者外周血中提取)：

(4)RPMI-1640培养基(不需添加血清)、AIM-V无血清培养基、Ficoll-PaqueTMplus淋巴细胞分离液均为商购；

(5)TIM-3抗体货号为F38-2E2,eBioscience；IL-10R抗体货号为556012，BD；

(6)中性粒细胞(用于抑制T细胞活力)，从健康志愿者外周血中提取，使用天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的人中性粒细胞分离液试剂盒，货号LZS11131；

(7)溶解抗原用的基质溶液：Thermofisher公司的AIM-V培养基，货号：12055083；

实验仪器：

二氧化碳培养箱、酶联斑点分析仪(放大镜)、II级生物安全柜、显微镜、离心机。

实施例1、抗粒细胞表面抗原的抗体能够显著提升检测病原体感染试剂盒的检测灵敏度

(1)使用肝素抗凝的真空采血管采集外周静脉血5mL。

(2)按照Ficoll淋巴分离液的使用说明书分离PBMC。

(3)对分离的PBMC计数，根据计数结果用AIM-V培养基将细胞浓度调至2.5×10

(4)按照实验安排：每个测试样本需3孔(三个小组)，每孔加入25万个PBMC细胞(含T细胞)和5万个中性粒细胞(抑制T细胞活力)，分别为：阴性对照(N)、测试孔(T)、阳性对照(P)，其中：

阴性对照(N)：每孔加入50μL阴性质控溶液(阴性质控：为无抗原的基质液)

测试孔(T)：每孔加入50μL特异性抗原溶液(特异性抗原：主要成分为结核分枝杆菌特异抗原)；

阳性对照(P)：每孔加入50μL阳性质控溶液(阳性质控：主要成分为植物凝集素PHA)；

实验设计分为两大组，每组都是首先加入前述抗原，再加入抗体：

A组：加入TIM-3抗体，分别在相应的N、T、P孔中加入终浓度为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的TIM-3 抗体；

B组：加入IL-10R抗体，分别在相应的的N、T、P孔中加入终浓度为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的IL-10R 抗体；

最后，每个检测孔都加入100μL细胞浓度为2.5×10

5)37℃、5％CO

6)洗涤后使用结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫斑点法)检测A组和B组样品中N、T、P三个小组中的PBMC，酶标液孵育、洗涤、显色，对产生的斑点进行计数，做统计分析。

7)展示加入10μg/mL TIM-3抗体或加入10μg/mL TIM-3抗体后阳性对照孔(P)的斑点图，结果如图1 所示，结果显示，加入10μg/mL TIM-3抗体或加入10μg/mL TIM-3抗体后，能够显著抑制粒细胞对PBMC细胞释放γ-干扰素的影响，提高检测灵敏度和检测线。

8)以本实施例改进后的方法，实测61例疑似结核病人的样本，检测结果如下表所示，结果显示使用本方法改进后的试剂盒，检测灵敏度有了显著的提升。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。