本申请要求享有2018年6月13日提交的美国临时申请顺序号62/684,406的优先权，通过引用将该临时申请的全部内容并入本申请。
技术领域
本公开的实施方案至少涵盖细胞生物学、分子生物学和医药领域。
背景
基于美国心脏协会2018年的报告(1)，2015年美国有836,546人死于心血管疾病(CVD)；每天约有2,300美国人死于CVD，平均每38秒死亡1人。CVD仍然是美国第一大死亡原因。大约9,210万美国成年人正患有某种形式的CVD。除了几种传统的CVD危险因素外，还有许多新的危险因素，最近已认可并进一步研究这些新的危险因素。例如，高尿酸血症已被长期确定为痛风的主要病因性因素。除痛风外，两个世纪前还描述了高尿酸血症与CVD的关系(2)。仅在最近几年，几项大型临床研究已经证实，对几乎所有可能的混杂状况进行广泛调整后，高尿酸血症是CVD(包括缺血性心脏病，心力衰竭和高血压)的重要且独立的危险因素(3-8)。高尿酸血症是心房颤动的独立危险因素(9)。高水平的血清尿酸(SUA)以浓度依赖性方式直接损害心血管系统。对于每增加1mg/dL SUA，冠心病和全因死亡率的总体风险分别增加20％和9％(3-8)。SUA水平提高1mg/dl导致血清胆固醇升高20mg/dl以及收缩压升高10mm Hg的等效风险(10)。SUA水平增加1mg/dL，高血压的风险增加15％至23％(11-14)。每增加1mg/dL，2型糖尿病的风险也增加6％(15)。
美国痛风和高尿酸血症的患病率分别约为4％和21％(16)。2000-2014年间，中国大陆痛风和高尿酸血症的合并患病率分别为1.1％和13-25％(17,18)。在世界的某些地区，痛风和高尿酸血症的患病率分别高达11.7％和41.1(19)。黄嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤分解代谢中的限速酶，生成终产物尿酸；在化学反应过程中，XO还产生活性氧类(超氧化物阴离子和H
非布司他为另一种FDA批准的XO抑制剂药物；然而，它也存在潜在的副作用，这阻碍了其长期施用于无症状高尿酸血症。
在临床试验中，非布司他治疗(无论剂量如何)期按优选术语在LTE研究中出现的10个最常见的治疗相关不良事件为：肝酶升高，ALT升高，肝功能检查异常，AST升高，高脂血症，血肌酐增加，肾结石病，关节炎，血尿素增加和γ-谷氨酰转移酶(GGT)增加(40)。近期报告显示了非布司他引起的肝损伤的临床病例(41)。非布司他不能被推荐用于具有中度或重度肝损伤的患者。导致停用非布司他的最常见不良反应是肝功能检查升高：在某些研究中，多达2-3％的患者发生转氨酶升高大于正常值上限的三倍。然而，这些研究并未在非布司他与肝功能检查升高之间建立剂量效应关系(42)。
在最初的试验中，心血管事件时与非布司他治疗有关的担忧，尤其担忧血栓栓塞事件，心肌梗塞和中风(43)。这是作为非布司他的副作用的非致命性心血管事件的初步证据，导致FDA要求长期心血管研究作为批准该药物的条件。
此外，初始临床研究表明，非布司他也可导致约2％的患者出现皮肤不良反应(44-47)。报道了严重的非布司他超敏反应如SJS和过敏性休克的病例(46,48)。使用非布司他的这些严重不良反应可能与皮肤对别嘌醇的反应史有关，特别是在患有肾衰竭的患者中(46,49,50)。病例报告还显示非布司他诱导横纹肌溶解(51)。因此，目前不推荐非布司他用于无症状高尿酸血的治疗。
目前，开发具有不同药理学机理且毒性更低的更新药物是一个活跃的研究领域。
此外，目前正在积极研究替代药物例如功能食品/膳食健康补充剂和草药的开发，用于长期控制高尿酸血症，其没有不良反应或与目前的XO抑制剂药物相比不良反应更少得多。某些可商购的膳食补充剂可能对降低体内尿酸水平有益，但并非所有用于此目的补充剂都得到了深入科学研究检查支撑。
简要概述
本公开的实施方案包括用于治疗一种或多种医学状况的方法和组合物。在具体实施方案中，所述医学状况是其中抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性在治疗上是有效的医学状况，例如减少医学状况的至少一种症状的存在、严重程度或发作。
本公开涉及替代药物的开发，并且在初始研究中测试了72种传统中草药的XO抑制作用。由于叶酸是最常用的膳食补充剂之一，因此研究了叶酸对XO抑制的动态影响。叶酸及其衍生物已被证明具有XO抑制作用(52,53)。
在具体实施方案中，一些传统中草药具有有效的XO抑制活性；个体草药活性可能与其他草药和/或叶酸和/或叶酸的一种或多种衍生物具有加和作用或协同作用。叶酸及其衍生物5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)是XO抑制剂(52,53)。近期临床试验表明，叶酸补充剂降低高血压患者的SUA水平并降低CVD的风险(54-59)。包括使用传统中草本提取物和/或叶酸和/或叶酸的一种或多种衍生物的本公开的功能食品/膳食补充剂制剂提供了预防和/或治疗多种与XO相关的医学状况的新机会，例如无症状的高尿酸血症。鉴于无症状高尿酸血症的患病率高(在中国和美国约占普通人群的20％)，并且缺乏安全的XO抑制剂药物，该新方法可用于无症状高尿酸血症的长期管理。鉴于无症状的高尿酸血症是CVD和许多其他疾病的独立危险因素，所公开的方法对疾病预防具有巨大的影响。
在具体实施方案中，将包含一种或多种草本提取物的组合物视为非天然的，因为自然界未发现提取物。
上文已经相当广泛地概述了本公开的特征和技术优点，以便可以更好地理解下文的详细描述。在下文中将描述形成本申请权利要求的主题的附加特征和优点。本领域技术人员应当理解，所公开的理念和特定实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本设计的相同目的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求书中所阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述中将更好地理解被认为是本申请中公开的设计的特征的新特征(二者都关于组织和操作方法)以及进一步的目的和优点。然而，应当明确地理解，提供附图每个仅出于示例和描述的目的，未想作为对本公开的限制的定义。
附图简述
为了更完整地理解本公开，现在结合附图进行以下参考说明。
图1显示在无细胞系统中72种传统中草药(标准提取物)的XO抑制作用。在水溶性(蓝色(一对的左侧))和二甲亚砜(DMSO)可溶性(红色(一对的右侧))级分中研究了每种提取物。每种提取物的终浓度为163ug/ml)。蓝色条：DMSO可溶性级分；红色条：每种提取物的水溶性级分。
图2A-2N证实了14种标准草本提取物对无细胞系统中XO抑制的剂量依赖性作用。本测定法中使用了这些提取物的DMSO可溶性级分。
图3显示了叶酸及其两种衍生物二氢叶酸和四氢叶酸在无细胞系统中的XO抑制作用。
图4提供了叶酸、别嘌醇和3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛(DHNB)在无细胞系统中对XO抑制的比较。
图5说明了叶酸、二氢叶酸(DHF)、四氢叶酸(THF)、5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-MTHFR)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、10-甲酰基四氢叶酸(10-FTHF)和6-甲酰基蝶呤的化学结构。
图6说明了叶酸是一种关键的维生素，它在体内具有许多重要的生物学功能，包括DNA和RNA合成，DNA磷脂和用于功能调节的蛋白质的甲基化，高半胱氨酸代谢以降低其毒性以及用于多种功能的甲硫氨酸合成。丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；胸苷酸合酶(TS)；亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)；甲硫氨酸合酶(MS)；S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
图7显示了薄荷叶提取物与相对小浓度叶酸的组合的XO抑制分析。结果显示了薄荷叶提取物与叶酸对XO抑制的加和作用。将薄荷叶提取物和叶酸单独加入XO反应体系，没有预先混合。
图8A-8N显示了中药草本提取物和叶酸的组合对XO抑制的作用。测试了所有14种中药草本提取物。将叶酸(0.167uM)和提取物(13.3ug/ml)单独添加到XO反应体系中，没有预先混合。测定了XO活性。
图9提供了5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)对XO抑制的影响。新鲜制备的5-MTHF以浓度依赖方式抑制XO活性。5-MTHF的IC
图10A-10N显示了5-MTHF和草本提取物的组合体外对XO抑制的作用。将新鲜制备的5-MTHF(3.3uM)和草本提取物(13.3ug/ml)单独添加到XO反应体系中，记录XO活性。5-MTHF与14种草本提取物中的如下10种对XO抑制具有加和作用：木瓜(Flowering Quince)(果实)提取物；芡实(Euryale)(种子)提取物；瞿麦(Fringed Pink)(地上部分)提取物，金银花(Honeysuckle)(花蕾)提取物，鱼腥草(Houttuynia)(地上部分)；香橼(Citron)(果实)提取物；莲子(Sacred Lotus)(种子)提取物；高良姜(Lesser Galangal)提取物；野菊花(Wild Chrysanthemum)提取物；以及薄荷叶(Chinese mint)(图10)，但与丁香(Clove)(花蕾)提取物；山豆根(Vietnamese Sophora)(根)提取物；赤小豆(Rice Bean)提取物；以及浮小麦(Wheat)(未成熟果实)提取物没有加和作用。
图11显示了在无细胞系统中112种草本提取物的XO抑制作用。在DMSO可溶性级分中研究了每种提取物。对于大多数提取物，每种提取物的终浓度为166.7ug/ml)；由于溶解度问题，使用了少量较低浓度的提取物。
图12A-12O显示了在无细胞系统中15种标准草本提取物对XO抑制的剂量依赖性作用。在本测定法中使用了这些提取物的DMSO可溶性级分。
图13A-13H提供了所选择的草本提取物和叶酸的组合对XO抑制的作用。选择并测试了8种草本提取物。将叶酸(0.167uM)和所限定浓度(ug/ml)的每种提取物单独添加到XO反应体系中，没有预先混合。测定了XO活性。
图14显示了在小鼠模型中合理设计的膳食补充剂配方对降低血清尿酸水平的影响。配方包括大蓟(Japanese Thistle)提取物，葡萄籽提取物，余甘子(Amla fruit)提取物，松树皮提取物，薄荷叶提取物和叶酸。给小鼠腹膜内(i.p.)注射尿酸酶抑制剂尿囊毒酰胺(allantoxanamide)以在小鼠中诱导高尿酸血症。然后给小鼠经口-管饲200ul至250ul(对于20至25g小鼠)别嘌醇(阳性对照)或膳食健康补充剂配方(低剂量和高剂量)。在处理后1.5小时和3小时从面静脉取血。第二天用磷钨酸盐方法测量了血清尿酸水平。每组N＝4。
详细描述
如本申请中所使用的，“一个”或“一种”可以表示一个或多个。如本申请权利要求中所使用的，当与措辞“包含”结合使用时，措辞“一个”或“一种”可以表示一种或多于一种。如本申请中所使用的，“另一个”可以表示至少第二个或更多。在具体实施方案中，主题的方面可以例如“基本上由主题的一个或多个要素或步骤组成”或“由主题的一个或多个要素或步骤组成”。主题的一些实施方案可以由主题的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由主题的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。预期关于本申请中描述的任何其他方法或组合物可以实施本申请中描述的任何方法或组合物。
为了与长期的专利法惯例保持一致，当在本说明书(包括权利要求书)中与措辞词语包含一起使用时，词语“一个”和“一种”表示“一个或多个”。本公开的一些实施方案可以由本公开的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由本公开的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。预期关于本申请中描述的任何其他方法或组合物可以实施本申请中描述的任何方法或组合物，并且可以组合不同的实施方案。
如本申请中所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述组合中或彼此不包含的多个要素。例如，“x，y和/或z”可以指单独“x”，单独“y”，单独“z”，“x，y和z”，“(x和y)或z，”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预期的是，x，y或z可以从实施方案中具体排除。
在整个说明书中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的平常和普通含义使用，以表示数值包括用于确定该数值的装置或方法的误差的标准偏差。
在整个说明书中对“一种实施方案”，“一个实施方案”，“具体的实施方案”，“相关实施方案”，“某个实施方案”，“另外的实施方案”或“进一步的实施方案”或它们的组合的提及是指在本发明的至少一个实施方案中包括与该实施方案关联描述的特定特征、结构或特性。因此，在整个说明书中不同地方出现的前述短语不一定全部指的是同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中可以以任何适合的方式组合特定的特征、结构或特性。
可以以范围形式呈现本公开的各个方面。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的硬性限制。因此，应该将范围的描述视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，范围如1-6的描述应视为已具体公开了子范围，如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的个体数值，例如1、2、3、4、5和6。适用该解释，与范围的宽度无关。当存在范围时，该范围可以包括范围端点。
如本申请中所使用的，术语“受试者”可以与术语“个体”互换使用，并且通常是指需要治疗的个体。受试者可以为哺乳动物，例如人，狗，猫，马，猪或啮齿动物。该受试者可以是患者，例如患有或被怀疑患有例如与过度尿酸水平有关的疾病或医学状况或有患与过度尿酸水平有关的疾病或医学状况的风险。对于患有或怀疑患有与过度尿酸水平直接或间接相关的医疗状况的受试者，所述医疗状况可以具有一种或多种类型。该受试者可能患有疾病或被怀疑患有该疾病。该受试者可能无症状。该受试者可以具有任何性别。该受试者可以具有一定年龄，例如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100岁或更老。
本公开的组合物可以适合于治疗人或动物患者的疾病。在一个实施方案中，所述患者为哺乳动物，包括人，马，狗，猫，羊，牛或灵长类动物。在一个实施方案中，所述患者是人。在另一个实施方案中，所述患者不是人。个体可能正在通过万维网接受一种或多种化合物。
如本申请中所使用的，术语“有效量”是意指化合物、药物或药用物质引起例如被研究人员或临床医师寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的量。此外，术语“治疗有效量”意指与未接受该量的相应受试者相比导致改善的治疗、治愈、预防或改善疾病、病症或副作用或降低疾病或病症的进展速率的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
本申请中所使用的术语“治疗”是指与不施用本公开的药物组合物相比，防御或抑制症状，治疗症状，延迟症状的出现，降低症状发展的严重性和/或减少个体遭受的症状的数量或类型。术语治疗包括在姑息环境中的应用。
本公开的实施方案包括一种或多种组合物，其包括一种或多种草本提取物且任选包含叶酸和/或一种或多种衍生物。本申请列出的任一要素均可以与作为组合物的组成部分的任何一个或多个其他要素组合。任何组合物中的一种或多种成分可以赋予加和作用或协同作用。在具体实施方案中，所述的组合物用于治疗或预防多种医学状况，包括其中降低黄嘌呤氧化酶(XO)活性将是有益的医学状况。医学状况的实例包括直接或间接高尿酸血状况的一种或多种，例如痛风，高血压，动脉粥样硬化，冠状动脉疾病，心力衰竭，左心室肥大，心房纤颤，周围动脉疾病，血管再狭窄，血管血栓形成，中风，糖尿病，胰岛素抵抗，代谢综合征，慢性肾疾病，牛皮癣关节炎，微量蛋白尿，勃起功能障碍，先兆子痫，癌症(任何类型)，免疫障碍或炎性疾病。当医学状况是癌症时，其可以是肺、乳腺、脑、肝、结肠、皮肤、胃、前列腺、子宫、子宫内膜、卵巢、睾丸、骨、脾脏、甲状腺、血液、胆囊、肾脏等的癌症。
在一些实施方案中，存在一种组合物，其包含芡实(种子)提取物；赤小豆提取物；浮小麦(未成熟果实)提取物；鱼腥草(地上部分)提取物；香橼(果实)提取物；莲子(种子)提取物；薄荷提取物；小茴香(果实)提取物；小蓟(地上部分)提取物；白扁豆提取物；石决明提取物；炒麦芽提取物；胖大海(种子)提取物；真香薷草(地上部分)提取物；益智仁(种子)提取物；莱菔子(种子)提取物；莲子心(幼芽)提取物；淡豆豉提取物；酸枣仁(种子)提取物；假叶树；乌龙茶(叶)提取物；番泻叶提取物；育亨宾树皮提取物；大蓟提取物；蜂头叶或款冬提取物；紫龙角树皮(野生)提取物；松果菊根提取物；马栗子提取物；可乐树提取物；玉兰树皮提取物；巴西榥榥木提取物；或它们的组合。在这类情况下，可以将该组合物配制成药物、药用食品、补充剂、食品、食品补充剂、营养制品或膳食补充剂、专用膳食应用的食品或医疗食品；或它们的组合。
本公开的任意组合物可以包括如下物质的一种或多种：丁香(花蕾)提取物；山豆根(根)提取物；木瓜(果实)提取物；瞿麦(地上部分)提取物；金银花(花蕾)提取物；高良姜提取物(Alpinia officinarum)；或野菊花(花)提取物；焦山楂(炭化)提取物；甘草(根和根茎)提取物；银杏叶提取物；决明子(种子)提取物；炒枳壳提取物；枳实(幼果)提取物；土茯苓(根茎)提取物；桑枝(小嫩枝)提取物；桑叶(叶)提取物；荷叶(叶)提取物；菊花(花)提取物；紫苏(叶)提取物；薏苡仁提取物；覆盆子提取物；或藿香(地上部分)提取物；非洲芒果核提取物；余甘子粉末；葡萄籽提取物；绿茶提取物；水飞蓟提取物；橄榄叶提取物；松树皮；石榴提取物；留兰香叶提取物；圣约翰草提取物；芦荟提取物；卡图巴树皮提取物；绞股蓝提取物；山楂叶提取物；葛根提取物；香蜂草提取物；甘草提取物；辣木提取物；木瓜提取物；木瓜种子；红三叶草提取物；迷迭香提取物；或它们的组合。
在具体实施方案中，所述的组合物包含芡实(种子)提取物；赤小豆提取物；浮小麦(未成熟果实)提取物；鱼腥草(地上部分)提取物；香橼(果实)提取物；莲子(种子)提取物；薄荷提取物；假叶树提取物；乌龙茶(叶)提取物；番泻叶提取物；育亨宾树皮提取物；大蓟提取物；蜂头叶或款冬提取物；紫龙角树皮(野生)提取物；松果菊根提取物；马栗子提取物；可乐树提取物；玉兰树皮提取物；巴西榥榥木提取物；或它们的组合。在具体情况下，所述的组合物包含芡实(种子)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含赤小豆提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含浮小麦(未成熟果实)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含鱼腥草(地上部分)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含香橼(果实)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含莲子(种子)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含薄荷提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含假叶树提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含乌龙茶(叶)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含番泻叶提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含育亨宾树皮提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含大蓟提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含蜂头叶或款冬提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含紫龙角树皮(野生)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含紫龙角树皮(野生)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含紫龙角树皮(野生)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含松果菊根提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含马栗子提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含可乐树提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含玉兰树皮提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含巴西榥榥木提取物和一种或多种其它化合物。
在具体实施方案中，所述的组合物包含如下成分的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或全部：芡实(种子)提取物；赤小豆提取物；浮小麦(未成熟果实)提取物；鱼腥草(地上部分)提取物；香橼(果实)提取物；莲子(种子)提取物；薄荷提取物；假叶树提取物；乌龙茶(叶)提取物；番泻叶提取物；育亨宾树皮提取物；大蓟提取物；蜂头叶或款冬提取物；紫龙角树皮(野生)提取物；松果菊根提取物；马栗子提取物；可乐树提取物；玉兰树皮提取物；以及巴西榥榥木提取物。
在一些实施方案中，所述的组合物包含高良姜提取物、金银花(花蕾)提取物、薄荷提取物、丁香(花蕾)提取物、香橼(果实)提取物或它们的组合。在具体情况下，所述的组合物包含高良姜提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含金银花(花蕾)和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含薄荷提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含丁香(花蕾)提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含香橼(果实)提取物和一种或多种其它化合物。在具体实施方案中，所述的组合物包含高良姜提取物、金银花(花蕾)提取物；薄荷提取物；丁香(花蕾)提取物；以及香橼(果实)提取物的1种、2种、3种或全部。
在具体实施方案中，所述的组合物包含大蓟提取物；葡萄籽提取物；余甘子提取物；松树皮提取物；薄荷提取物；或它们的组合。在具体情况下，所述的组合物包含大蓟提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含葡萄籽提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含余甘子提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含松树皮提取物和一种或多种其它化合物。在具体情况下，所述的组合物包含薄荷提取物和一种或多种其它化合物。在具体实施方案中，所述的组合物包含大蓟提取物；葡萄籽提取物；余甘子提取物；松树皮提取物；以及薄荷提取物的1种、2种、3种、4种或全部。在具体实施方案中，所述的组合物至少包含大蓟提取物和葡萄籽提取物。
在一些实施方案中，包括一种或多种组合物，其具有叶酸和/或其一种或多种衍生物。在采用XO抑制作用测定法中，可以利用叶酸及其三种衍生物二氢叶酸、四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)中的一种或多种。叶酸和5-MTHF的IC
可以表征在不同的实验条件下，提取物与叶酸或5-MTHF的不同组合的加和作用或协同作用。可以选择一些包含或不含叶酸或5-MTHF的草本提取物的先导组合制剂，并确定对XO抑制具有加和作用和/或协同作用的那些，尽管在一些情况下组合中每种成分的剂量相对小。这些先导组合配方可以在动物模型试验中表征，并最终用于治疗和/预防有症状和无症状的高尿酸血症患者，该高尿酸血症是心血管疾病和许多其他疾病的重要且独立的危险因素。此外，这些基于草本提取物/叶酸的健康补充剂还具有抗氧化能力，降低氧化应激和降低血清高半胱氨酸水平，从而提供多重保健益处。
I.药物组合物和其他组合物
根据本公开，术语“组合物”或“药物组合物”涉及施用于个体的组合物。在一个具体实施方案中，药物组合物或其他组合物包含例如用于肠胃外，透皮，腔内，动脉内，鞘内或静脉内施用的组合物。特别设想将药物组合物口服施用于个体。适合的组合物的施用可以通过不同的方式实现，例如通过口服，静脉内施用，皮下施用，腹膜内施用，肌内施用，局部施用，皮内施用，通过输注，注射或直肠施用，包括例如使用栓剂。
本公开的药物组合物或其他组合物可以进一步包含可接受的载体，例如药学上的可接受的载体。适合载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳剂，例如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包含此类载体的组合物可以通过熟知的常规方法配制。这些组合物可以以适合的剂量施用于受试者。
剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域中所公知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型，体表面积，年龄，被施用的特定化合物，性别，施用时间和途径，一般健康状况和同时施用的其他药物。优选的施用剂量可以在0.24μg至48mg，优选0.24μg至24mg，更优选0.24μg至2.4mg，甚至更优选0.24μg至1.2mg，最优选0.24μg至240mg单位/千克体重的范围内。可以通过定期评估来监控进度。
本公开的组合物可以局部或系统施用。施用通常是肠胃外的，例如静脉内；DNA也可以直接递送至靶部位，例如通过生物射弹递送至体外或体内的靶部位或通过导管递送至动脉中的部位。在一个具体实施方案中，药物组合物通过皮下施用，且在甚至更优选的实施方案中通过静脉内施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。另外，本公开的药物组合物可以包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人体来源的。设想根据蛋白质预期用途的不同，本公开的药物组合物除了蛋白质双特异性单链抗体构建体或编码它们的核酸分子或载体(如本公开中所述)外，还可包含其他生物活性剂。
在一些实施方案中，本申请中所涵盖的任何组合物可被个体消费或以其他方式使用一次或多次。当组合物被消费或以其他方式使用超过一次时，施用之间的持续时间可以约为1-24小时，1-7天，1-4周或1-12个月或更长。诊断表明个体需要该组合物后，该个体可以消费或可以不消费或利用该组合物。在特定方面，相对于一般人群或者作为对照，该个体被诊断为具有过量的尿酸水平，然后该组合物被消费或利用。个体可以通过商业来源，包括通过万维网获得该组合物。
当在本申请中所涵盖的组合物中包含本申请中列出的多于一种要素(例如，提取物的类型)时，这些要素可以具有特定比例或可以不具有特定比例。例如，在某些情况下，可以将组合物中的两种不同要素以如下比例配制：1:1比例、1:2比例、1:5比例、1:10比例、1:25比例、1:50比例、1:100比例、1:500比例、1:1000比例、1:10000比例等。在其中组合物包含三种要素(例如提取物的类型)的情况下，所述比例可以为1:1:1比例、1:2:1比例、1:5:1比例、1:10:1比例、1:50:1比例、1:100:1比例、1:500:1比例、1:1000:1比例、1:1:2比例、1:1:5比例、1:1:10比例、1:1:50比例、1:1:100比例、1:1:500比例、1:1:1000比例、2:1:1比例、5:1:1比例、10:1:1比例、50:1:1比例、100:1:1比例、500:1:1比例、1000:1:1比例等。
在一些实施方案中，一种或多种特定要素的浓度(例如，提取物的类型)可以在一定范围内。例如，组合物中一种或多种提取物的浓度可以在0.1-100mg/kg的范围内。在具体实施方案中，作为实例，组合物中一种或多种提取物可以在0.1-100mg/kg；0.1-75mg/kg；0.1-50mg/kg；0.1-25mg/kg；0.1-10mg/kg/0.1-5mg/kg；0.1-1mg/kg；0.1-0.75mg/kg/0.1-0.5mg/kg；0.5-100mg/kg；0.5-75mg/kg；0.5-50mg/kg；0.5-25mg/kg；0.5-10mg/kg；0.5-5mg/kg；0.5-1mg/kg；1-100mg/kg；1-75mg/kg；1-50mg/kg；1-25mg/kg；1-10mg/kg；1-5mg/kg；5-100mg/kg；5-75mg/kg；5-50mg/kg；5-25mg/kg；5-10mg/kg；10-100mg/kg/10-75mg/kg；10-50mg/kg/10-25mg/kg；25-100mg/kg；25-75mg/kg；25-50mg/kg；50-100mg/kg；50-75mg/kg；或75-100mg/kg的浓度范围内。
本申请所述的任何组合物可以包含在套装产品中。在非限制性实例中，组合物中的一种或多种成分和/或提取草本的试剂可以包含在套装产品中。套装产品组分以适合的容器装置提供。
可以将套装产品的某些成分包装在水性介质中或为冻干形式。套装产品的容器装置通常将包括至少一个小瓶，试管，烧瓶，瓶，注射器或其他容器形式，可以将成分放置在其中并且优选适当地等分。如果套装产品中存在多个组件，则该套装产品通常还将包含第二、第三或其他附加容器，可以将附加成分单独放置在其中。然而，小瓶中可以包含各种成分的组合。该套装产品还典型地包括用于密闭包装以用于商业销售的用具。这样的容器可以包括注射或吹塑塑料容器，在该容器中保留所期望的小瓶。
当套装产品的成分以一种和/或多种液体溶液形式提供时，该液体溶液为水溶液，其中无菌水溶液是特别有用的。在某些情况下，容器装置本身可以为注射器、移液器和/或其他类似的装置，从中可以将制剂施用于人体的感染区域，注入动物和/或甚至施用和/或与套装产品的其他成分混合。
然而，套装产品的成分可以干粉形式提供。当试剂和/或成分以干粉形式提供时，可以通过添加适合的溶剂来重构该粉末。可以设想，溶剂也可以在另一个容器中提供。套装产品还可包含第二容器装置，其用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂。
在具体实施方案中，将组合物在套装产品中提供，并且在某些情况下，组合物基本上是套装产品的唯一组成部分。套装产品可以包含试剂和材料以制备期望的提取物或组合物。在具体实施方案中，套装产品中存在一种或多种器具，其适合于从个体中提取一种或多种样品。该器具可以为注射器、手术刀等。
在一些情况下，除了所公开的实施方案之外，该套装产品还包括第二种疗法，例如除本公开中描述的那些以外的例如一种或多种排尿酸药和/或一种或多种黄嘌呤氧化酶抑制剂。
II.膳食补充剂或保健食品补充剂
本公开的任何草药成分和非草药成分可以以膳食补充剂或保健食品补充剂的形式使用或用作药物制剂，例如以包含本公开组合物的固体、半固体或液体形式使用，作为活性成分，其包括至少在某些情况下与有机或无机载体或适合于体外、肠内或肠胃外应用的赋形剂混合的活性成分。活性成分可以与例如用于片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、混悬液和其他适合使用的任何其他形式的常用的无毒药学上可接受的载体混合。本公开的制剂包括那些包括示例性载体的制剂，所述载体包括例如水，葡萄糖，乳糖，阿拉伯胶，明胶，甘露糖醇，淀粉糊，三硅酸镁，玉米淀粉，角蛋白，胶体二氧化硅，马铃薯淀粉，脲和适用于制造制剂的载体其他载体，其可以为固体、半固体或液体形式，并且还可以使用助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂以及香料。
为了制备固体组合物，例如片剂或胶囊，可以将主要活性成分与载体混合(例如常规的压片成分，例如玉米淀粉，乳糖，蔗糖，山梨醇，滑石粉，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸二钙或树胶和其他稀释剂(例如水)以形成固体预配制组合物，该组合物包含本公开的一种或多种组合物或其无毒的药学可接受的盐的基本上均匀的混合物。在将预配制组合物称为基本上均匀的情况下，是指将活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得该组合物可以容易地细分为同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。然后可以将该固体预配制组合物细分为上述类型的单位剂型，其例如在胶囊中包含0.4mg的本公开的组合物，例如。在某些情况下，可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或以其他方式配混以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量成分，后者为前者的包封形式。在某些情况下，这些成分可以由肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣此类材料，包括多种聚合酸以及聚合酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素这样的材料的混合物。
在其中使用液体形式的情况下，其中可以掺入本发明的新型组合物以通过口服或通过注射施用，例如，它们可以包括水溶液，适当调味的糖浆，水或油混悬液和具有可食用油的调味乳剂，例如棉籽油，芝麻油，椰子油或花生油，以及酏剂和类似的药用媒介物。用于水性混悬液的适合的分散剂或助悬剂包括合成的天然树胶，例如黄蓍胶，阿拉伯胶，藻酸盐，葡聚糖，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
在一个实施方案中，将组合物配制成粉末以与液体例如饮料或肉汤混合。
用于口服的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或混悬液的形式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，以在使用前用水或其他适合的媒介物重构。此类液体制剂可通过常规方法与药学上可接受的添加剂制备，例如助悬剂(例如山梨糖醇糖浆，甲基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如杏仁油，油酯或乙醇)；防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；以及人造或天然色素和/或甜味剂。
对于口腔(颊)施用，该组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
可以配制活性化合物用于通过注射肠胃外施用，其包括使用常规的导管插入技术或输注。注射用制剂可以以单位剂型、例如安瓿或多剂量容器的形式呈现，其中添加防腐剂。该组合物可以采取例如在油性或水性媒介物中的、混悬液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，以便在使用前用适合的媒介物、例如无菌无热原水重构。
III.预防或治疗医学状况的方法
在具体实施方案中，使用本公开的一种或多种组合物预防或治疗医学状况。所述医学状况可以是任何种类的医学状况，并且该医学状况可能已被或可能未被包括东方或西方医学在内的任何种类的医疗执业人员诊断。在具体实施方案中，所述医学状况为与氧化应激直接或间接相关的疾病。例如与标准人群或普通人群相比，所述医学状况可能与个体中尿酸水平过高有关。本公开的组合物和方法可以完全抑制所述医学状况，延迟该医学状况的发作或降低该医学状况的一种或多种症状的严重性。所述医学状况可以为痛风，高血压，动脉粥样硬化，冠状动脉疾病，心力衰竭，左心室肥大，心房颤动，周围动脉疾病，血管再狭窄，血管血栓形成，中风，糖尿病，胰岛素抵抗，代谢综合征，慢性肾疾病，牛皮癣关节炎，微量蛋白尿，勃起功能障碍，先兆子痫，癌症，免疫障碍或炎性疾病。
在具体实施方案中，可以一次或多次将组合物提供给有需要的个体。当以多次提供时，施用之间的持续时间可以是任何持续时间，例如1-60分钟，-24，天，1-4周或1-12个月或更多个月。多次施用的剂量可以相同或不同。
实施例
提出以下实施例以更充分地说明本公开的优选实施方案。然而，它们绝不应被解释为限制本公开的宽泛范围。
实施例1
材料和方法实施例
本发明人仔细选择并且排序来自72种传统中草药的标准提取物(表1)。
所有72种草本提取物(100g)均为粉末形式。将每种提取物分别以50mg/ml的储备浓度在强力涡旋下溶于水或DMSO。将该溶液在室温保持30min，然后以14k rpm离心。将澄清溶液用于XO抑制活性的测定。使用连续分光光度比率测量的方法(60)测定了XO活性。反应混合物在67mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和20nM XO中含有黄嘌呤，其活性为5uU/mL，其中使用或不使用提取溶液。将提取物(0-10ul)与XO在25℃下预温育1min后，添加50uM黄嘌呤以启动尿酸的形成，并以动态模式在295nm监测尿酸的吸收增加。记录XO活性的初始比率。测定了0-10ul的DMSO，发现其对XO活性没有抑制作用。对于草本提取物的初始筛选，每种提取物的最终浓度为163ug/ml。计算抑制百分比：抑制百分比＝(1–测试OD/空白OD)x 100。
叶酸、二氢叶酸和四氢叶酸购自Alfa Aesar(Tewksbury,MA)；5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)；且6-甲酰基蝶呤得自Cayman Chemical(Ann Arbor,Michigan)。叶酸相关分子的XO抑制作用测定法与草本提取物的测定法相似。将叶酸溶于DMSO。研究了叶酸的剂量依赖性和光解作用。包括FDA批准的OX抑制剂药物别嘌醇和小分子XO抑制剂DHNB作为阳性对照。
实施例2
保健食品补充剂/抗氧化剂用于控制高尿酸血症和氧化应激的开发
本申请中提供了针对72种传统中草药的标准提取物的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制测定法(单剂量实验：163ug/ml，使用2个级分)。有14种草本提取物显示出强大的OX抑制作用(在水溶性级分或DMSO可溶性级分中>40％)。有27种草本提取物具有从20％到40％的XO抑制率。其余31种草本提取物对XO的抑制作用弱(<20％)。根据初步文献检索，以前没有报道14种提取物(>40％的XO抑制作用)中的7种，且以前没有报道27种提取物(20-40％OXI)中的12种。这些提取物的DMSO可溶性级分比其水溶性级分为更有效的XO抑制剂。本发明人对这14种提取物(DMSO可溶性级分)的每一种均进行了XO抑制作用的剂量依赖性研究。所有14种提取物均显示出良好的剂量依赖性XO抑制作用曲线。IC
将终浓度为163ug/ml的72种传统中草药在水溶性级分和DSMO可溶性级分中的标准提取物与20nM的XO混合，记录了反应体系中尿酸形成的初始比率；并且计算了每种草药的提取物的XO抑制率。表1列出了所有数据。有14种草本提取物表现出强大XO抑制作用(在水溶性级分或DMSO可溶性级分中>40％)。有27种草本提取物具有在20％至40％之间的XO抑制率。其余31种草本提取物对XO的抑制作用弱(<20％)。
72个项目:
14种提取物:>40％XO抑制作用(根据我们的初步关键词检索，以前没有报道7/14)
27种提取物:20-40％XO抑制作用(根据我们的初步关键词检索，以前没有报道27种中的12种)
31种提取物:<20％XO抑制作用
表1. 72种传统中草药(标准提取物)的XO抑制作用
NA意指：以前没有报道提取物的XO抑制作用
空白意指：经测试提取物没有XO抑制作用，也没有进行文献检索
通常，许多草本提取物的大部分DMSO可溶性级分比其水溶性级分具有更强的XO抑制作用。这些数据表明，在特定的实施方案中，有效的XO抑制性化合物为疏水性的。
从单剂量(163ug/ml)的72种传统中草药标准提取物的XO抑制作用的初始筛选中发现，14种提取物对XO活性的抑制作用超过40％。这些提取物的DMSO可溶性级分比其水溶性级分为更有效的XO抑制剂(图1)。此外，我们对这14种提取物(DMSO可溶性级分)中的每一种都进行了剂量依赖性XO抑制作用测定。每种提取物的浓度范围为0-250或333ug/ml(研究了8至10个剂量)。所有14种提取物均显示出良好剂量依赖性XO抑制作用曲线(图2)。IC
表2. 14种传统中草药(标准提取物)的IC
NA意指：以前没有报道提取物的XO抑制作用。
空白意指：经测试提取物没有XO抑制作用，也没有进行文献检索
在XO抑制作用测定法中采用了叶酸及其两种衍生物二氢叶酸和四氢叶酸。此时将20nM XO与递增浓度的叶酸、二氢叶酸和四氢叶酸混合。与阴性对照相比，尿酸形成的初始比率显示出浓度依赖性的降低，这反映XO活性的降低(图3)。叶酸、二氢叶酸和四氢叶酸在2uM内的剂量范围显著抑制XO活性。XO抑制的效力显示二氢叶酸>四氢叶酸>叶酸。与别嘌醇和DHNB相比，叶酸具有强于别嘌醇和DHNB的XO抑制作用(图4)。叶酸、别嘌醇和DNHB的半数最大抑制浓度(IC
某些实施方案的重要性(叶酸为XO抑制剂)
叶酸盐和叶酸是水溶性B族维生素的形式。它是人体制造DNA、RNA和代谢氨基酸(它们是细胞分裂和许多生理功能所需要的)所必需的。由于人类无法制造叶酸，因此需要从膳食中获取叶酸，使其成为必需维生素。叶酸盐是存在于许多全食，包括叶类蔬菜，豆类，蛋类，柑橘类水果，鳄梨和牛肝脏中的维生素B9的常见形式。尽管叶酸是维生素B9的合成形式，其可添加到加工食品中，并且是补充剂中的常用形式。叶酸是叶酸盐的一种氧化形式，并且其分子结构与叶酸盐(盐形式)几乎相同。叶酸比生理类型的叶酸盐更稳定。自1998年以来，根据美国联邦法律要求，叶酸已被添加到冷麦片，面粉，面包，面食，烘焙食品，饼干和薄脆饼干中。超过50个国家正在这样做。该法规的目的在于试图减少神经管缺陷(NTD)的患病率，NTD是一种常见的先天缺陷，其显示与母亲的维生素B9摄入量有一定关联。除NTD外，叶酸盐缺乏会导致许多健康问题，例如生长缓慢，巨幼细胞性贫血，体重减轻，消化障碍，白细胞减少症，血小板减少症，舌/口腔开裂/发红，腹泻，肝病，癌症，心血管疾病，抑郁症和其他行为改变(93-96)。因此，叶酸补充剂对包括预防和治疗许多疾病在内的人类健康的改善和维持具有巨大影响。
在叶酸被人体利用之前，它必须先经历两次转化，首先转化成二氢叶酸盐(DHF)，然后再转化成为四氢叶酸(THF)。THF可以转化为5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-MTHFR)和10-甲酰基四氢叶酸(10-FTHF)以及5-甲基四氢叶酸(5-MTHF，左旋叶酸)，其为人体许多关键功能需要的叶酸盐的最终形式(图5)。最重要的叶酸盐依赖性反应之一为DNA形成过程中脱氧尿苷酸甲基化为胸苷酸，这是适当细胞分裂所必需的。该反应的损害启动一个过程，该过程可能导致巨幼细胞性贫血，它是叶酸盐缺乏的标志之一。另一种叶酸盐依赖性反应为在合成S-腺苷甲硫氨酸中高半胱氨酸向甲硫氨酸的转化。高血红细胞血症(Hcy)有毒，为心血管疾病和许多其他疾病的熟知危险因素(97)。Hcy降解所必需的化学反应需要叶酸、维生素B6和B12存在。折叠酸对于DNA的甲基化、磷脂和蛋白质的功能调节以及几种重要的神经递质(如5-羟色胺、肾上腺素和多巴胺)的合成也很重要(图6)。此外，有证据表明叶酸发挥直接和间接抗氧化作用，例如自由基清除(98)。
亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是调节这种转化过程的关键酶。然而，据估计至多60％的美国人存在遗传变异，其降低了他们自身从叶酸转化5-MTHF的能力。对于那些具有这种遗传变异的人，补充叶酸可能会导致转化的5-MTHF形式的数量发生变化，潜在地使人体保留的比其需要的少。此外，它可能导致体内叶酸形式的积累。这就是为什么对于那些从膳食中摄入不足的人来说，补充5-MTHF可以被认为优于使用叶酸。THF仅以(不稳定)还原形式具有活性，因此不适合口服补充。通常，补充推荐量的叶酸和5-MTHF是安全和有益的。来自叶酸的毒性风险很低，因为叶酸盐是一种水溶性维生素，并且可通过尿液定期从体内排出(99)。对于一般人群，低于1000μg/天的所确立的可耐受上限摄入水平(UL)的叶酸摄入与任何不良健康结果均无关联(100)。然而，过量摄入叶酸可能与包括癌症在内的重大健康风险相关(101-103)；这一风险问题仍在争论中，尚未得到证实。实际上，叶酸缺乏通过引起基因组不稳定性以及基因组中甲基化模式的改变来增加致癌作用的启动，从而导致癌基因和肿瘤抑制基因的表达发生改变(100)。
1948年首次报道了叶酸对XO抑制作用的影响(104)；随后，在1950年同一研究团队报道，这种抑制作用归因于叶酸的光解产物蝶呤6-醛(2-NH,-4-OH-蝶啶-6-醛)(105)。这种观点持续至1980年代(106，107)。直到1989年，采用不同方法进行的进一步实验证实，尿酸及其衍生物实际是有效的XO抑制剂(108)。THF和DHF的XO抑制作用强于叶酸(107，109)。研究表明，5-MTHF可在体外和体内有效抑制XO活性(110)。已知叶酸对紫外线(UV)辐射敏感(111-116)；当暴露于紫外辐射时，它可以裂解成对氨基苯甲酰基L-谷氨酸和6-甲酰基蝶呤。当继续照射时，6-甲酰基蝶呤被降解为蝶呤-6-羧酸(117)。6-甲酰基蝶呤在体外是一种非常有效的XO抑制剂；而蝶呤-6-羧酸则没有XO抑制作用(117)。
像人类一样，禽类(如鸡和鹌鹑)缺乏尿酸酶；它们的血尿酸水平通常高于具有尿酸酶的小鼠或大鼠，尿酸酶将尿酸代谢为5-羟基异尿酸酯(118)。实际上，痛风是鸡的一种常见疾病，并且与普通禽类的5-7mg/dL相比，其尿酸血水平可以高达44mg/dL。膳食叶酸补充剂可显著抑制雏鸡的肝脏XO活性(119,120)。近期项研究表明，膳食叶酸补充可显著抑制老年下蛋母鸡的血清尿酸(121)。在小鼠模型中叶酸和别嘌醇(12.5-50mg/kg)的腹膜内施用显著抑制了辐射诱导的XO活化(122)。在大鼠模型中，每天口服补充叶酸显著降低了血清尿酸水平及其相关的肾脏病理状况(123)。此外，在动物模型中补充叶酸可以预防心血管疾病(124-126)和肾疾病(127)，抑制肿瘤发生(128)并增强抗肿瘤化疗的功效(129)。
已经报道了针对高尿酸血症和/或痛风患者的叶酸膳食补充剂的研究。病例-对照研究表明，高叶酸盐摄入可预防痛风(130)。在成人高血压患者中，在具有升高UA浓度或基线高尿酸血症的患者中每天施用10mg依那普利联用0.8mg叶酸对血清UA水平的有益效果比单独10mg依那普利的更大(54,55)。此外，在临床试验中补充叶酸可以降低心血管疾病和慢性肾疾病的风险(56-59,131)。
可以证实叶酸或5-MTHF对控制高尿酸血症的功效，并且在特定的实施方案中，作为一个实例，将其包括在与作为膳食健康补充剂的传统中草药或其他植物成分组合的一种或多种配方中，以长期管理高尿酸血症。叶酸可以是本申请涵盖的任何组合物的成分之一，在某些实施方案中和在特定的实施方案中，它可以增强联合疗法的治疗功效。
基于草本提取物和叶酸的剂量依赖性XO抑制作用实验的结果，将相对较低浓度的每种提取物(总计14种提取物)和叶酸用于组合测定。最初，薄荷叶提取物(6.67ug/ml)和叶酸(0.167uM)分别抑制XO活性25.85％和16.49％。这些浓度的薄荷叶提取物和叶酸的组合显示出34.4％的XO抑制作用(图7)。显然，薄荷叶提取物和叶酸的组合显示对XO抑制具有加和作用。这种组合补充剂的重要优点之一在于增强了补充剂的XO抑制功能；同时降低了每种成分的剂量，由此减少了长期使用补充剂的潜在副作用。
此外，还针对叶酸和包括薄荷提取物在内的所有14种传统中草药提取物的每一种进行了组合测定。将叶酸(0.167uM)和提取物(13.3ug/ml)单独添加到XO反应体系中，没有预先混合。测量了XO活性。14种提取物中有9种与叶酸显示了加和XO抑制作用(图8)。这些有效的提取物为薄荷提取物(薄荷叶)；|丁香(花蕾)提取物(丁香)；山豆根(根)提取物(山豆根)；木瓜(果实)提取物(木瓜)；金银花(花蕾)提取物(金银花)；鱼腥草(地上部分)提取物(鱼腥草)；香橼(果实)提取物(香橼)；高良姜提取物(高良姜)；以及野菊花(花)提取物(野菊花)。
5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)被视为叶酸补充剂的优良形式。研究表明，5-MTHF可在体外和体内有效抑制XO活性(90)。本发明人已经证实5-MTHF在体外以浓度依赖的方式有效抑制XO活性(图9)。5-MTHF的IC
在一些实施方案中，使用预混合用于叶酸或5-甲基四氢叶酸和各体提取物对XO抑制的作用。在完成单一提取物与叶酸的组合的研究后，可以进一步表征多种草本提取物与叶酸的组合。还可以表征不含叶酸和/或5-甲基四氢叶酸的多种草本提取物的组合对XO的抑制作用。
可以将XO活性测定扩展到更多的中草药提取物和其他植物成分，并研究在含有或不含叶酸和/或5-甲基四氢叶酸的情况下这些药剂之间它们的加和作用或协同作用。关于XO抑制作用研究，可以筛选和表征几种含有或不含叶酸或5-MTHF的草本提取物的先导组合配方的动物模型测试且最终用于治疗和/或预防有症状和无症状的高尿酸血状况的患者，高尿酸血状况为心血管疾病和许多其他疾病的重要且独立的危险因素。
实施例3
膳食健康补充剂/抗氧化剂用于控制高尿酸血症和氧化应激的具体实施方案
本公开的实施方案包括例如能够减少血尿酸，减少氧化应激和/或降低痛风和心血管疾病的风险的组合物(例如保健食品补充剂或功能食品)。在这样的实施方案中，为了开发新的，安全的保健食品补充剂或功能食品用于控制高尿酸血症和氧化应激，尤其长期使用于预防和治疗痛风和高尿酸血症引起的心血管疾病的目的，可以选择，表征，优化，增效和配制某些中草药的提取物和/或常规食物产品以及维生素，矿物质和营养素。例如，对于该实施方案，可以利用XO酶活性测定的无细胞系统和小鼠模型。
可以采用膳食保健补充剂产品的有效原料的体外筛选，并开发更有效的处方/配方来抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性和氧化应激(多种底物和组合，加和作用，协同作用)。可以使用急性(短期)动物研究来表征膳食健康补充剂处方/配方用于控制高尿酸血症的有效性和毒性。还可以使用慢性(相对长期)动物研究来确定膳食健康补充剂处方/配方用于控制高尿酸血症的有效性和毒性。
在具体实施方案中，一些传统中草药具有有效的XO抑制活性以及抗氧化活性；个体草本活性可以与其他草药和/或与叶酸和/或叶酸的一种或多种其衍生物具有加和作用或协同作用，例如(叶酸及其衍生物为XO抑制剂(52,53)。在特定方面，包括传统中草药提取物和(在某些情况下)叶酸和/或一种或多种其衍生物的本公开的功能食品/膳食补充制剂提供了对无症状高尿酸血症的新的预防和/或治疗，用作预防和/或治疗。在具体情况下，本公开的组合物提供了对无症状高尿酸血症的长期管理(无症状高尿酸血症是CVD的独立危险因素)且因此影响CVD预防。
本公开的特定实施方案提供了叶酸或5-MTHF对控制高尿酸血症的功效的确认，并且可以与传统中草药和/或其他植物成分一起作为膳食健康补充剂包括在内，例如用于长期管理高尿酸血症。叶酸可以是组分的一种，并且它可以增强联合疗法的治疗功效。
组合物中可以包括的草本提取物的实例包括如下一种或多种：
表3:草本提取物
另外，下列组合物的一种或多种可用于本公开中的任何组合物中。这些维生素可与本公开的组合物具有加和作用或协同作用，例如用于控制高尿酸血症、氧化应激和/或高同型半胱氨酸血症，其为心血管疾病和许多其他疾病的危险因素。因此，本公开的任何组合物，包括采用下列成分的组合物，均可以用作预防性组合物。
表4:选择的维生素补充剂
表5中的下列项目可以用于本公开的任意组合物中。
表5:另外的草本提取物
实验设计的实例如下。为了初始筛选个体提取物的XO抑制作用和抗氧化作用，可以采用任何适合的方法，至少包括以下方法：
方法(1):
黄嘌呤氧化酶(XO)抑制测定法(使用一种或多种底物浓度进行筛选)。详细的方法描述在以前的出版物中(132)。
方法(2):
DPPH(2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼基)清除测定法(使用一种底物浓度进行筛选)。通过监测在429nm处吸收的减少，以光学方法测量试验化合物清除DPPH自由基的能力。将该化合物的抗氧化活性与维生素C和维生素E的抗氧化活性进行比较。详细的方法描述在我们以前的出版物中(132)。
可以基于选定的有效健康补充剂原料来研究和开发有效的处方/配方(可以实施多种底物和组合，加和作用，协同作用)。如果来自原料的初始筛选结果鉴定出一组抑制XO活性的提取物，则可以利用有效标准提取物进行进一步表征研究。扩展这些选定材料的浓度范围并将其与其他材料混合。在某些情况下，可以在体外试验中测试个体草本提取物与叶酸、5-MTHF或其他草本提取物的不同组合对XO抑制作用和抗氧化潜能的影响。表征这些组合的任何加和作用或协同作用。如果存在成分的加和作用或协同作用，则可以将这类成分用于组合制剂(例如，组合中每种成分小量)，以实现最大的治疗效果，同时减少每种成分的潜在副作用，并至少在某些情况下降低长期管理高尿酸血症的耐药性的潜在风险。
用于研究的材料:
根据体外实验的结果，在动物研究中表征与叶酸/5-MTHF组合或不与其组合的草本提取物的有效处方/配方。在具体实施方案中，每种制剂可以包含3-5种个体提取物或天然化合物/维生素补充剂。在动物实验中在组合制剂中测试个体成分之前，可以或可以不在动物实验中测试它们。在具体实施方案中，在动物实验中仅表征作为整体的处方/配方。
研究设计的实例:
A.用于动物研究的选定组合处方的配制和表征
基于初始研究，草本提取物的DMSO可溶性级分比其水溶性级分具有更强的XO抑制作用。DMSO溶解提取物中的极性和非极性化合物。DMSO有效将广泛范围的化合物引入溶液中。从初始研究中选出的每种草本提取物都将进一步用DMSO提取并冷冻干燥(冻干)。通过体外XO活性测定法和DPPH清除测定法分别再确证了每种DMSO提取物的XO抑制作用和抗氧化潜能。可以选择一种或多种油，例如一种或多种食用油(例如，油酸，肉豆蔻酸异丙酯，中链甘油三酸酯，橄榄油，蓖麻油，花生油，玉米油，芝麻油，大豆油，杏仁油，亚麻籽油，菜籽油，向日葵油，椰子油，花生油和/或棕榈油)，以便混合这些提取物供动物施用(经口管饲)。
B.小鼠中高尿酸血症和毒性的急性模型
可以在尿囊毒酰胺处理的小鼠中测定所述制剂的降血尿酸的作用。腹膜内(i.p.)注射尿酸酶抑制剂尿囊毒酰胺可以有效地阻止尿酸向5-羟基异尿酸酯转化，且因此导致小鼠中血清尿酸水平显著增加，提供了高尿酸血症动物模型。可以在充分表征的小鼠模型中表征所选制剂的降血尿酸作用(表6)。选定的制剂将经口管饲施用于小鼠。在以前的出版物中描述了详细的方法(132)。
表6:用于研究XO抑制剂的降血尿酸作用的动物分配实例
小鼠中的毒性。可以研究选定制剂在小鼠中的潜在毒性，研究聚焦于低剂量和高剂量(经口施用)。可以包括阴性对照和别嘌醇对照。可以每天一次经口管饲将配制的健康补充剂施用于小鼠，持续15天。主要终点包括一般健康状况和体重，血细胞计数，血液化学和酶(包括肝、心脏和肾脏功能组)和器官组织学(表7)。
表7.用于研究XO抑制剂的潜在毒性的动物分配
研究设计:
尿酸酶敲除小鼠的慢性高尿酸血症模型：在小鼠和许多其他哺乳动物中，尿酸的正常血液水平相对低(1-2mg/dL)，因为尿酸被尿酸酶进一步氧化为尿囊素(Chen,Lu等人,2016)。在大约1500万年前人类和高等灵长类动物丧失了尿酸酶，这导致比这些低等动物相对更高的血清尿酸(SUA)水平。为了建立慢性高尿酸血症的动物模型，科学家们创建了尿酸酶(Uox)基因敲除小鼠，其显示出严重的高尿酸血症和尿酸肾病(133)。在别嘌醇的维持下，成年的尿酸酶-/-小鼠显示出相对低的SUA(2-4mg/dL)。但是，一旦停止服用别嘌醇，则尿酸酶-/-小鼠将在一周内具有高SUA水平(6-10mg/dL)。所选制剂的长期降血尿酸血症作用可通过使用尿酸酶敲除小鼠来测定。选定的制剂将经口管饲每天施用一次，持续2周，或者通过饮用水施用2个月。将血清尿酸水平每两天或每周测试一次。在本研究过程中，将监测包括体重在内的一般健康状况。当处死小鼠时，将对血细胞计数，血液化学和酶(包括肝，心脏和肾脏功能组)和器官组织学进行研究(表6)。据估计，当前实验将需要每种材料约500克。从PLAN I研究中选出的每种草本提取物均用DMSO进一步提取并冷冻干燥。分别通过体外XO活性测定法和DPPH清除测定法再确认每种DMSO提取物的XO抑制作用和抗氧化潜能。可以选择一种或多种油，例如一种或多种食用油(例如，油酸，肉豆蔻酸异丙酯，中链甘油三酸酯，橄榄油，蓖麻油，花生油，玉米油，芝麻油，大豆油，杏仁油，亚麻籽油，菜籽油，向日葵油，椰子油，花生油和/或棕榈油)，以便混合这些提取物用于动物施用(经口管饲)。
表8.用于研究XO抑制剂的降血尿酸作用和潜在毒性的尿酸酶-/-小鼠分配
本说明书中提及的所有出版物表示本公开所属领域的技术人员的水平。所有出版物通过引用并入本说明书，就如同具体和单独说明通过引用将每个单独出版物并入一样。
1.Benjamin EJ,Virani SS,Callaway CW,Chamberlain AM等人American HeartAssociation Council on Epidemiology and Prevention Statistics Committee andStroke Statistics Subcommittee.Heart Disease and Stroke Statistics-2018Update:A Report From the American Heart Association.Circulation.2018年3月20日；137(12):e67-e492.
2.Galassi FM,Borghi C.A brief history of uric acid:from gout tocardiovascular risk factor.Eur J Intern Med.2015；26:373.
3.Borghi C,Desideri G.Urate-lowering drugs and prevention ofcardiovascular disease:The emerging role of xanthine oxidaseinhibition.Hypertension,2016；67(3):496–98
4.Li M,Hu X,Fan Y等人:Hyperuricemia and the risk for coronary heartdisease morbidity and mortality a systematic review and dose-response meta-analysis.Sci Rep,2016；6:19520
5.Storhaug HM,Norvik JV,Toft I等人:Uric acid is a risk factor forischemic stroke and all-cause mortality in the general population:A genderspecific analysis from The
6.Tian Zuo,Xuehui Liu等人Hyperuricemia and coronary heart diseasemortality:a meta-analysis of prospective cohort studies.BMC CardiovascularDisorders,2016:16:207.
7.Loeffler LF,Navas-Acien A,Brady TM等人Uric acid level and elevatedblood pressure in US adolescents:national health and nutrition examinationsurvey,1999-2006.Hypertension,2012,59(4):811-817.
8.Fan Y,Wei F,Lang Y等人Losartan treatment for hypertensive patientswith hyperuricaemia in Chinese population:a meta-analysis.J Hypertens,2015,33(4):681-688；discussion 689.
9.Kuwabara M,Niwa K,Hisatome I.Hyperuricemia is an independent riskfactor of atrial fibrillation.Journal of the American College of Cardiology2014:63(12)增刊.DOI:10.1016/S0735-1097(14)60469-1
10.Alderman MH:Serum uric acid as a cardiovascular risk factor forheart disease.Curr Hypertens Rep 2001；3:184–189.
11.Kuwabara M,Niwa K,Nishi Y等人:Relationship between serum uric acidlevels and hypertension among Japanese individuals not treated forhyperuricemia and hypertension.Hypertens Res 2014；37:785–789.
12.Grayson PC等人Hyperuricemia and incident hypertension:a systematicreview and meta-analysis.Arthritis Care Res(Hoboken).2011；63(1):102–10.
13.Mazzali M,Hughes J,Kim YG等人Elevated uric acid increases bloodpressure in the rat by a novel crystal-independent mechanism.Hypertension,2001,38(5):1101-1106.
14.Biscaglia S,Ceconi C,MalagùM等人Uric acid and coronary arterydisease:an elusive link deserving further attention.Int J Cardiol,2016,213:28-32.
15.Lv Q等人High serum uric acid and increased risk of type 2diabetes:a systemic review andmeta-analysis of prospective cohort studies.PLoSOne.2013；8(2):e56864.
16.Zhu Y等人Prevalence of gout and hyperuricemia in the U.S.generalpopulation:The National Health and Nutrition Examination Survey 2007–2008.Arthritis Rheum.2011,63,3136–3141.
17.Liu R,Han C,Wu D等人:Prevalence of hyperuricemia and gout inmainland China from 2000to 2014:A systematic review and meta-analysis.BiomedRes Int,2015；2015:762820
18.Smith E等人Global Prevalence of Hyperuricemia:A Systematic Reviewof Population-Based Epidemiological Studies.Arthritis Rheumatol.2015；67(suppl10).
19.Chou CT,Lai JS.The epidemiology of hyperuricaemia and gout inTaiwan(中国台湾)aborigines.Br J Rheumatol,1998；37(3):258–62.
20.Chen C,LüJM,Yao Q.Hyperuricemia-Related Diseases and XanthineOxidoreductase(XOR)Inhibitors:An Overview.Med Sci Monit.2016Jul 17；22:2501-12.
21.MacIsaac RL,Salatzki J,Higgins P,Walters MR,Padmanabhan S,Dominiczak AF等人Allopurinol and cardiovascular outcomes in adults withhypertension.Hypertension 2016；67,535–540.
22.Chen JH,Lan JL,Cheng CF等人Effect of urate-lowering therapy on therisk of cardiovascular disease and all-cause mortality in patients with gout:a case-matched cohort study.J Rheumatol.2015；42(9):1694-701.
23.Chen JH,Lan JL,Cheng CF等人Effect of urate-lowering therapy onall-cause and cardiovascular mortality in hyperuricemic patients withoutgout:a case-matched cohort study.PLoS One.2015；10(12):e0145193.
24.Luk AJ,Levin GP,Moore EE等人Allopurinol and mortality inhyperuricaemic patients.Rheumatology(Oxford)2009；48:804-6
25.Dubreuil M,Zhu Y,Zhang Y等人Allopurinol initiation and all causemortality in the general population.Ann Rheum Dis 2014；74:1368-7.
26.Sluijs I,Beulens JW,van der A DL,Spijkerman AM,Schulze MB,van derSchouw YT.Plasma uric acid is associated with increased risk of type2diabetesindependent of diet and metabolic risk factors.J Nutr.2013Jan；143(1):80-5.doi:10.3945/jn.112.167221.Epub 2012年11月21日。
76.Krishnan E,Pandya BJ,Chung L,Hariri A,Dabbous O.Hyperuricemia inyoung adults and risk of insulin resistance,prediabetes,and diabetes:a 15-year follow-up study.Am J Epidemiol.2012年7月15日；176(2):108-16.doi:10.1093/aje/kws002.Epub 2012年7月2日。
28.Li C,Hsieh MC,Chang SJ.Metabolic syndrome,diabetes,andhyperuricemia.Curr Opin Rheumatol.2013Mar；25(2):210-6.doi:10.1097/BOR.0b013e32835d951e.综述。
29.Chang HY,Tung CW,Lee PH,Lei CC,Hsu YC,Chang HH,Yang HF,Lu LC,JongMC,Chen CY,Fang KY,Chao YS,Shih YH,Lin CL.Hyperuricemia as an independentrisk factor of chronic kidney disease in middle-aged and elderlypopulation.Am J Med Sci.2010Jun；339(6):509-15.doi:10.1097/MAJ.0b013e3181db6e16.
30.Tsuruta N,Imafuku S,Narisawa Y.Hyperuricemia is an independentrisk factor for psoriatic arthritis in psoriatic patients.J Dermatol.2017Dec；44(12):1349-1352.doi:10.1111/1346-8138.13968.Epub 2017年7月10日。
31.Chang H-Y,Lee P-H,Lei C-C,Tung C-W,Hsu Y-C,Huang T-J等人(2013)Hyperuricemia Is an Independent Risk Factor for New Onset Micro-Albuminuriain a Middle-Aged and Elderly Population:A Prospective Cohort Study in Taiwan(中国台湾).PLoS ONE 8(4):e61450.
32.Long H,Jiang J,Xia J,Jiang R,He Y,Lin H,Fan Z,Zeng T.HyperuricemiaIs an Independent Risk Factor for Erectile Dysfunction.J Sex Med.2016Jul；13(7):1056-62.doi:10.1016/j.jsxm.2016.04.073.Epub 2016年5月18日。
33.Doherty A,Carvalho JC,Drewlo S,El-Khuffash A,Downey K,Dodds M,Kingdom J.Altered hemodynamics and hyperuricemia accompany an elevated sFlt-1/PlGF ratio before the onset of early severe preeclampsia.J Obstet GynaecolCan.2014Aug；36(8):692-700.doi:10.1016/S1701-2163(15)30511-9.
34.Springer J,Tschirner A,Hartman K,Palus S,Wirth EK,Ruis SB,
35.Zhou FL,Zhang WG,Wei YC,Meng S,Bai GG,Wang BY,Yang HY,Tian W,MengX,Zhang H,Chen SP.Involvement of oxidative stress in the relapse of acutemyeloid leukemia.J Biol Chem.2010May 14；285(20):15010-5.doi:10.1074/jbc.M110.103713.Epub 2010年3月16日。
36.Honorat JA,Kinoshita M,Okuno T,Takata K,Koda T,Tada S,Shirakura T,Fujimura H,Mochizuki H,Sakoda S,Nakatsuji Y.Xanthine oxidase mediates axonaland myelin loss in a murine model of multiple sclerosis.PLoS One.2013Aug 8；8(8):e71329.doi:10.1371/journal.pone.0071329.eCollection 2013.
37.Peglow S,Toledo AH,Anaya-Prado R,Lopez-Neblina F,Toledo-PereyraLH.Allopurinol and xanthine oxidase inhibition in liver ischemiareperfusion.J Hepatobiliary Pancreat Sci.2011年3月；18(2):137-46.doi:10.1007/s00534-010-0328-7.综述。
38.Kim NH,Choi S,Han EJ,Hong BK,Choi SY,Kwon HM,Hwang SY,Cho CS,KimWU.The xanthine oxidase-NFAT5 pathway regulates macrophage activation andTLR-induced inflammatory arthritis.Eur J Immunol.2014年9月；44(9):2721-36.doi:10.1002/eji.201343669.Epub 2014年8月11日。
39.Fang J,Yin H,Liao L,Qin H,Ueda F,Uemura K,Eguchi K,Bharate GY,Maeda H.Water soluble PEG-conjugate of xanthine oxidase inhibitor,PEG-AHPPmicelles,as a novel therapeutic for ROS related inflammatory bowel diseases.JControl Release.2016Feb 10；223:188-196.doi:10.1016/j.jconrel.2015.12.049.Epub2015Dec 29.
40.CHMP Assessment Report For Adenuric(International NonproprietaryName:Febuxostat),Procedure No.EMEA/H/C/777,European Medicines Agency(EMEA)Evaluation of Medicines for Human Use.EMEA/258531/2008
41.Bohm M,Vuppalanchi R,Chalasani N,Drug-Induced Liver Injury Network(DILIN):Febuxostat-induced acute liver injury.Hepatology,2016；63(3):1047–49
42.Reinders MK,Jansen TL(2010)Management of hyperuricemia in gout:focus on febuxostat.ClinInterv Aging,2010；5:7-18.
43.Gray CL,Walters-Smith NE(2011).Febuxostat for treatment of chronicgout.Am J Health Syst Pharm 2011；68:389-398.
44.Chen C,LüJM,Yao Q.Hyperuricemia-Related Diseases and XanthineOxidoreductase(XOR)Inhibitors:An Overview.Med Sci Monit.2016Jul 17；22:2501-12.
45.Chohan S:Safety and efficacy of febuxostat treatment in subjectswith gout and severe allopurinol adverse reactions.J Rheumatol,2011；38:1957–59
46.Abeles AM:Febuxostat hypersensitivity.J Rheumatol,2012；39:659
47.Schumacher HR Jr.,Becker MA,Wortmann RL等人:Effects of febuxostatversus allopurinol and placebo in reducing serum urate in subjects withhyperuricemia and gout:A 28-week,phase III,randomized,double-blind,parallel-group trial.Arthritis Rheum,2008；59(11):1540–48
48.www.accessdata.fda.gov.于2018年4月27日访问
49.Mauck M,Taintor A,Jha P:Cross-sensitivity of allopurinol andfebuxostat-induced drug rash with eosinophilia and systemic symptoms(DRESS)syndrome.J Gen Intern Med,2010；25:S504–5
50.Bardin T,Chalès G,Pascart T等人:Risk of cutaneous adverse eventswith febuxostat treatment in patients with skin reaction to allopurinol.Aretrospective,hospital-based study of 101patients with consecutiveallopurinol and febuxostat treatment.Joint Bone Spine,2016；83(3):314–17
51.Kang Y,Kim MJ,Jang HN等人:Rhabdomyolysis associated withinitiation of febuxostat therapy for hyperuricaemia in a patient with chronickidney disease.J Clin Pharm Ther,2014；39(3):328–30
52.Lewis AS,Murphy L,McCalla C,Fleary M,Purcell S.Inhibition ofmammalian xanthine oxidase by folate compounds and amethopterin.J Biol Chem1984；259:12–5.
53.Williams JN Jr.,Nichol CA,Elvehjem CA.Relation of dietary folicacid and vitamin B12 to enzyme activity in the chick.J Biol Chem 1949；180:689–94.
54.Qin X,Li Y,He M,Tang G,Yin D,Liang M,Wang B,Nie J,Huo Y,Xu X,HouFF.Folic acid therapy reduces serum uric acid in hypertensive patients:asubstudy of the China Stroke Primary Prevention Trial(CSPPT).Am J ClinNutr.2017年4月；105(4):882-889.
55.Li H,Qin X,Xie D,Tang G,Zhang Y,Li J,Hou F,Wang X,Huo Y,XuX.Effects of combined enalapril and folic acid therapy on the serum uric acidlevels in hypertensive patients:a multicenter,randomized,double-blind,parallel-controlled clinical trial.Intern Med.2015；54(1):17-24.
56.Qin X,Xu M,Zhang Y,Li J,Xu X,Wang X,Xu X,Huo Y.Effect of folicacid supplementation on the progression of carotid intima-media thickness:ameta-analysis of randomized controlled trials.Atherosclerosis.2012Jun；222(2):307-13.
57.Huo Y,Li J,Qin X,Huang Y,Wang X,Gottesman RF,Tang G,et al.Efficacyof folic acid therapy in primary prevention of stroke among adults withhypertension in China:the CSPPT randomized clinical trial.JAMA.2015Apr 7；313(13):1325-35.
58.Huo Y,Qin X,Wang J,Sun N,Zeng Q,Xu X,Liu L,Xu X,Wang X.Efficacy offolic acid supplementation in stroke prevention:new insight from a meta-analysis.Int J Clin Pract.2012年6月；66(6):544-51.
59.Li Y,Huang T,Zheng Y,Muka T,Troup J,Hu FB.Folic AcidSupplementation and the Risk of Cardiovascular Diseases:A Meta-Analysis ofRandomized Controlled Trials.J Am Heart Assoc.2016年8月15日；5(8).
60.Horiuchi H,Ota M,Kobayashi M,Kaneko H,Kasahara Y,Nishimura S,KondoS,Komoriya K.A comparative study on the hypouricemic activity and potency inrenal xanthine calculus formation of two xanthine oxidase/xanthinedehydrogenase inhibitors:TEI-6720and allopurinol in rats.Res Commun MolPathol Pharmacol.1999；104(3):307-19.
61.尚雁君，李医明，蒋山好等，玄参中苯丙素苷Acteoside对小鼠高尿酸血症的影响.解放军药学学报,2004,22(1):30 32
62.Lopes Galeno DM,Carvalho RP,Boleti AP,Lima AS,Oliveira de AlmeidaPD,Pacheco CC,Pereira de Souza T,Lima ES.Extract from Eugenia punicifolia isan antioxidant and inhibits enzymes related to metabolic syndrome.ApplBiochem Biotechnol.2014Jan；172(1):311-24.
63.Schmeda-Hirschmann G,Theoduloz C,Franco L,Ferro E,de AriasAR.Preliminary pharmacological studies on Eugenia uniflora leaves:xanthineoxidase inhibitory activity.J Ethnopharmacol.1987Nov；21(2):183-6.
64.Suzuki R,Hasuike Y,Hirabayashi M,Fukuda T,Okada Y,ShiratakiY.Identification of a xanthine oxidase-inhibitory component from Sophoraflavescens using NMR-based metabolomics.Nat Prod Commun.2013Oct；8(10):1409-12.
65.帅学宏；胡庭俊；曾芸；李跃华；刘洪丽；苏子杰；何德凤.山豆根多糖对免疫抑制模型小鼠免疫器官指数和自由基相关酶活性的影响.《南京农业大学学报》[ISSN:1000-2030/CN:32-1148/S]卷:32卷期数:2009年2期页码:170-172.
66.Kong LD,Cai Y,Huang WW,Cheng CH,Tan RX.Inhibition of xanthineoxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout.JEthnopharmacol.2000年11月；73(1-2):199-207.
67.张雪,周英,管静,鄢守群,俸婷婷.5种中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.山地农业生物学报；2015年04期(2015/12/11)，P51–54
68.孙维峰，罗平，徐伟，等，泄浊除痹汤对高尿酸血症小鼠血尿酸的影响.中国实验方剂学杂志，2006，12(9)：36-38.土茯苓、萆薢、生薏苡仁、威灵仙、木瓜、泽兰、王不留行
69.Liu L,Shi S,Zhao H,Yu J,Jiang X,Chen X.Selective fishing andanalysis of xanthine oxidase binders from two Fabaceae species by couplingenzyme functionalized core-shell magnetic nanoparticles with HPLC-MS.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2014年1月15日；945-946:163-70.
70.Hudaib MM,Tawaha KA,Mohammad MK,Assaf AM,Issa AY,Alali FQ,AburjaiTA,Bustanji YK.Xanthine oxidase inhibitory activity of the methanolicextracts of selected Jordanian medicinal plants.Pharmacogn Mag.2011Oct；7(28):320-4.doi:10.4103/0973-1296.90413.
71.雷嘉川,余建清,廖志雄.决明子抗氧化作用的研究.《中国中医药信息杂志》2006年第11期
72.Peng MJ,Shi SY,Chen L,Zhang SH,Cai P,Chen XQ.Online couplingsolid-phase ligand-fishing with high-performance liquid chromatography-diodearray detector-tandem mass spectrometry for rapid screening andidentification of xanthine oxidase inhibitors in natural products.AnalBioanal Chem.2016Sep；408(24):6693-701.
73.Chien SC,Yang CW,Tseng YH,Tsay HS,Kuo YH,Wang SY.Lonicerahypoglauca inhibits xanthine oxidase and reduces serum uric acid inmice.Planta Med.2009年3月；75(4):302-6.
74.Nguyen MT,Awale S,Tezuka Y,Tran QL,Watanabe H,Kadota S.Xanthineoxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants.Biol PharmBull.2004Sep；27(9):1414-21.
75.Liu K,Wang W,Guo BH,Gao H,Liu Y,Liu XH,Yao HL,Cheng K.ChemicalEvidence for Potent Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Ethyl AcetateExtract of Citrus aurantium L.Dried Immature Fruits.Molecules.2016Mar 2；21(3):302.
76.Hou PY,Mi C,He Y,et al.Pallidifloside D from Smilax ripariaenhanced allopurinol effects in hyperuricemia mice.Fitoterapia,vol.105,no.1,pp.43–48,2015.
77.徐婷婷,承志凯,尹莲,徐文皑.土茯苓抑制黄嘌呤氧化酶活性的物质基础研究.《中药材》2012年第4期
78.王彩萍.桑枝提取物主要成分及其调节有机离子转运改善高尿酸血症机理研究.南京大学.2009博士Thesis.导师,孔令东
79.Hunyadi A,Liktor-Busa E,Márki A,Martins A,Jedlinszki N,Hsieh TJ,Báthori M,Hohmann J,ZupkóI.Metabolic effects of mulberry leaves:exploringpotential benefits in type 2diabetes and hyperuricemia.Evid Based ComplementAlternat Med.2013；2013:948627.
80.Sang M,Du G,Hao J,Wang L,Liu E,Zhang Y,Wang T,Gao X,Han L.Modelingand optimizing inhibitory activities of Nelumbinis folium extract on xanthineoxidase using response surface methodology.J Pharm Biomed Anal.2017年5月30日；139:37-43.
81.Tu PT,Tawata S.Anti-Oxidant,Anti-Aging和Anti-MelanogenicProperties of the Essential Oils from Two Varieties of Alpiniazerumbet.Molecules.2015Sep 14；20(9):16723-40.
82.黎莉,戴立珍,杨靖,方继德.中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选.武漢工程大學學報；32卷3期(2010/03/30)，P44–46
83.洪子桓,賴瑞聲,林素月,楊婕,李雅琳.大南薑根莖抑制黃嘌呤氧化酶之活性.台灣農業研究；66卷4期(2017/12/31)，P333–342高良姜
84.Nguyen MT,Awale S,Tezuka Y,Ueda JY,Tran Ql,Kadota S.Xanthineoxidase inhibitors from the flowers of Chrysanthemum sinense.PlantaMed.2006Jan；72(1):46-51
85.Song HP,Zhang H,Fu Y,Mo HY,Zhang M,Chen J,Li P.Screening forselective inhibitors of xanthine oxidase from Flos Chrysanthemum usingultrafiltration LC-MS combined with enzyme channel blocking.J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci.2014年6月15日；961:56-61.
86.Honda S,Kawamoto S,Tanaka H,Kishida H,Kitagawa M,Nakai Y,Abe K,Hirata D.Administered chrysanthemum flower oil attenuates hyperuricemia:mechanism of action as revealed by DNA microarray analysis.Biosci BiotechnolBiochem.2014；78(4):655-61.
87.Lee YS,Son E,Kim SH,Lee YM,Kim OS,Kim DS.Synergistic Uric Acid-Lowering Effects of the Combination ofChrysanthemum indicumLinneFlower andCinnamomum cassia(L.)J.Persl Bark Extracts.Evid BasedComplement Alternat Med.2017；2017:9764843.
88.Wang Z,Kwon SH,Hwang SH,Kang YH,Lee JY,Lim SS.Competitive bindingexperiments can reduce the false positive results of affinity-basedultrafiltration-HPLC:A case study for identification of potent xanthineoxidase inhibitors from Perilla frutescens extract.J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci.2017Mar 24；1048:30-37.
89.Huo LN,Wang W,Zhang CY,Shi HB,Liu Y,Liu XH,Guo BH,Zhao DM,GaoH.Bioassay-Guided Isolation and Identification of Xanthine Oxidase InhibitoryConstituents from the Leaves of Perilla frutescens.Molecules.2015年9月25日；20(10):17848-59.
90.于娟,王晓梅.薏苡仁和茯苓提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.《中国药物与临床》2014年第1期30-32页
91.Costantino L,Albasini A,Rastelli G,Benvenuti S.Activity ofpolyphenolic crude extracts as scavengers of superoxide radicals andinhibitors of xanthine oxidase.Planta Med.1992年8月；58(4):342-4.
92.Liu F,Deng C,Cao W,Zeng G,Deng X,Zhou Y.Phytochemicals ofPogostemon Cablin(Blanco)Benth.aqueous extract:Their xanthine oxidaseinhibitory activities.Biomed Pharmacother.2017年5月；89:544-548.
93.Kim Yi.Will mandatory folic acid fortification prevent or promotecancer？Am J Clin Nutr 80:1123-1128,2004.
94.Choi SW and Mason JB:Folate status:Effects on pathways ofcolorectal carcinogenesis.J Nutr 132(增刊8):S2413-S2418,2002.
95.Varela-Moreiras G,Murphy MM,Scott JM.Cobalamin,folic acid,andhomocysteine.Nutr Rev.2009年5月.67增刊1:S69-72.
96.Reynolds EH,Rothfeld P,Pincus JH.Neurological disease associatedwith folate deficiency.Br Med J.1973May 19；2(5863):398-400.
97.Zaric BL,Obradovic M,Bajic V,Haidara MA,Jovanovic M,IsenovicER.Homocysteine and Hyperhomocysteinaemia.Curr Med Chem.2018年3月12日。doi:10.2174/0929867325666180313105949.[Epub提前印刷]
98.Joshi RAdhikari SPatro BSet al.Free radical scavenging behavior offolic acid:evidence for possible antioxidant activity.Free Radic BiolMed.2001；30:1390–1399.
99.Hathcock JN.Vitamins and minerals:efficacy and safety.Am J ClinNutr.1997Aug；66(2):427-37.
100.Field MS,Stover PJ.Safety of folic acid.Ann N Y Acad Sci.2018Feb；1414(1):59-71.
101.Kim Yi.Will mandatory folic acid fortification prevent or promotecancer？Am J Clin Nutr 2004；80(5):1123-1128.
102.Wien TN,Pike E,
103.Ebbing M,
104.Kalckar HM,Klenow H.Milk xanthopterin oxidase and pteroylglutamicacid.J.Biol.Chem.1948；172,349-52.
105.Kalckar HM,Kjeldgaard NO,Klenow H.2-Amino-4hydroxy-6-formylpteridine,an inhibitor of purine and pterine oxidases.Biochim BiophysActa.1950Jun；5(3/4):586-94.
106.Lewis AS,Murphy L,McCalla C,Fleary M,Purcell S.Inhibition ofmammalian xanthine oxidase by folate compounds and amethopterin.J BiolChem.1984Jan 10；259(1):12-5.
107.Spector T,Ferone R.Folic acid does not inactivate xanthineoxidase.J Biol Chem.1984Sep 10；259(17):10784-6.
108.Nishino T,Tsushima K.Interaction of milk xanthine oxidase withfolic acid.Inhibition of milk xanthine oxidase by folic acid and separationof the enzyme into two fractions on Sepharose 4B/folate gel.J BiolChem.1986Aug 25；261(24):11242-6.
109.Maciel ME,Castro GD,Castro JA.Inhibition of the rat breastcytosolic bioactivation of ethanol to acetaldehyde by some plant polyphenolsand folic acid.Nutr Cancer.2004；49(1):94-9.
110.Verhaar MC,Wever RM,Kastelein JJ,van Dam T,Koomans HA,RabelinkTJ.5-methyltetrahydrofolate,the active form of folic acid,restoresendothelial function in familial hypercholesterolemia.Circulation.1998Jan 27；97(3):237-41.
111.Akhtar MJ,Khan MA,Ahmad I.Photodegradation of folic acid inaqueous solution,J.Pharm.Biomed.Anal.19(1999)269–275.
112.Branda RF,Eaton JW.Skin color and nutrient photolysis:anevolutionary hypothesis,Science 201(1978)625–626.
113.Hirakawa K,Suzuki H,Oikawa S,Kawanishi S.Sequencespecific DNAdamage induced by ultraviolet A-irradiated folic acid via its photolysisproduct,Arch.Biochem.Biophys.410(2003)261–268.
114.Jamil AM,Ataullah KM,Ahmad I.Identification of photoproducts offolic acid and its degradation pathways in aqueous solution,J.Pharm.Biomed.Anal.31(2003)579–588.
115.Lucock M,Yates Z,Glanville T,Leeming R,Simpson N,Daskalakis I.Acritical role for B-vitamin nutrition in human developmental and evolutionarybiology,Nutrit.Res.23(2003)1463–1475.
116.Thomas AH,Suarez G,Cabrerizo FM,Martino R,Capparelli AL.Study ofthe photolysis of folic acid and 6-formylpterin in acid aqueous solutions,Photochem.Photobiol.A:Chem.135(2000)147–154.
117.Off MK,Steindal AE,Porojnicu AC,Juzeniene A,Vorobey A,Johnsson A,Moan J.Ultraviolet photodegradation of folic acid.J Photochem PhotobiolB.2005Jul 1；80(1):47-55.
118.Keebaugh AC,Thomas JW.The Evolutionary Fate of the Genes Encodingthe Purine Catabolic Enzymes in Hominoids,Birds,and Reptiles.Mol BiolEvol.2010年6月；27(6):1359–1369.
119.Keith CK,Broach WJ等人Xanthine oxidase and tyrosinase in thelivers of chicks receiving graded levels of dietary pteroylglutamic acid.JBiol Chem.1948Dec；176(3):1095-1101
120.Williams JN Jr,Nichol CA,Elvehjem CA.Relation of dietary folicacid and vitamin B12 to enzyme activity in the chick.J Biol Chem.1949Sep；180(2):689-94.
121.Jing M,Munyaka PM,Tactacan GB,Rodriguez-Lecompte JC,O K,HouseJD.Performance,serum biochemical responses,and gene expression of intestinalfolate transporters of young and older laying hens in response to dietaryfolic acid supplementation and challenge with Escherichia colilipopolysaccharide.Poult Sci.2014Jan；93(1):122-31.
122.Srivastava M,Chandra D,Kale RK.Modulation of radiation-inducedchanges in the xanthine oxidoreductase system in the livers of mice by itsinhibitors.Radiat Res.2002Mar；157(3):290-7.
123.Wu X,Liu J,Zhang J等人Folic acid reverses uric acid crystal-induced surface OAT1 internalization by inhibiting RhoA activity in uric acidnephropathy.Molecular Medicine Reports.2016；13(3):2385-2392.
124.Cui S,Li W,Lv X,Wang P,Gao Y,Huang G.Folic Acid SupplementationDelays Atherosclerotic Lesion Development by Modulating MCP1 and VEGF DNAMethylation Levels.In Vivo and In Vitro.Int J Mol Sci.2017年5月5日；18(5).
125.Carnicer R,Navarro MA,Arbonés-Mainar JM,Acín S,Guzmán MA,SurraJC,Arnal C,de Las Heras M,Blanco-Vaca F,Osada J.Folic acid supplementationdelays atherosclerotic lesion development in apoE-deficient mice.LifeSci.2007Jan 23；80(7):638-43.
126.Qipshidze N,Tyagi N,Sen U,Givvimani S,Metreveli N,Lominadze D,Tyagi SC.Folic acid mitigated cardiac dysfunction by normalizing the levelsof tissue inhibitor of metalloproteinase and homocysteine-metabolizingenzymes postmyocardial infarction in mice.Am J Physiol Heart CircPhysiol.2010Nov；299(5):H1484-93.
127.Hwang SY,Siow YL,Au-Yeung KK,House J,O K.Folic acidsupplementation inhibits NADPH oxidase-mediated superoxide anion productionin the kidney.Am J Physiol Renal Physiol.2011Jan；300(1):F189-98.
128.Lu R,Wang X,Sun DF,Tian XQ,Zhao SL,Chen YX,Fang JY.Folic acid andsodium butyrate prevent tumorigenesis in a mouse model of colorectalcancer.Epigenetics.2008Nov；3(6):330-5.
129.Ishiguro L,Yang M,Sohn KJ,Streutker CJ,Grin A,Croxford R,Kim YI.,Folic Acid Supplementation Adversely Affects Chemosensitivity of Colon CancerCells to 5-fluorouracil.Nutr Cancer.2016Jul；68(5):780-90.
130.Lyu LC,Hsu CY,Yeh CY,Lee MS,Huang SH,Chen CL.A case-control studyof the association of diet and obesity with gout in Taiwan(中国台湾).Am JClin Nutr 2003；78:690–701.
131.Xu X,Qin X,Li Y,Sun D,Wang J,Liang M,Wang B,Huo Y,Hou FF.Efficacyof Folic Acid Therapy on the Progression of Chronic Kidney Disease:The RenalSubstudy of the China Stroke Primary Prevention Trial.JAMA Intern Med.2016Oct1；176(10):1443-1450.
132.LüJM,Yao Q,Chen C.3,4-Dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde(DHNB)is apotent inhibitor of xanthine oxidase:a potential therapeutic agent fortreatment of hyperuricemia and gout.Biochem Pharmacol.2013Nov 1；86(9):1328-37.
133.Wu X,Wakamiya M,Vaishnav S,Geske R,Montgomery C Jr,Jones P,Bradley A,Caskey CT.Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice.Proc Natl Acad Sci U S A.1994Jan 18；91(2):742-6.
实施例4
用于控制高尿酸血症和氧化应激的保健食品补充剂/抗氧化剂的开发
如本申请所述，本发明人通过体外酶活性测定法确定了从Bulk Supplements.com(111)和Trustworthy Herbs Inc(1)获得的112种标准草本提取物的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制的作用。在所述的测定法中使用了终浓度为166.7ug/ml的DSMO可溶性级分中的所有提取物，但由于溶解度问题少数提取物使用了较低浓度。有15种草本提取物表现出强XO抑制作用(>40％)。有19种草本提取物具有在20％至40％之间的XO抑制率。其余78种草本提取物对XO的抑制作用弱(<20％)。以前没有报道15种提取物(>40％XO抑制)中的5种；以前没有报道19种提取物(20-40％OXI)中的7种。此外，对这15种提取物和6种提取物的每一种分别进行了剂量依赖性XO抑制作用测定，其在单剂量(166.7ug/ml)下显示出20-40％的XO抑制作用。每种提取物的浓度范围为0-250或333ug/ml(研究了8-10个剂量)。所有21种提取物均表现出良好的剂量依赖性XO抑制作用曲线。IC
本发明人设计了一种膳食健康补充剂配方，其包含临床相关剂量的5种草本提取物(大蓟提取物，葡萄籽提取物，余甘子提取物，松树皮提取物，薄荷提取物)和叶酸用于动物测试。别嘌醇用作阳性对照。给每只小鼠I.P.注射尿囊毒酰胺，然后分别给小鼠经口管饲别嘌醇或提取物配方。治疗后1.5小时和3小时从面静脉采血。测量血清尿酸水平。尿酸酶抑制剂尿囊毒酰胺治疗(I.P.注射)在1.5小时和3小时时显著增加了血清尿酸水平。临床相关剂量的别嘌醇在1.5小时和3小时时均显著降低了尿囊毒酰胺处理的小鼠的血清尿酸水平。尽管临床相关剂量的膳食健康补充剂的作用低于别嘌醇，但它在1.5小时和3小时时均显著降低了尿囊毒酰胺处理的小鼠的血清尿酸水平。这种作用表现出剂量依赖性方式。
从Bulk Supplements.com获得标准草本提取物(111)，并从Trustworthy HerbsInc(美国中药)获得1种草本提取物。Bulk Supplements Inc位于美国内华达州Henderson。根据公司的网站，1)它是FDA注册的cGMP制造和分销机构；2)该公司致力于维护所有健康法规和政府法规，和3)每种补充剂在分销之前都要在其内部实验室进行测试，以确保所有产品都可以消费安全。标准草本提取物(100g)为粉末形式，并密封在氧化铝袋中。包装袋上提供了每种提取物的每日使用剂量。
除少数由于溶解度问题而使用较低浓度的提取物以外，所有提取物均为终浓度166.7ug/ml的DSMO可溶性级分；将它们与20nM XO混合。记录反应体系中尿酸形成的初始比率；并计算每种草本提取物的XO抑制率。所有数据均显示在表9和图11中(并且图11中x轴上的编号对应于表9中化合物列表的顺序)。存在15种草本提取物，其显示出强XO抑制作用(>40％)。存在19种草本提取物，其具有在20％-40％之间的XO抑制作用。其余78种草本提取物对XO的抑制作用弱(<20％)。
本发明人在Medline和Google Scholar搜索引擎中进行了初步文献检索(草本名称，黄嘌呤氧化酶，英文和中文)，并且发现：
-以前没有报道15种提取物(>40％XO抑制作用)中的5种:假叶树提取物(假叶树，64％XOI),乌龙茶(乌龙茶，60％XOI),番泻叶(番泻叶，45％XOI),育亨宾树皮(育亨宾，62％XOI)和大蓟提取物(大蓟，来自美国中药，80％XOI 33.3ug/ml)。以前报道了其余10种提取物的XO抑制作用:非洲芒果核(非洲芒果,78％XOI)(1,2)，余甘子(余甘子,100％XOI)(5)，葡萄籽(葡萄籽,78％XOI)(7,8,9)，绿茶(50％EGCG,绿茶,77％XOI(10,11,12),水飞蓟(水飞蓟,87％XOI 33.3ug/ml)(19)，橄榄叶(橄榄叶,65％)(21,22)，松树皮(松树皮,87％XOI)(25),石榴(40％鞣花酸,石榴,90％XOI)(26,27,28)，薄荷(薄荷，,63.6％)(15,32)和圣约翰草(圣约翰草，87％XOI)(33)。
-以前没有报道19种提取物(20-40％OXI)中的7种:蜂头叶或款冬(蜂头叶或款冬,20％XOI)，紫龙角树皮(紫龙角,30％XOI)，松果菊根(松果菊,21％XOI)，马栗子(马栗子,23.5％XOI)，可乐树(可乐树,20％XOI)，玉兰树皮(玉兰树皮，22％XOI)和巴西榥榥木(巴西榥榥木，31.6％XOI)。
112项(111项来自Bulk Supplements.com，1项来自Trustworthy Herbs Inc美国中药)：单剂量(166.7ug/ml,DMSO级分):
15种提取物:>40％XO抑制作用(根据我们的初步关键词搜索，以前没有报道该15种中的5种)
19种提取物:20-40％XO抑制作用(根据我们的初步关键词搜索，以前没有报道该19种中的7种)
78种提取物:<20％XO抑制作用
表9. 112种草本提取物的XO抑制作用(111种来自Bulk Supplements.com，1种来自Trustworthy Herbs Inc(美国中药)
NA意指：以前没有报告提取物的XO抑制作用。
空白意指：经测试提取物没有XO抑制作用，也没有进行文献检索
从单剂量(166.7ug/ml)的112种草本提取物的XO抑制作用的最初筛选开中发现，15种提取物对XO活性的抑制作用超过40％。此外，针对这15种提取物的每一种进行剂量依赖性XO抑制测定。另外，本发明人还测试了6种提取物的剂量依赖性研究，其在单剂量(166.7ug/ml)下显示具有20-40％的XO抑制作用。每种提取物的浓度范围为0-250或333ug/ml(研究了8-10个剂量)。所有21种提取物均显示出良好的剂量依赖性XO抑制曲线。IC
表10. 21种草本提取物的IC
NA意指：以前没有报道提取物的XO抑制作用。
基于草本提取物和叶酸的剂量依赖性XO抑制实验的结果，选择了相对小浓度的8种草本提取物的每一种和叶酸进行组合测定。这种组合补充剂的重要优点之一在于增强了补充剂的XO抑制功能；同时减少了每种成分的剂量，从而减少了长期使用补充剂的潜在副作用。将叶酸(0.167uM)和所确定浓度(ug/ml)的提取物单独添加到XO反应体系中，没有预先混合。测量了XO活性(图13)。8种提取物中的3种(葡萄籽、水飞蓟和大蓟提取物)显示与叶酸具有协同的XO抑制作用；8种提取物中的3种(余甘子、绿茶和松树皮)显示与叶酸具有加和的XO抑制作用；且8种提取物中的2种(非洲芒果和石榴)未显示与叶酸的任何加和或协同XO抑制作用。
设计膳食健康补充剂配方(组合)。几种草本提取物和叶酸的组合的重要优点之一始增强补充剂的XO抑制功能；同时减少每种成分的剂量，从而减少长期使用补充剂的潜在副作用。选择的草本提取物在体外应具有强XO抑制作用，并显示与叶酸具有加和作用或协同作用。在特定的实施方案中，使用了未报道其XO抑制功能的草本提取物。基于此原理，本发明人设计了一种示例性配方，其包含5种草本提取物和叶酸(表11)。
表11.膳食健康补充剂配方(组合)的实施例设计
小鼠实验设计、方法和结果。称取4.2mg大蓟提取物、3.3mg葡萄籽提取物、13.3mg余甘子提取物、4.2mg松树皮提取物和16.7mg薄荷提取物；将它们与10ml 1％PEG400混合，并且制备41.7mg/10ml的储备溶液，制备了提取物组合样品。通过将2.6mg叶酸溶于1ml0.1m磷酸钾缓冲液中单独制备了叶酸溶液，然后将6ul这种FA溶液添加到10ml提取物溶液中。使用了13.3mg/kg的临床XO抑制剂别嘌醇作为阳性对照用于小鼠实验。别嘌醇的人体剂量约为每日800mg。
使用成年C57BL/6小鼠(约20g体重)。将四组小鼠(每组n＝4)分配用于不同的治疗或对照(表12)。腹膜内(i.p.)注射尿酸酶抑制剂尿囊毒酰胺可以有效地阻止尿酸向5-羟基异尿酸酯的转化，从而导致小鼠血清尿酸水平显著增加，从而提供了高尿酸血症动物模型(34)。每只小鼠经ip注射200mg/kg剂量的尿囊毒酰胺，然后分别给小鼠经口管饲200ul-250ul(对于20-25g小鼠)别嘌醇或提取物溶液。处理后1.5小时和3小时从面静脉采血。血清尿酸水平使用磷钨酸盐方法测定。尿酸酶抑制剂尿囊毒酰胺处理(I.P.注射)在1.5小时和3小时时显著增加血清尿酸水平；这些数据与以前的出版物一致(34)。作为阳性对照，临床相关剂量的别嘌醇在1.5小时和3小时时显著降低了尿囊毒酰胺处理的小鼠的血清尿酸水平。尽管临床相关剂量的膳食健康补充剂配方的作用低于别嘌醇，但它在1.5小时和3小时时均显著降低了尿囊毒酰胺处理的小鼠的血清尿酸水平。这种作用表现出剂量依赖性(图14)。
表12.研究膳食健康补充剂的降血尿酸作用的小鼠分配
1.黄萍.芒果苷及其苷元的结构修饰和黄嘌呤氧化酶抑制活性的研究,塞来昔布有关物质的合成.北京协和医学院2013年硕士学位论文
2.杨华,徐镇平，何梦婷,何严萍李玲，宋流东.芒果苷代谢产物的合成及黄嘌呤氧化酶抑制活性研究.《天然产物研究与开发》2015年8期
3.黄真池,李恒.鼠曲草和芦荟黄嘌呤氧化酶抑制活性的研究.《岭南师范学院学报》2017年06期
4.Taukoorah U,Mahomoodally MF.Crude Aloe vera Gel Shows AntioxidantPropensities and Inhibits Pancreatic Lipase and Glucose Movement In Vitro.AdvPharmacol Sci.2016；2016:3720850.doi:10.1155/2016/3720850.Epub 2016年1月3日。
5.Sarvaiya VN,Sadariya KA,Pancha PG,Thaker AM,Patel AC,PrajapatiAS.Evaluation of antigout activity of Phyllanthus emblica fruit extracts onpotassium oxonate-induced gout rat model.Vet World.2015Oct；8(10):1230-6.doi:10.14202/vetworld.2015.1230-1236.Epub 2015年10月23日。
6.Bernardo J,Ferreres F,Gil-Izquierdo
7.Belviranli M,
8.Wang Y,Zhu JX,Kong LD,Yang C,Cheng CH,Zhang X.Administration ofprocyanidins from grape seeds reduces serum uric acid levels and decreaseshepatic xanthine dehydrogenase/oxidase activities in oxonate-treatedmice.Basic Clin Pharmacol Toxicol.2004年5月；94(5):232-7.
9.赵玲，陈旅翼，李赫宇.一种复合萃取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用研究.食品研究与开发,2015年9月第36卷第17期；198-200,DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.049
10.Zhu C,Xu Y,Liu ZH,Wan XC,Li DX,Tai LL.The anti-hyperuricemiceffect of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)on hyperuricemic mice.BiomedPharmacother.2018Jan；97:168-173.doi:10.1016/j.biopha.2017.10.013.Epub 2017年11月6日。
11.Zhu C,Tai LL,Wan XC,Li DX,Zhao YQ,Xu Y.Comparative effects ofgreen and black tea extracts on lowering serum uric acid in hyperuricemicmice.Pharm Biol.2017Dec；55(1):2123-2128.doi:10.1080/13880209.2017.1377736.
12.Chen G,Tan ML,Li KK,Leung PC,Ko CH.Green tea polyphenols decreasesuric acid level through xanthine oxidase and renal urate transporters inhyperuricemic mice.J Ethnopharmacol.2015Dec 4；175:14-20.doi:10.1016/j.jep.2015.08.043.Epub 2015年9月3日。
13.Pang M,Fang Y,Chen S,Zhu X,Shan C,Su J,Yu J,Li B,Yang Y,Chen B,Liang K,Hu H,Lv G.Gypenosides Inhibits Xanthine Oxidoreductase andAmeliorates Urate Excretion in Hyperuricemic Rats Induced by High Cholesteroland High Fat Food(Lipid Emulsion).Med Sci Monit.2017Mar 4；23:1129-1140.
14.史珅,常伟,尚小玉,王娜,李森,张泽生.几种天然产物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.《中国食品学报》2014年第7期
15.申启荣.中药黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选及抑制动力学研究.《南昌大学》2015年.硕士学位论文
16.赵守涣,杨慧,史冠莹王晓敏,赵洪源,王赵改.响应面法优化三种天然产物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.《食品工业科技》2018年第5期230-234页
17.馮玟慈.五種花草茶熱水萃取物抑制黃嘌呤氧化酶活性之成分鑑定及其酵素動力學研究.國立臺灣海洋大學,硕士学位论文,2017-06-29
18.Hatano T,Yasuhara T,Fukuda T,Noro T,Okuda T.Phenolic constituentsof licorice.II.Structures of licopyranocoumarin,licoarylcoumarin andglisoflavone and inhibitory effects of licorice phenolics on xanthineoxidase.Chem Pharm Bull(Tokyo).1989Nov；37(11):3005-9.
19.Zarrelli A,Romanucci V,Tuccillo C,Federico A,Loguercio C,GravanteR,Di Fabio G.New silibinin glyco-conjugates:synthesis and evaluation ofantioxidant properties.Bioorg Med Chem Lett.2014Nov 15；24(22):5147-9.doi:10.1016/j.bmcl.2014.10.023.Epub 2014Oct 14.
20,梁文娟,和劲松,田洋,赵德锟,王洪玲.辣木叶提取物降低高尿酸血症小鼠尿酸水平及机理研究.《安徽农业科学》2017年第17期108-109页
21.De Marino S,Festa C,Zollo F,Nini A,Antenucci L,Raimo G,IorizziM.Antioxidant activity and chemical components as potential anticancer agentsin the olive leaf(Olea europaea L.cv Leccino.)decoction.Anticancer Agents MedChem.2014；14(10):1376-85.
22.Flemmig J,Kuchta K,Arnhold J,Rauwald HW.Olea europaea leaf(Ph.Eur.)extract as well as several of its isolated phenolics inhibit thegout-related enzyme xanthine oxidase.Phytomedicine.2011May 15；18(7):561-6.doi:10.1016/j.phymed.2010.10.021.Epub 2010Dec 8.
23.Azmi SMN,Jamal P,Amid A.Xanthine oxidase inhibitory activity frompotential Malaysian medicinal plant as remedies for gout.International FoodResearch Journal,2012；19(1),159-65.
24.张雪,周英管静,鄢守群,俸婷婷.5种中药材提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.山地农业生物学报,2015年4期,51-54
25.Moini H,Guo Q,Packer L.Enzyme inhibition and protein-bindingaction of the procyanidin-rich french maritime pine bark extract,pycnogenol:effect on xanthine oxidase.J Agric Food Chem.2000Nov；48(11):5630-9.
26.Les F,Prieto JM,Arbonés-Mainar JM,Valero MS,López V.Bioactiveproperties of commercialised pomegranate(Punica granatum)juice:antioxidant,antiproliferative and enzyme inhibiting activities.Food Funct.2015Jun；6(6):2049-57.doi:10.1039/c5fo00426h.
27.Sestili P,Martinelli C,Ricci D,Fraternale D,Bucchini A,Giamperi L,Curcio R,Piccoli G,Stocchi V.Cytoprotective effect of preparations fromvarious parts of Punica granatum L.fruits in oxidatively injured mammaliancells in comparison with their antioxidant capacity in cell freesystems.Pharmacol Res.2007Jul；56(1):18-26.Epub 2007Feb 20.
28.Rummun N,Somanah J,Ramsaha S,Bahorun T,Neergheen-BhujunVS.Bioactivity of Nonedible Parts of Punica granatum L.:A Potential Source ofFunctional Ingredients.Int J Food Sci.2013；2013:602312.doi:10.1155/2013/602312.Epub 2013年7月8日。
29.Namuslu M,Kocaoglu H,Celik HT,Avci A,Devrim E,Genc Y,Gocmen E,Erguder IB,Durak I.Effects of aqueous soybean,mistletoe and red cloverextracts on activities of adenosine deaminase and xanthine oxidaseenzyme.Bratisl Lek Listy.2014；115(6):367-71.
30.Satyal P,Jones TH,Lopez EM,McFeeters RL,Ali NA,Mansi I,Al-Kaf AG,Setzer WN.Chemotypic Characterization and Biological Activity of Rosmarinusofficinalis.Foods.2017Mar 5；6(3).pii:E20.doi:10.3390/foods6030020.
31.尚雁君,黄才国,蒋三好,朱大元,魏善建,焦炳华.迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用.第二軍醫大學學報；27卷2期(2006/02/20)，P189–191.
32.刘璐.中草药提取物体外黄嘌呤氧化酶抑制活性及其复合饮料研究.华南理工大学,2014年05期,硕士学位论文
33.Havlik J,Gonzalez de la Huebra R,Hejtmankova K,Fernandez J,Simonova J,Melich M,Rada V.Xanthine oxidase inhibitory properties of Czechmedicinal plants.J Ethnopharmacol.2010Nov 11；132(2):461-5.doi:10.1016/j.jep.2010.08.044.Epub 2010年8月26日。
34.LüJM,Yao Q,Chen C.3,4-Dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde(DHNB)is apotent inhibitor of xanthine oxidase:a potential therapeutic agent fortreatment of hyperuricemia and gout.Biochem Pharmacol.2013Nov 1；86(9):1328-37.
尽管已经详细描述了本公开及其优点，但是应当理解，在不脱离所附权利要求限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本发明中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不想限于本申请中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。正如本领域普通技术人员可以从本公开容易地理解的，可以根据本公开使用执行与本申请所述的相应实施方案基本上相同的功能或实现基本上相同的效果的目前存在或即将开发的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，预期所附权利要求将这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在其范围内。
机译： 用于控制高尿酸血症和氧化应激的健康食品补充剂和抗氧化剂的发展
机译： 用于控制高尿酸血症和氧化应激的健康食品补充剂和抗氧化剂的发展
机译： 用于控制血尿过多和氧化应激的健康食品补充剂和抗氧化剂的开发
