利用等温扩增和相对丰度评估宿主RNA

摘要

用于估计诊断分数的方法包括将测试样品的第一等分试样添加到第一反应容器中，并且将测试样品的第二等分试样添加到第二反应容器中。测试样品包括第一靶核酸和第二靶核酸。第二靶核酸具有比第一靶核酸更低的预期丰度。第二等分试样具有比第一等分试样更大的体积。通过分别在第一反应容器中进行第一实时定量等温扩增测定和在第二反应容器中进行第二实时定量等温扩增测定来估计第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值。基于第一相对丰度值和第二相对丰度值估计诊断分数。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月19日提交的美国临时专利申请第62/733,517号的权益，其内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本公开涉及估计诊断分数的方法。更具体地，本公开涉及使用实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。测试样品包括第一靶核酸和第二靶核酸。通过进行实时定量等温扩增测定来估计第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值。基于第一相对丰度值和第二相对丰度值估计诊断分数。

发明背景

对样品的其它基因和核酸中存在的低丰度(例如，低拷贝数)的靶基因的定量可能是困难的。目前的检测方法通常涉及对基因或与基因转录相关的产物(例如，mRNA)的扩增(例如，聚合酶链式反应(PCR))。随着逆转录酶(RT)-PCR的出现，RNA分子可被特异性靶向以形成cDNA分子。所得的cDNA分子本身可用作扩增的模板，容易改善样品中靶基因或基因产物的检测。等温扩增方法提供了更快的扩增速率和更低复杂度的仪器。然而，等温扩增技术，例如基于实时定量环介导的等温扩增(实时qLAMP)的方法，针对哺乳动物RNA靶标可能不能可靠地定量靶核酸中低于1,000拷贝的靶核酸(参见Nixon等人，(2014)，BimolecularDetection and Quantitation，2：4-10)。

对急性感染(例如细菌和病毒的)的改进的诊断可以降低发病率和死亡率比率。然而，检测急性感染的方法缺乏特异性，敏感性和速度。尽管一些扩增技术可以直接从血液培养物中检测病原体，但是这些测试往往依赖于特定病原体的选择子集，这意味着无法检测到一些病原体。此外，许多感染不进入血流，因此通过非侵入性方法是不可检测到的。因此，仍然需要评估宿主应答(例如，宿主基因表达)以分类细菌和病毒感染，并且将宿主应答与结果如诊断和/或治疗方案相关联。

发明内容

本文提供了使用实时定量等温扩增来估计测试样品的诊断分数的方法。在一些实施方案中，所述方法包括获得含有至少第一靶核酸和至少第二靶核酸以及参照核酸的测试样品。第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸各自包含哺乳动物宿主核酸。所述方法还包括将测试样品的第一等分试样加入到第一反应容器中以定量等温扩增第一靶核酸，并将测试样品的第二等分试样加入到第二反应容器中以定量等温扩增第二靶核酸。第一反应容器和第二反应容器中的每一个包含用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物。第二靶核酸在所述测试样品中具有比所述第一靶核酸更低的预期丰度。第一等分试样具有第一体积。第二等分试样具有大于第一体积的第二体积。所述方法还包括通过以下步骤在所述第一反应容器中进行第一实时定量等温扩增测定：在所述第一反应容器中开始第一反应；确定第一反应中第一靶核酸的第一达到阈值的时间；确定第一反应中参照核酸的第一参照达到阈值的时间；以及至少基于所述第一达到阈值的时间和所述第一参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第一靶核酸相对于所述参照核酸的第一相对丰度值。所述方法还包括通过以下步骤在所述第二反应容器中进行第二实时定量等温扩增测定：在所述第二反应容器中开始第二反应；确定第二反应中第二靶核酸的第二达到阈值的时间；确定第二反应中参照核酸的第二参照达到阈值的时间；以及至少基于所述第二达到阈值的时间和所述第二参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第二靶核酸相对于所述参照核酸的第二相对丰度值。所述方法还包括基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数。

在另一方面，本文提供了使用实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从哺乳动物受试者获得测试样品。测试样品包含至少第一靶核酸和至少第二靶核酸，以及参照核酸。第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸各自在测试样品中具有的预期浓度如在感兴趣的群组群体上验证的实时定量等温扩增的动态范围内。所述方法还包括将测试样品的等分试样添加到含有用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物的至少一个反应容器中；在所述至少一个反应容器中开始至少一个等温扩增反应；确定所述至少一个反应中的所述第一靶核酸的第一达到阈值的时间；确定所述至少一个反应中的所述第二靶核酸的第二达到阈值的时间；确定所述至少一个反应中的参照核酸的参照达到阈值的时间；至少基于所述第一达到阈值的时间和所述参照达到阈值的时间来估计所述第一靶核酸相对于所述测试样品中的所述参照核酸的第一相对丰度值；至少基于所述第二达到阈值的时间和所述参照达到阈值的时间来估计所述第二靶核酸相对于所述测试样品中的所述参照核酸的第二相对丰度值；以及基于第一靶核酸的第一达到阈值的时间和第二靶核酸的第二达到阈值的时间来估计测试样品的诊断分数。

在另一方面，本文提供了通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。在一些实施方案中，所述方法包括获得第一标准曲线，第二标准曲线和参照标准曲线。第一标准曲线包括将第一靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第一函数。第二标准曲线包括将第二靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第二函数。参照标准曲线包括将参照核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的参照函数。在对测试样品进行实时定量等温扩增之前，生成第一标准曲线，第二标准曲线和参照标准曲线。所述方法还包括从哺乳动物受试者获得测试样品。测试样品含有第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸。所述方法还包括：将测试样品加入到含有用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物的至少一个反应容器中；在所述至少一个反应容器中开始至少一个等温扩增反应；确定所述至少一个反应中的所述第一靶核酸的第一达到阈值的时间；确定所述至少一个反应中的所述第二靶核酸的第二达到阈值的时间；确定所述至少一个反应中的参照核酸的参照达到阈值的时间；使用所述第一标准曲线的第一函数基于所述第一达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第一靶核酸的第一起始拷贝数；使用所述第二标准曲线的第二函数基于所述第二达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第二靶核酸的第二起始拷贝数；使用由参照标准曲线提供的参照函数基于参照达到阈值的时间来估计测试样品中参照核酸的参照起始拷贝数；基于所述第一靶核酸的第一起始拷贝数和所述参照核酸的参照起始拷贝数，估计所述测试样品中所述第一靶核酸相对于所述参照核酸的第一相对丰度值；基于所述第二靶核酸的第二起始拷贝数和参照核酸的参照起始拷贝数，估计所述测试样品中第二靶核酸相对于参照核酸的第二相对丰度值；基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数；以及通过将测试样品的诊断分数与预定阈值诊断分数进行比较来进行医学状况的临床诊断。

在另一方面，本文提供了使用实时定量等温扩增来估计测试样品的诊断分数的设备。在一些实施方案中，所述设备包括配置成容纳测试样品的第一等分试样的第一反应容器，和配置成容纳测试样品的第二等分试样的第二反应容器。测试样品含有第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸。第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸各自包含哺乳动物宿主核酸。第一反应容器和第二反应容器中的每一个包含用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物。第一等分试样具有第一体积。第二等分试样具有大于第一体积的第二体积。第二靶核酸在所述测试样品中具有比所述第一靶核酸更低的预期丰度。所述设备还包括用于存储第一阈值荧光强度值和第二阈值荧光强度值的计算机存储器。所述设备还包括用于在第一反应容器中开始第一等温扩增反应以扩增第一靶核酸和参照核酸的装置。第一等温扩增反应可以产生与第一靶核酸相关的第一荧光和与参照核酸相关的第一参照荧光。所述设备还包括光学耦合到第一反应容器的第一荧光检测器和第一参照荧光检测器。第一荧光检测器被配置为作为时间的函数测量第一荧光的强度并且作为时间的函数测量第一参照荧光的第一参照强度。所述设备还包括用于在第二反应容器中开始第二等温扩增反应以扩增第二靶核酸和参照核酸的装置。第二等温扩增反应可产生与第二靶核酸相关的第二荧光和与参照核酸相关的第二参照荧光。所述设备还包括光学耦合到第二反应容器的第二荧光检测器和第二参照荧光检测器。第二荧光检测器被配置为作为时间的函数测量第二荧光的强度并且作为时间的函数测量第二参照荧光的第二参照强度。所述设备还包括耦合到第一荧光检测器，第二荧光检测器，第一参照荧光检测器，第二参照荧光检测器和计算机存储器的计算机处理器。所述计算机处理器被配置为：基于作为时间的函数的所述第一荧光的强度和所述第一阈值荧光强度值来确定所述第一靶核酸的第一达到阈值的时间；基于作为时间的函数的第一参照荧光的强度和第一阈值荧光强度值来确定参照核酸的第一参照达到阈值的时间；至少基于所述第一达到阈值的时间和所述第一参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第一靶核酸相对于所述参照核酸的第一相对丰度值；基于作为时间的函数的第二荧光的强度和第二阈值荧光强度值来确定第二靶核酸的第二达到阈值的时间；基于作为时间的函数的第二参照荧光的强度和第二阈值荧光强度值来确定参照核酸的第二参照达到阈值的时间；至少基于所述第二达到阈值的时间和所述第二参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第二靶核酸相对于所述参照核酸的第二相对丰度值；以及基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数。

附图的简要说明

图1显示了根据一些实施方案，在实时定量等温扩增测定中，荧光强度作为时间的函数的示例性图。

图2显示了根据一些实施方案，在具有不同浓度的靶核酸的8个样品的实时定量等温扩增测定中，荧光强度作为时间的函数的示例性图。

图3显示了根据一些实施方案，表示从图2所示的荧光曲线获得的达到阈值的时间对比拷贝数的对数的数据点的散点图，以及从对该数据点的线性回归获得的直线。

图4显示了简化流程图，其示出了根据一些实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。

图5显示了简化流程图，其示出了根据一些其它实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。

图6显示了简化流程图，其示出了根据一些实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。

图7显示了根据一些实施方案使用实时定量等温扩增测定来估计相对丰度值的设备的示意性框图。

图8显示了与金标准测定(NanoString nCounter)相比，使用定量实时等温扩增测定确定的靶核酸(IFI27)与参照核酸(YWHAB)的相对丰度的相关图(具有皮尔森系数)。对于这两种分析，将值绘制为Log

图9A显示了根据一些实施方案，将通过等温扩增测定和通过金标准NanoStringnCounter确定的诊断分数相关联的相关图(具有皮尔森系数)。

图9B显示了根据一些实施方案，基于qLAMP测定的HostDx-Fever分数分布。

图9C显示了根据一些实施方案，基于NanoString nCounter的HostDx-Fever分数分布。

图10示出了一个实例，其中根据一些实施方案，将截止值定义为线性回归拟合至标准曲线滴定的y截距。

图11显示了根据一些实施方案，使用多体积反应容器的qLAMP测定的实验结果。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这样的实施方案当然可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制。

本公开提供了用于确定测试样品中的靶核酸的相对丰度值的方法，设备和试剂盒。尽管qPCR在本领域中是众所周知的，但等温扩增技术还未能进一步改进定量临床相关样品中的靶核酸的方法。例如，用于定量细菌或病毒核酸的qLAMP方法在1,000拷贝以下可能是不可靠的(参见，Nixon等人，(2014)，Bimolecular Detection and Quantitation 2：4-10)。因此，需要一种用于定量样品中靶哺乳动物mRNA的存在的方法，其独立于样品中靶核酸的起始拷贝数。本文提供了用于确定测试样品中靶核酸相对于参照核酸的相对丰度的方法，设备和试剂盒，所述相对丰度不是基于起始拷贝数预测的，并且不需要绝对定量样品中的靶核酸或参照核酸。所述方法，设备和试剂盒利用实时定量等温扩增来扩增测试样品中的靶核酸和参照核酸。在一些方面，靶核酸是由宿主响应细菌或病毒感染而表达的哺乳动物宿主核酸(例如，mRNA)。相对定量足以允许依赖于多种哺乳动物RNA标志物的某些诊断算法(参见，例如，公开的专利申请WO2016/145426；WO2017/066641；WO2018/004806；以及WO2017/214061)在样品间被稳定地计算，而不需要在同一测定中为每种靶标运行标准曲线，或者甚至不使用标准曲线。

在一些实施方案中，定量实时等温扩增包括链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、分歧扩增、解旋酶依赖性等温DNA扩增(HDA)、切刻酶扩增反应(NEAR)和环介导的等温扩增(LAMP)(参见，例如，Notomi等人，(2000)Nucleic Acids Research，28(12)E63，通过引用并入本文)。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物和登记号通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。

通常，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养，分子生物学，有机化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。标准技术用于核酸和肽的合成。所述技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献进行(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通过引用并入本文)，其在本文单独全文中提供。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则在本文的整个公开中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它公开的材料通过引用以其整体并入。在本文的术语有多个定义的情况下，本节中的那些是主要的。在提及URL或其它这样的标识符或地址的情况下，应当理解，这样的标识符可以改变，并且因特网上的具体信息可以来来往往，但是等同的信息是已知的，并且可以容易地被访问，例如通过搜索因特网和/或适当的数据库。对此的参考证明了这种信息的可用性和公众传播性。

如本文所用，术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”被定义为意指一个或多个并且包括复数，除非上下文是不适当的。在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有具体说明。

本文中，范围可以表示为从“约”一个指定值，和/或至“约”另一个指定值。本文所用的术语“约”是指近似、在....左右、大致或大约。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界扩展到所示数值以上和以下来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值修改到所述数值以上或以下10％的变化。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，将理解，指定值形成另一个实施方案。还应理解的是，每个范围的端点都包括在该范围内。

本文所用的词语“或”意指具体列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

如本文所用，术语“包括(including)”以及其它形式(例如，“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”)不是限制性的。

如本文所用，术语“相对丰度值”是指测试样品中靶核酸的测量。在一些实施方案中，通过对测试样品中的靶核酸和管家基因进行等温扩增来估计相对丰度值，使得可以比较不同样品(例如，来自不同受试者的样品或在不同时间(例如，治疗前和治疗后)从单个受试者获得的样品)之间的基因表达的差异。

如本文所用，术语“靶核酸”是指从哺乳动物宿主基因，例如响应致病(例如，细菌或病毒)活性而表达的哺乳动物RNA序列。哺乳动物RNA可以包括人和非人哺乳动物，例如马，猫，犬，猪和羊。在优选的实施方案中，靶核酸是哺乳动物mRNA。在一些实施方案中，靶核酸包括哺乳动物宿主mRNA内的剪接连接。

如本文所用，术语“参照核酸”或“内源对照”是指存在于测试样品中用于使靶核酸量正常化的核酸。参照核酸可包括通常在测试样品中发现的天然核酸(例如，管家基因mRNA)或可包括掺入到测试样品中以使靶核酸量正常化的已知量的输入材料。

如本文所用，术语“测试样品”是指从哺乳动物获得的生物样品。在一些情况下，生物样品是在临床程序期间获得的临床样品或由医师或医师助理获得的临床样品，例如宫颈或阴道拭子、鼻拭子、血液或血液组分样品(例如血浆、血清或PMBC)。在一些实施方案中，生物样品包括排泄的生物样品，例如粘液，粪便或尿液样品。在一些实施方案中，测试样品是自收集的样本，例如鼻拭子、颊拭子、手指血等。

术语“等温扩增”是指使用恒定的单一扩增温度(例如，约30℃至约95℃)扩增靶核酸的过程。与标准PCR不同，等温扩增反应不包括退火寡核苷酸的变性，杂交和延伸的多个循环，以形成扩增的靶核酸分子(即，扩增子)群体。本领域已知多种等温应用，包括但不限于环介导的等温扩增(LAMP)，基于核酸序列的扩增NASBA，重组酶聚合酶扩增(RPA)，滚环扩增(RCA)，切刻酶扩增反应(NEAR)和解旋酶依赖性扩增(HDA)。

如本文所用，术语“实时定量等温扩增”是指在恒定温度下扩增靶核酸并且通过荧光、浊度或类似测量(例如，NEAR或LAMP)监测靶核酸扩增速率的过程。在一些方面，RNA(例如，mRNA)从生物样品中分离并用作模板以合成cDNA。逆转录是将mRNA转化为cDNA的公知方法。在等温扩增条件下扩增cDNA分子，从而可以检测和定量扩增的靶核酸的产生。如本文所用，“扩增速率”是产生靶核酸扩增子的速率。

如本文所用，“聚合酶”是指与链置换活性一起使用的一种或多种酶，其执行多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的模板指导的合成。该术语包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。市售聚合酶的其它实例包括但不限于：Klenow片段(New England

聚合酶包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶如逆转录酶。至少5个DNA依赖性DNA聚合酶家族是已知的，尽管大多数属于A、B和C家族。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性的和RNA依赖性的。

如本文所用，术语“标准曲线”在本领域中被赋予其朴素和普通的含义。通常，标准曲线来源于不同浓度的靶核酸的一组样品，例如通过连续稀释模板。将达到阈值的时间相对于浓度的对数(例如，10为底)作图。最小二乘拟合用作标准曲线。

如本文所用，术语“用于等温扩增的主混合物”是指进行等温扩增测定所需的多种组分，例如dNTP、盐(例如镁)和缓冲液。在一些情况下，用于等温扩增的主混合物是实时定量等温扩增主混合物。在一些实施方案中，用于等温扩增的主混合物含有进行等温扩增反应所需的所有组分，除了引物，探针和待扩增的核酸模板。

术语“荧光标记”或“荧光团”是指荧光发射最大值在约400nm至约900nm之间的化合物。这些化合物(在括号中具有以nm计的发射最大值)包括但不限于Syto-9、Syto-82、Cy2

本领域中存在用于选择猝灭剂和荧光团对及其与寡核苷酸的连接的广泛指导(Haugland，1996；美国专利第3,996,345号和第4,351,760号等)。示例性猝灭剂描述于美国专利第6,727,356号中，其通过引用并入本文中。其它猝灭剂包括但不限于双偶氮猝灭剂(美国专利第6,790,945号)和来自Biosearch Technologies，Inc.的染料(提供为BlackHole

任何合适的荧光团可用于荧光标记在等温扩增反应期间掺入的引物，探针或核苷酸。在一些实施方案中，荧光标记是嵌入剂，例如但不限于Syto-9、Syto-82、

如本文所用，术语“达到阈值的时间”是指从等温扩增开始的时刻到表示靶核酸浓度的荧光强度达到预定阈值的时刻所经过的时间。在荧光强度对自等温扩增开始以来的时间的图(例如，如图1所示)中，达到阈值的时间是X轴交叉点，其中荧光曲线与表示阈值的水平线相交。

如本文所用，术语“拷贝数”是指存在于原始测试样品(即，在实时定量等温扩增之前)中的靶核酸分子或参照核酸分子的数目。

如本文所用，术语“N-倍连续稀释”是指通过恒定稀释因子(1∶5；1∶10；1∶20；或1∶50)，使用适当的缓冲液(例如，盐水，水等)逐步稀释溶液中的第一组分(例如参照核酸)。例如，10倍连续稀释需要以10的因子(例如1∶10)逐步稀释第一组分(例如以100mg/ml的浓度存在的参照核酸)以形成以10mg/ml的浓度存在的参照核酸的第一连续稀释液；接着是第一连续稀释液的第二10倍稀释(例如，以形成以1mg/ml的浓度存在的参照核酸的第二系列稀释液)，依次类推。

如本文所用，术语“线性回归”是指用于建模因变量与一个或多个自变量之间的关系的统计，线性方法。在线性回归中，使用其未知模型参数从数据估计的线性预测器函数来建模关系。这种模型被称为线性模型。通常，对于单个自变量情况，(x，y)数据点以图形形式绘制为散点图，其中x是自变量，y是因变量。线性回归旨在获得表示因变量和自变量之间的关系的“最佳拟合线”。线性回归模型通常使用最小二乘法拟合，但它们也可以以其它方式拟合，例如通过最小化某一其它范数(例如，L1范数惩罚或L2范数惩罚)中的“成本函数”。

如本文所用，定量等温扩增测定的术语“线性动态范围”是指靶核酸的输入浓度范围，其中达到阈值的时间对浓度的对数(例如，2为底或10为底)的图是线性的。

如本文所用，术语“动态范围”是指给定测定(例如LAMP)能够检测的样品浓度或输入量的范围(从最大值到最小值)。

如本文所用，术语“诊断分数”是指用于分类或诊断医学状况的综合分数。诊断分数将使用某种算法鉴定为与医学状况相关的几种生物标志物的表达水平组合成可应用临床相关阈值的单一分数。在下面的部分J、K和L中讨论了示例性算法。

如本文所用，术语“群体测试”是指用于建立一种或多种生物标志物的表达水平的统计学的临床代表性群体的研究。本文所用的术语“临床代表性群体”是指足够大以建立统计学显著性的一组个体。例如，群体测试可测量患有和没有某种疾病的患者的生物标志物，并使用学生t检验、韦尔奇t检验、曼-惠特尼U检验或方差分析(ANOVA)、F检验等来确定生物标志物是否差异表达。统计学显著性可以设置为，例如，p＜0.05。

如本文所使用的，术语“机器学习模型”是指计算机系统使用以执行依赖于模式和来自一组测试数据的推断的任务的算法或统计学模型。将几种生物标志物综合到诊断分数中的某种算法可以是机器学习模型。示例性的机器学习模型包括线性回归、逻辑回归、决策树、支持向量机(SVM)、随机森林、K-均值、人工神经网络(ANN)等。

如本文所用，术语“热启动”是指通过使用于扩增的聚合酶失活来防止核酸非特异性扩增的扩增过程中的变化。热启动减少了引物二聚体的形成和引物对随后在扩增过程中延伸的非靶核酸的非特异性退火。存在用于热启动的多种技术(参见，例如，Paul等人，(2010)Methods Mol Biol.，630：301-18)。例如，可以通过使用抗体，适体或化学修饰使聚合酶失活，从而阻断聚合酶(其在室温和/或冰上具有适度的活性)在次佳温度下起作用。在热启动过程中，进行初始活化步骤(例如，在95℃)以活化聚合酶。该初始热活化步骤还使与聚合酶连接的抗体失活或从聚合酶去除化学修饰(例如赖氨酸修饰)。一旦这些组分失活，聚合酶就可以扩增测试样品中存在的靶核酸。在一些实施方案中，本文公开的方法包括热启动机制，例如抗体、适体或实时定量等温扩增测定中使用的聚合酶的化学修饰。

“引物”是指与靶核酸上的互补序列杂交并作为核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以具有多种长度，并且通常长度小于80个核苷酸，例如长度为20-70个核苷酸。在一个实施方案中，本申请的全长靶标特异性引物可以包含长度为30-65个核苷酸，例如长度为30、35、40、45、50、55、60或65个核苷酸。在一些实施方案中，多重扩增反应混合物可包括一种或多种全长靶标特异性引物，其具有20至65个核苷酸的长度。在多重扩增反应中可以使用不同长度的靶标特异性引物，使得一种或多种多重全长靶标特异性引物包含与多重全长靶标特异性引物对的其余部分相比不同的核苷酸长度(例如，多重扩增反应包含核苷酸长度为45个核苷酸的第一全长靶标特异性引物和核苷酸长度为58个核苷酸的第二全长靶标特异性引物)。可以基于本领域技术人员已知的原理设计用于等温扩增的引物的长度和序列，参见例如Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等人，eds，1990)。存在用于引物设计和评估的各种工具(例如，NCBI-Blast软件)。在本申请中，可以避免具有高度简并序列的引物，以降低在等温扩增反应过程中发生错误杂交的可能性。可以从DNA，RNA或DNA和RNA部分的嵌合体制备引物。在一些情况下，引物可以包括一个或多个修饰的核苷(例如，2-氨基-脱氧腺苷)或非天然核苷酸碱基(例如，DNA引物中的尿嘧啶)。在一些情况下，引物可以包括荧光标记，例如FRET供体和FRET受体部分。

如本文所用，术语“探针”是指能够与另一种感兴趣的寡核苷酸杂交的寡核苷酸，无论是天然存在的还是合成，重组或通过扩增产生的。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测，鉴定和分离。在一个实施方案中，考虑本发明中使用的任何探针将被标记，使得该标记在任何检测系统(包括荧光，放射性和发光系统)中是可检测的。本发明不旨在限于任何特定的检测系统或标记。

如本文所用，术语“扩增子”保留其在本领域中的正常和常规用途。扩增子是从DNA或eDNA模板产生的扩增产物。

如本文所用，术语“相对定量”是指在单一样品中靶核酸的表达水平与参照核酸的表达水平之间的比较，或在不同样品中相同靶核酸的表达水平之间的比较。相对定量可以与涉及测定样品中靶核酸的绝对量的“绝对定量”形成对比。

A.测试样品

在一些实施方案中，本文所述的方法、系统和相关试剂盒利用测试样品。在一些实施方案中，测试样品获自临床样品(例如，鼻拭子、活组织检查或抽血)，其被采集以用于鉴定疾病或医学状况目的的诊断评估。在一些实施方案中，测试样品由医师或兽医获得。在一些实施方案中，测试样品是自收集的样本，例如鼻拭子、颊拭子等。在一些实施方案中，测试样品通过医学装置(例如，白细胞分离装置)获得。可以使用任何合适的测试样品来实施本发明。

在一些实施方案中，样品获自哺乳动物，例如但不限于人。在一些实施方案中，样品获自非人哺乳动物，例如但不限于黑猩猩，猫，狗，猪，绵羊或牛。在一些实施方案中，测试样品获自健康或患病的哺乳动物。在一些实施方案中，样品获自诊断患有或怀疑患有病毒或细菌感染的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者被怀疑患有细菌感染(例如链球菌)。在一些实施方案中，哺乳动物受试者被怀疑患有病毒感染(例如，HIV)。

在一些实施方案中，从宿主获得的测试样品包括体液，例如尿液，唾液，血液或血液成分，例如但不限于血清，血浆和外周血单核细胞(PMBC)。可以使用任何合适的体液来实施本发明。

B.靶核酸

在一些实施方案中，本文所述的方法，设备和相关试剂盒利用靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸是哺乳动物核酸。在一些实施方案中，靶核酸是宿主核酸(例如，由宿主细胞产生的或在获自测试样品来源的样品中检测到的)。在一些实施方案中，靶核酸是哺乳动物宿主核酸(例如，哺乳动物DNA或RNA)。在一些实施方案中，靶核酸是哺乳动物宿主RNA。在优选的实施方案中，靶核酸是哺乳动物宿主mRNA。在一个实施方案中，靶核酸包括哺乳动物宿主mRNA内的剪接连接。在一个实施方案中，靶核酸包括与哺乳动物宿主mRNA同时检测的病原体来源的核酸。

在一些实施方案中，靶核酸存在于获自哺乳动物宿主的样品中，并且靶核酸从宿主样品中分离(例如，RNA提取)。在一些实施方案中，靶核酸存在于获自哺乳动物宿主的样品(例如，全血)中，并且靶核酸从宿主样品中分离(例如，QIAamp RNA血液微型试剂盒，Qiagen，目录号：52304)。

在一些实施方案中，与参照核酸相比，哺乳动物宿主靶核酸在测试样品中更丰富。在一些实施方案中，与参照核酸相比，哺乳动物宿主靶核酸在测试样品中更不丰富。任何合适的哺乳动物宿主核酸都可用于实施本发明。

C.参照核酸

在一些实施方案中，本文所述的方法，设备和相关试剂盒利用参照核酸。在一些实施方案中，参照核酸是哺乳动物核酸。在一些实施方案中，参照核酸是宿主核酸(例如，由宿主的细胞产生的或在从测试样品的来源获得的样品中检测到的)。在一些实施方案中，参照核酸是哺乳动物宿主核酸(例如，哺乳动物DNA或RNA)。在一些实施方案中，参照核酸是哺乳动物宿主RNA。在优选的实施方案中，参照核酸是哺乳动物宿主mRNA。在一些实施方案中，与靶核酸相比，哺乳动物宿主核酸在测试样品中更丰富。在一些实施方案中，与靶核酸相比，哺乳动物宿主核酸在测试样品中更不丰富。在优选的实施方案中，参照核酸和靶核酸由不同的基因表达。在另一个实施方案中，参照核酸和靶核酸由来自相同哺乳动物生物体(例如人或小鼠)的不同基因表达。任何合适的参照核酸都可用于实施本发明。

管家基因

在一些实施方案中，参照核酸是管家基因或其产物，例如相应的mRNA转录物。在一些实施方案中，参照核酸包括mRNA转录物，其是前mRNA分子，5′加帽mRNA分子，3′腺苷酸化mRNA分子或成熟mRNA分子。在优选的实施方案中，参照核酸是从哺乳动物宿主获得的成熟mRNA分子，该哺乳动物宿主也是测试样品的来源。

在一些实施方案中，参照核酸是哺乳动物管家基因或其基因产物(例如，mRNA)。在一些实施方案中，管家基因是哺乳动物宿主中一种或多种细胞群体组成型表达(即，连续转录)的基因。组成型表达的基因可以与兼性基因形成对比，所述兼性基因是指仅在需要时才转录的基因。适用于本发明的示例性管家基因包括肌动蛋白，GAPDH和泛素。任何合适的管家基因都可用于实施本发明。

在一些实施方案中，管家基因或其产物由宿主的细胞以相对恒定的速率表达，使得管家基因的表达速率可以用作针对其它宿主基因或其基因产物的表达的参照点。

在一些实施方案中，参照核酸是人管家基因。适用于本发明的示例性人管家基因包括但不限于KPNA6、RREB1、YWHAB、染色体1开放阅读框43(Clorf43)、带电荷的多泡体蛋白2A(CHMP2A)、ER膜蛋白复合物亚基7(EMC7)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、蛋白酶体β亚基2型(PSMB2)、蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)、成员RAS癌基因家族(RAB7A)、受体附属蛋白5(REEP5)、小核核糖核蛋白D3(SNRPD3)、含缬酪肽的蛋白(VCP)和液泡蛋白分选29同源物(VPS29)。在一些实施方案中，可以使用在http：//www.tu/ac/il-elieis/HKG/提供的任何管家基因(参见Eisenberg和Levanon，Trends Genet.(2013)，10：569-74)。

在一些实施方案中，参照核酸是猪管家基因。适用于本发明的示例性猪管家基因包括但不限于ACTB、B2M、GAPDH、HMBS、SDHA、HPRT1、TBP、YWHAZ和RPL32。

在一些实施方案中，参照核酸是牛管家基因。适用于本发明的示例性牛管家基因包括但不限于ACTB、GAPDH、HMBS、SF3A1HPRT1、H2A和SDHA。

在一些实施方案中，参照核酸是马管家基因。适用于本发明的示例性马管家基因包括但不限于ACTB、GAPDH、TOP2B、KRT8和RPS9。

D.测试样品处理

1.反应容器

在一些实施方案中，在第一反应容器中提供来自测试样品的靶核酸和参照核酸。如本文所用，“反应容器”是指可在其中进行本发明的系统，包括但不限于试管、微量离心管、孔、室、微孔(例如，微升板中的孔，例如96-、384-和1536-孔测定板)、毛细管、微流体装置或在合适的表面(包括但不限于玻璃、塑料、硅、金属氧化物、珠和硅烷化(例如烷氧基硅烷)表面)上或其内的测试位点。可以使用任何合适的反应容器来实施本发明。

在一些实施方案中，在定量等温扩增方法期间，反应容器含有小于1000μL的液体。在另一个实施方案中，在定量等温扩增方法期间，反应容器含有约15μL至约750μL的液体。

在另一个实施方案中，来自测试样品的靶核酸包含在第一反应容器中，来自测试样品的参照核酸包含在第二反应容器中。反应容器可以具有任何有用的尺寸(例如，宽度，长度，高度)并且由任何合适的材料组成。优选地，本申请的反应容器为微升或纳升规模。

在一些实施方案中，将多个反应容器用于多种靶核酸，每个反应容器用于等温扩增相应的靶核酸。

在一些实施方案中，反应容器还可包含捕获区，以在定量等温扩增之前，之后或期间将靶核酸或参照核酸与测试样品分离。在一个实施方案中，反应容器可包含捕获区，以在定量等温扩增后将靶核酸或参照核酸与测试样品分离。在一些实施方案中，捕获区可以包括过滤器、基质、聚合物、凝胶和膜(例如，二氧化硅膜、玻璃纤维膜、纤维素膜、硝化纤维素膜、聚砜膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、乙烯基共聚物膜或离子交换膜，包括本文所述的任何纤维(例如，玻璃纤维)、或颗粒(例如，二氧化硅颗粒、珠、亲和树脂或离子交换树脂)。

可以使用任何合适的材料作为反应容器。用于形成反应容器的材料根据反应容器的适当功能化所需的物理和化学特性来选择。合适的材料包括聚合物材料，例如有机硅聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷和环氧聚合物)、聚酰亚胺(例如，可商购的

2.等温扩增定时机制

热启动

在一些实施方案中，本文提供的方法，设备和试剂盒利用多种机制来确保靶核酸和参照核酸的扩增可以被可靠地进行比较(例如，彼此并且跨越多种非连续的实验重复比较)。在一些情况下，所述方法和设备包括“热启动”机制，其减少或抑制测试样品中非特异性(例如，假性)扩增产物的产生。热启动可以确保每个反应同时开始。在本领域中存在用于进行热启动扩增的多种技术(参见例如Paul等人，(2010)Methods Mol Biol.，630：301-18)。可以使用任何合适的热启动机制来实施本发明。

在一些实施方案中，“热启动”机制包括使定量等温扩增测定的聚合酶(例如RNA聚合酶或DNA聚合酶)失活的一种或多种抗体。

在一些实施方案中，“热启动”机制包括使定量等温扩增测定的聚合酶失活的一种或多种适体(参见，例如，WarmStart LAMP试剂盒，New England Biolabs目录号：E1700S；和WarmStart RTx逆转录酶，New England Biolabs目录号：M0380S)。适合与聚合酶一起使用的基于核酸的适体包括在美国专利第5,475,096号；第5,670,637号；第5,696,249号；第5,874,557号和第5,693,502号中所示的那些。

在一些实施方案中，“热启动”机制包括一种或多种化学修饰，其使定量等温扩增测定的聚合酶失活。在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包括赖氨酸修饰，由此存在于聚合酶中的一个或多个赖氨酸残基被化学修饰，使得聚合酶在扩增反应达到超过90℃的温度之前是无活性的。

在热启动机制期间，使用加热来活化聚合酶。这种初始热活化还可以使与聚合酶连接的抗体失活或从聚合酶去除化学修饰(例如赖氨酸修饰)。一旦这些组分失活，聚合酶就可以扩增测试样品中存在的靶核酸。

同时扩增

在一些实施方案中，本文提供的方法，设备和试剂盒利用同时扩增步骤以确保靶核酸和参照核酸的扩增可以被可靠地进行比较(例如，彼此并且跨越多种非连续的实验重复比较)。在一些实施方案中，测试样品中靶核酸的扩增(例如，在第一反应容器中)与测试样品中参照核酸的扩增(在第二反应容器中)同时发生。在一些实施方案中，同时扩增步骤包括在相同的反应容器中同时扩增靶核酸和参照核酸(例如，相同的起始和终止扩增反应次数)。在一些实施方案中，同时扩增可包括“热启动”机制，使得靶核酸和参照核酸(在相同或不同的反应容器中)的扩增直到靶核酸和参照核酸的每一种都达到相同的指定温度(例如，65℃)才开始，此时，扩增反应同时开始。

异步扩增

在一些实施方案中，本文提供的方法、设备和试剂盒利用靶核酸和参照核酸的异步扩增步骤(其具有用于引发扩增反应的时间指示剂)，使得两个或更多个反应可以被可靠地进行比较(例如，彼此并且跨越多种非连续的实验重复比较)。在一些实施方案中，与测试样品中的参照核酸的扩增(例如，在第二反应容器中)相比，测试样品中的靶核酸的扩增(例如，在第一反应容器中)异步地发生。在一些实施方案中，异步扩增包括在同一反应容器中扩增靶核酸和参照核酸，例如，通过在时间1提供与靶核酸互补的引物和/或探针，并在稍后的时间，例如时间2提供与参照核酸互补的引物和/或探针。为了使用异步扩增方法获得测试样品中靶核酸的相对丰度值，重要的是确定用于扩增靶核酸的扩增反应的长度。一旦扩增反应的长度是已知的，它就可以用作进行参照核酸扩增的基础。这样，在相同的时间段和相同的条件下扩增靶核酸和参照核酸中的每一种，使得扩增反应的输出可以彼此可靠地进行比较。

E.等温扩增

本文描述了用于等温扩增靶核酸的方法，设备和相关试剂盒。等温扩增测定不包括PCR所需的循环加热和冷却步骤。因此，等温扩增测定不需要昂贵的设备如热循环仪来进行等温扩增(参见，例如，Gill和Ghaemi，(2008)Nucleos.Nucleot.Nucl.，27：224-243；Kim和Easley(2011)，Bioanalysis，3：227-239和Yan等人，Mol.Biosyst.，10：970-1003)。在一些实施方案中，等温扩增包括实时等温扩增测定。在一些实施方案中，等温扩增测定是实时定量等温扩增测定。实时等温扩增，也称为定量等温扩增，通常用于实时测量扩增产物的量。通常，定量等温扩增包括使用标记的探针(例如，含荧光团的探针或荧光染料)以及扩增反应中的一组标准物，其允许定量样品中靶核酸的起始量。

在一些实施方案中，等温扩增包括逆转录酶和链置换等温酶，例如但不限于Bst聚合酶。逆转录酶等温扩增是用于从RNA合成和扩增DNA的方法。逆转录酶是一种将RNA逆转录成互补DNA(cDNA)的酶，cDNA随后通过等温扩增进行扩增。逆转录酶等温扩增可用于基因表达谱分析，以确定基因的表达或鉴定RNA转录物的序列，包括转录起始和终止位点。

在一些实施方案中，等温扩增包括链置换扩增(SDA)。SDA依赖于某些限制酶切割DNA的能力和5′-3′核酸外切酶缺陷型聚合酶延伸和置换下游链的能力。指数核酸扩增可以通过偶联有义和反义反应来实现，其中来自有义反应的链置换作为反义反应的模板。例如，可使用不切割DNA但在一条DNA链上产生切口的切口酶，如Nt.Alw1。SDA还可以包括热稳定限制酶(例如Aval)和热稳定聚合酶(例如Bst聚合酶)的组合。已知这种组合将扩增效率提高约10倍，从而能够扩增测试样品中作为单一拷贝存在的靶核酸。

在一些实施方案中，扩增反应测定包括转录介导的扩增(TMA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。在TMA和NASBA中，RNA聚合酶用于扩增RNA序列。通常，该方法利用第一和第二引物以及两种或三种酶(例如RNA聚合酶，逆转录酶和任选的RNase H)和具有RNA聚合酶启动子序列的第一引物。在靶核酸扩增的第一步中，第一引物与靶RNA(例如核糖体RNA)在确定的位点杂交。逆转录酶通过从启动子引物的3′末端延伸产生靶rRNA的cDNA拷贝。所得RNA：DNA双链体中的RNA可通过逆转录酶(如果存在)的RNase活性或另外的RNase H降解。接下来，第二引物结合cDNA拷贝，并通过逆转录酶从该引物的末端合成新的DNA链，产生双链DNA分子。RNA聚合酶识别DNA模板中的启动子序列并启动转录。新合成的RNA扩增子中的每一个都重新进入上述过程，并用作新一轮复制的模板。

在一些实施方案中，扩增反应包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。因此，靶核酸的等温扩增是通过相对的寡核苷酸引物与模板核酸结合并通过聚合酶延伸引物来实现的(参见，例如，Piepenburg等人，(2006)PloS Biol.，4(7)；e204)。在一些情况下，等温扩增反应包括重组酶(例如，来自细菌的RecA或来自噬菌体T4的UvsX)，一种或多种辅因子(例如，ATP或UvsY)，和/或一种或多种单链结合蛋白(SSB)。

在一些实施方案中，等温扩增测定包括解旋酶依赖性扩增(HDA)。HDA模拟体内系统，其使用DNA解旋酶产生单链模板，用于引物杂交和随后通过DNA聚合酶进行引物延伸。在HDA反应的第一步中，解旋酶沿着靶核酸穿过，产生允许引物与靶区域退火的单链靶区域。然后DNA聚合酶使用游离脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)延伸每个引物的3′末端以产生两个DNA重复。两条复制的DNA链独立地进入HDA的下一个循环，导致靶核酸的指数核酸扩增。

在一些实施方案中，等温扩增测定包括滚环扩增(RCA)。通常在RCA中，聚合酶围绕环状模板连续延伸引物，产生含有环状模板的许多重复拷贝的长扩增产物。在反应结束时，聚合酶已经产生了数千个环状模板拷贝，其中拷贝链与原始靶核酸相连。RCA允许靶核酸的空间分辨率和快速核酸扩增。分支扩增是RCA的变型，并利用闭合环状探针(C-探针)或扣锁探针(padlock probe)和具有高加工性的聚合酶在等温条件下指数扩增C-探针。

在一些实施方案中，等温扩增测定包括环介导的等温扩增(LAMP)。LAMP提供选择性并采用聚合酶和一组特殊设计的引物，所述引物识别靶核酸中的不同序列(参见，例如，Nixon等人，(2014)Bimolecular Detection and Quantitation，2：4-10；Schuler等人，(2016)Anal Methods.，8：2750-2755；以及Schoepp等人，(2017)Sci.Transl.Med.，9：eaal3693)。与PCR不同，使用多个内引物和外引物以及具有链置换活性的聚合酶在恒温(例如60-65℃)下扩增靶核酸。在一些情况下，含有与靶核酸的有义链和反义链的一部分互补的核酸序列的内引物对启动LAMP。通过内引物进行链置换合成后，由外引物对引发的链置换合成可引起单链扩增子的释放。单链扩增子可作为模板用于进一步合成，其由与靶核酸的另一端杂交并产生茎环核酸结构的第二内和第二外引物引发。在随后的LAMP循环中，一条内引物与产物上的环杂交并启动置换和靶核酸合成，产生原始的茎环产物和具有两倍长的茎的新的茎环产物。另外，扩增子环结构的3′末端用作自模板化链合成的起始位点，产生发夹样扩增子，其形成额外的环结构以引发随后的自模板化扩增循环。扩增继续积累许多拷贝的靶核酸。LAMP过程的最终产物是茎环核酸，其具有花椰菜样结构的靶核酸的串联重复，所述花椰菜样结构具有通过在同一链中的靶核酸序列的交替反向重复之间退火形成的多个环。

在一些实施方案中，等温扩增测定包括用于定量靶核酸的数字逆转录环介导的等温扩增(dRT-LAMP)反应(参见，例如，Khorosheva等人，(2016)Nucleic Acid Research，44：2e10。通常，LAMP测定在扩增反应期间产生可检测的信号(例如，荧光)。在一些实施方案中，可以检测和定量荧光。可以使用任何合适的用于检测和定量荧光的方法。在一些情况下，可以使用诸如Applied Biosystem的QuantStudio的装置来检测和定量来自等温扩增测定的荧光。

F.检测

通过定量实时等温扩增检测测试样品中靶核酸扩增的任何合适的方法可用于实施本发明。在一些实施方案中，测试样品中靶核酸的定量实时等温扩增可以通过检测在靶核酸的等温扩增期间掺入的与核苷酸或核苷酸类似物连接的一种或多种不同的(有区别的)荧光标记(例如，5-FAM(522nm)、ROX(608nm)、FITC(518nm)和Nile Red(628nm)来确定。在另一个实施方案中，测试样品中靶核酸的定量实时等温扩增可以通过检测在靶核酸的等温扩增期间掺入的与核苷酸或核苷酸类似物连接的单种荧光团种类(例如，ROX(608nm))来确定。在一些实施方案中，所使用的每种荧光团种类发射与任何其它荧光团种类不同的荧光信号，使得在测定中存在的其它荧光团种类中可以容易地检测到每种荧光团。

在一些实施方案中，通过定量实时等温扩增检测测试样品中靶核酸的扩增的方法可包括使用嵌入荧光染料，例如SYTO染料(SYTO 9或SYTO 82)。

在一些实施方案中，通过定量实时等温扩增来检测测试样品中的靶核酸的扩增的方法可以包括使用未标记的引物来等温扩增测试样品中的靶核酸，以及使用标记的探针(例如，具有荧光团)来检测测试样品中的靶核酸的等温扩增。

在一些实施方案中，通过定量实时等温扩增来检测测试样品中靶核酸的扩增的方法可以包括使用未标记的引物来等温扩增测试样品中存在的靶核酸，以及在5’末端具有5-FAM染料标记和在3’末端具有小沟结合剂(MGB)和非荧光猝灭剂的探针来检测靶核酸的等温扩增(例如，来自ThermoFisher Scientific的TaqMan基因表达测定)。

在一些实施方案中，检测测试样品中靶核酸的扩增可使用一步或两步定量实时等温扩增测定进行。在一步定量实时等温扩增测定中，将逆转录与定量等温扩增相结合，形成单一定量实时等温扩增测定。一步测定减少了亲手操作的次数以及处理测试样品的总时间。在一些情况下，例如，当来自逆转录反应的一些cDNA需要用于其它反应或要保留时，定量实时等温扩增测定可包括两步测定。两步测定包括第一步，其中进行逆转录，然后是第二步，其中进行定量等温扩增。确定是否应该进行一步或两步测定在本领域技术人员的范围内。

G.生成标准曲线

因为等温扩增测定可以以不同的效率扩增不同的核酸，所以有必要将在实时等温扩增测定中测量的达到阈值的时间校准为靶核酸和参照核酸的绝对拷贝数。这可以通过建立靶核酸和参照核酸的等温扩增的标准曲线来实现。标准曲线可以通过使用具有多个已知输入浓度的定量校准物样品进行实时等温扩增测定来获得。

在一些实施方案中，为了产生标准曲线，通过进行定量材料的连续稀释来获得定量校准物样品。作为实例，制备浓度为约1×10

为了获得标准曲线，对具有已知量(例如，1μL)的具有相应浓度的靶核酸的相应校准物样品的每个等分试样进行实时等温扩增测定。例如，每个等分试样可以包括1μL的相应校准物样品。例如，在上述实例中，存在覆盖浓度范围为10

在各相应校准物样品的实时等温扩增测定中，插入荧光染料(例如dsDNA染料)或靶核酸的荧光标记所发射的荧光强度被测量为时间的函数。图1显示了根据一些实施方案，在实时定量等温扩增测定中，荧光强度作为时间的函数的示例性图110。虚线120表示预定的阈值强度。从等温扩增开始的时刻起经过的时间是达到阈值时间Tt。图2显示了根据一些实施方案，在具有不同浓度的靶核酸的8个样品的实时定量等温扩增测定中，荧光强度作为时间的函数的示例性图210。根据作为时间的函数的每个相应的荧光曲线210，可以确定相应的达到阈值的时间。因此，分别获得8个校准物样品的8个达到阈值的时间Tt

对于指数扩增，达到阈值的时间与起始拷贝数(也称为模板丰度)的对数(例如，以10为底的对数)成线性比例。图3显示了根据一些实施方案，从图2所示的荧光曲线获得的数据点(由圆圈表示)的散点图。每个数据点代表一个数据对[Log10(CpyNumber)，Tt](注意，CpyNumber是指在等温扩增测定中核酸的起始拷贝数)。如图所示，数据点大约落在直线310上。对图中的数据点进行线性回归，以获得直线310，该直线310以总偏差的最小量最好地将数据点拟合。线性回归的结果是由以下等式表示的直线。

Tt＝m×Log10(CpyNumber)+b， (1)

其中m是线310的斜率，并且b是y截距。斜率m代表靶核酸等温扩增的效率；b代表模板拷贝数接近零时，达到阈值的时间。由等式(1)表示的直线被称为标准曲线。

在一些实施方案中，可以对每个样品进行等温扩增测定的重复(例如，一式三份)，以便获得数据的更高水平的置信度。可以对重复的达到阈值的时间进行平均，并且可以计算标准偏差。

一旦对于给定的等温扩增测定建立了标准曲线，就可以使用标准曲线使用以下等式将达到阈值的时间转换为起始拷贝数，用于等温扩增测定的靶核酸拷贝的未知起始数目的将来运行。

标准曲线动态范围

通常，在每个低拷贝数或非常高拷贝数处的数据点可能离开直线310。这样的拷贝数范围被称为标准曲线的动态范围：在该范围内，数据点可以由直线310表示。由标准曲线表示的达到阈值的时间与拷贝数的对数之间的线性关系将仅在动态范围内有效。

如果靶核酸和参照核酸的扩增效率对于给定的等温扩增测定是不同的，则可能需要获得靶核酸和参照核酸的单独的标准曲线。因此，可以进行两组实时等温扩增测定，一组用于建立靶核酸的标准曲线，另一组用于建立参照核酸的标准曲线。在考虑多种靶核酸的情况下，可以获得每种靶核酸的标准曲线。

场外标准曲线(Off-board standard curves)

在一些实施方案中，在获得测试样品之前生成标准曲线。也就是说，标准曲线不是与测试样品的定量等温扩增同场(on-board)产生的。这种标准曲线可以被称为场外标准曲线。如下所述，可以使用场外标准曲线来估计相对丰度值。

H.估计相对丰度值

对于靶核酸A的未知输入浓度的测试样品，对测试样品的第一等分试样进行第一实时等温扩增测定以获得关于靶核酸A的第一达到阈值的时间Tt

可以使用参照核酸B的标准曲线将第二达到阈值的时间Tt

将靶核酸A的起始拷贝数相对于参照核酸B的起始拷贝数归一化以获得相对丰度值为：

例如，如果靶核酸A的起始拷贝数是1000，并且参照核酸B的起始拷贝数是10，则可以将相对丰度(A/B)计算为：

在第一等分试样和第二等分试样含有不同量的测试样品的情况下，获得相对丰度为：

其中M

例如，如果M

在一些其它实施方案中，可以对靶核酸A和参照核酸B进行一次等温扩增测定。因为等温扩增测定是在测试样品的相同等分试样上进行的，所以方程(5)可以用来获得相对丰度。

无标准曲线的相对丰度

在靶核酸和参照核酸的扩增效率具有已知的大致相同的值并且靶核酸的预期拷贝数和参照核酸的预期拷贝数在动态范围内的情况下，可以直接从达到阈值的时间获得相对丰度而不使用标准曲线。例如，假设靶核酸和参照核酸的扩增效率均为m，并且由于相似的效率，对于两个测定b是相同的，则相对丰度可以计算为：

如上所述，在靶核酸和参照核酸的扩增效率具有已知的大致相同的值的情况下，确定测试样品中靶核酸的相对丰度不是基于靶核酸的起始拷贝数，并且不需要绝对定量样品中的靶核酸。

I.多种靶核酸

在一些实施方案中，靶核酸的相对丰度值可以与测试样品中另外的靶核酸的一个或多个另外的相对丰度值组合使用。在一些实施方案中，测试样品中的多种靶核酸的多个相对丰度值可用作能输出单个诊断分数(例如可区分测试样品中的病毒感染和细菌感染和/或将测试样品诊断为具有细菌和/或病毒感染的诊断分数)的算法的输入(参见，例如，Sweeney等人，(2016)，Sci.Transl.Med.，8：346ras91346ra91)。

在一些实施方案中，选择用于评价的靶核酸选自已知由于细菌感染而具有增加的宿主表达的靶核酸，例如CTSB、TNIP1、GPAA1和HK3。在一些实施方案中，选择用于评价的靶核酸选自已知由于病毒感染而具有增加的宿主表达的靶核酸，例如IFI27、JUP和LAX1。

在一些实施方案中，使用机器学习或其它算法将基因组合以产生单个诊断分数，例如可以区分细菌和病毒感染的诊断分数。这种分数在具有细菌感染的患者中可以较高，而在具有病毒感染的患者中可以较低，使得看见诊断分数高于设定阈值的患者的医生被引导至用抗生素治疗的作用。在这些实施方案中，算法分数比单独的任何单个基因水平承载更多的诊断能力(例如，在用于区分细菌与病毒感染的接收器操作特性曲线下具有更大的面积)。

在一些实施方案中，用于将多种生物标志物综合成单个诊断分数中的算法的类型可以包括但不限于几何平均值的差异，算术平均值的差异，和的差异，简单和等。在一些实施方案中，可以使用机器学习模型，例如回归模型，基于树的机器学习模型，支持向量机(SVM)模型，人工神经网络(ANN)模型等，基于多种生物标志物的相对丰度值来估计诊断分数。

J.用于通过使用场外标准曲线进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法

绝对定量通常需要在与测试样品相同的测定中产生标准曲线以确保适当的校准和足够的精确度。这样获得的标准曲线被称为同场标准曲线(on-board stand curve)。根据一些实施方案，使用多种生物标志物的实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法仅需要相对定量，因此可以使用场外标准曲线。这可以实现能够可靠地和经济地进行准确诊断的一类新的超快速诊断实时定量等温扩增测定。

图4显示了简化流程图，其示出了根据一些实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。

在402，获得第一标准曲线，第二标准曲线和参照标准曲线。第一标准曲线包括将第一靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第一函数。第二标准曲线包括将第二靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第二函数。参照标准曲线包括将参照核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的参照函数。在对测试样品进行实时定量等温扩增之前，生成第一标准曲线，第二标准曲线和参照标准曲线。

在404，从哺乳动物受试者获得测试样品。测试样品含有第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸。

在406，将测试样品添加到至少一个反应容器中。所述至少一个反应容器包含用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物。

在408，在至少一个反应容器中开始至少一个等温扩增反应。

在410，在至少一个反应中确定第一靶核酸的第一达到阈值的时间。

在412，在至少一个反应中确定第二靶核酸的第二达到阈值的时间。

在414，在至少一个反应中确定参照核酸的参照达到阈值的时间。

在416，使用第一标准曲线的第一函数，基于第一达到阈值的时间，估计测试样品中第一靶核酸的第一起始拷贝数。

在418，使用第二标准曲线的第二函数，基于第二达到阈值的时间，估计测试样品中第二靶核酸的第二起始拷贝数。

在420，使用参照标准曲线提供的参照函数，基于参照达到阈值的时间，估计测试样品中参照核酸的参照起始拷贝数。

在422，基于第一靶核酸的第一起始拷贝数和参照核酸的参照起始拷贝数，估计测试样品中第一靶核酸相对于参照核酸的第一相对丰度值。

在424，基于第二靶核酸的第二起始拷贝数和参照核酸的参照起始拷贝数，估计测试样品中第二靶核酸相对于参照核酸的第二相对丰度值。

在426，基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数。

在428，通过将测试样品的诊断分数与预定阈值诊断分数进行比较来进行医学状况的临床诊断。

在一些实施方案中，等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。

在一些实施方案中，在至少一个反应容器中的至少一个等温扩增反应使用热启动机制开始。

在一些实施方案中，诊断分数与第一靶核酸的第一达到阈值的时间和第二靶核酸的第二达到阈值的时间之间的差异有关。

应当理解，图4中所示的具体步骤提供了根据本发明的一些实施方案通过进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的具体方法。也可以根据替换实施方案进行其它步骤序列。例如，本发明的替换实施方案可以以不同的顺序进行上面概述的步骤。此外，图4中所示的各个步骤可以包括多个子步骤，所述多个子步骤可以根据各个步骤以多种序列进行。此外，根据特定的应用，可以增加或去除附加的步骤。本领域技术人员将认识到许多变化，修改和替换。

K.用于通过进行实时定量等温扩增而不使用标准曲线来估计诊断分数的方法

根据一些实施方案，估计诊断分数的方法可以利用实时定量等温扩增而不使用标准曲线。例如，诊断分数可以综合多种先前鉴定的生物标志物的表达水平。如果已经在目标测试群体上预先验证了所鉴定的生物标志物的等温扩增测定预期在线性动态范围内进行，则可以将达到阈值的时间直接插入到用于估计诊断分数的算法中，而不使用标准曲线将其转换为拷贝数。在一些实施方案中，临床相关的阈值诊断分数可以通过群体研究建立。在群体研究中，对感兴趣的患者的临床群组进行实时定量等温扩增测定。使用从实时定量等温扩增测定获得的达到阈值的时间来训练统计学模型以建立阈值诊断分数。一旦建立，阈值诊断分数可用于诊断患者。

图5显示了简化流程图，其示出了根据一些其它实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增而不使用标准曲线来估计诊断分数的方法。

在502，从哺乳动物受试者获得测试样品。测试样品包含至少第一靶核酸和至少第二靶核酸，以及参照核酸。第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸各自在测试样品中具有的预期浓度如在感兴趣的群组群体上验证的实时定量等温扩增的动态范围内。

在504，将测试样品的等分试样添加到含有用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物的至少一个反应容器中。

在506，在至少一个反应容器中开始至少一个等温扩增反应。

在508，在至少一个反应中确定第一靶核酸的第一达到阈值的时间。

在510，在至少一个反应中确定第二靶核酸的第二达到阈值的时间。

在512，在至少一个反应中确定参照核酸的参照达到阈值的时间。

在514，至少基于第一达到阈值的时间和参照达到阈值的时间来估计测试样品中第一靶核酸相对于参照核酸的第一相对丰度值。

在516，至少基于第二达到阈值的时间和参照达到阈值的时间估计测试样品中第二靶核酸相对于参照核酸的第二相对丰度值。

在518，基于第一靶核酸的第一达到阈值的时间和第二靶核酸的第二达到阈值的时间来估计测试样品的诊断分数。

在一些实施方案中，方法500还包括，在获得测试样品之前，对感兴趣的群组群体进行实时定量等温扩增以建立临床相关阈值诊断分数；以及在估计测试样品的诊断分数后，通过将测试样品的诊断分数与阈值诊断分数进行比较，进行医学状况的临床诊断。

在一些实施方案中，等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。

在一些实施方案中，诊断分数与第一靶核酸的第一达到阈值的时间和第二靶核酸的第二达到阈值的时间之间的差异有关。

在一些实施方案中，测试样品含有多种第一靶核酸和多种第二靶核酸。诊断分数与基于多种第一靶核酸的达到阈值的时间的第一统计值和基于多种第二靶核酸的达到阈值的时间的第二统计值之间的差异有关。

应当理解，图5中所示的具体步骤提供了根据本发明的-些实施方案通过进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的具体方法。也可以根据替换实施方案进行其它步骤序列。例如，本发明的替换实施方案可以以不同的顺序进行上面概述的步骤。此外，图5中所示的各个步骤可以包括多个子步骤，所述多个子步骤可以根据各个步骤以多种序列进行。此外，根据特定的应用，可以增加或去除附加的步骤。本领域技术人员将认识到许多变化，修改和替换。

L.使用多体积实时定量等温扩增测定来估计诊断分数的方法

根据一些实施方案，使用多种生物标志物物估计诊断分数的方法可以利用如上所述的多体积实时定量等温扩增方法。例如，在包括七种鉴定的靶基因IFI27、JUP、LAX1、HK3、TNIP1、GPAA1、CTSB的HostDx-Fever qLAMP测定中，预期七种靶基因中的一些比测试样品中的一些其它靶基因更丰富。对预期更丰富的那些基因在大体积反应容器中进行实时定量等温扩增测定可能是有利的，并且对预期不太丰富的那些基因在小体积反应容器中进行实时定量等温扩增测定可能是有利的。以这种方式，考虑到有限量的测试样品，可以成功地对具有较高预期丰度的基因和具有较低预期丰度的基因进行定量等温扩增测定。

在一些实施方案中，各种基因的预期相对丰度可以在孔分配之前通过群体测试来确定。在群体测试中，对大到足以建立统计学显著性的临床代表性群体中的各种基因进行实时定量等温扩增测定。例如，群体测试可以使用学生t检验、韦尔奇t检验、曼-惠特尼U检验、或方差分析(ANOVA)、F检验等。统计显著性可以设置为，例如，p＜0.05。

图6显示了简化流程图，其示出了根据一些实施方案，通过对测试样品进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的方法。

在602，获得测试样品。测试样品包含至少第一靶核酸和至少第二靶核酸，以及参照核酸。第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸各自包括哺乳动物宿主核酸。

在604，将测试样品的第一等分试样添加到第一反应容器中以定量等温扩增第一靶核酸，并将测试样品的第二等分试样添加到第二反应容器中以定量等温扩增第二靶核酸。第一反应容器和第二反应容器中的每一个包含用于等温扩增第一靶核酸，第二靶核酸和参照核酸的主混合物。第二靶核酸在测试样品中具有比所述第一靶核酸更低的预期丰度。第一等分试样具有第一体积。第二等分试样具有大于第一体积的第二体积。

在606，通过以下步骤在第一反应容器中进行第一实时定量等温扩增测定：在第一反应容器中开始第一反应；确定第一反应中第一靶核酸的第一达到阈值的时间；确定第一反应中参照核酸的第一参照达到阈值的时间；以及至少基于所述第一达到阈值的时间和所述第一参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第一靶核酸相对于所述参照核酸的第一相对丰度值。

在608，通过以下步骤在第二反应容器中进行第二实时定量等温扩增测定：在第二反应容器中开始第二反应；确定第二反应中第二靶核酸的第二达到阈值的时间；确定第二反应中参照核酸的第二参照达到阈值的时间；以及至少基于所述第二达到阈值的时间和所述第二参照达到阈值的时间来估计所述测试样品中所述第二靶核酸相对于所述参照核酸的第二相对丰度值。

在610，基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数。

在一些实施方案中，方法600还包括，在将测试样品的第一等分试样添加到第一反应容器中并将测试样品的第二等分试样添加到第二反应容器中之前，通过对临床代表性群体中的第一靶核酸和第二靶核酸进行实时定量等温扩增测定，确定第二靶核酸具有比第一靶核酸低的预期丰度。

在一些实施方案中，诊断分数与第一相对丰度值和第二相对丰度值之间的差异有关。

在一些实施方案中，测试样品包含多种第一靶核酸和多种第二靶核酸，并且诊断分数与基于多种第一靶核酸的相对丰度值的第一统计值和基于多种第二靶核酸的相对丰度值的第二统计值之间的差异有关。在一些实施方案中，第一统计值包括多种第一靶核酸的相对丰度值的几何平均值，第二统计值包括多种第二靶核酸的相对丰度值的几何平均值。在一些实施方案中，诊断分数用于诊断患者是患有细菌感染还是病毒感染。在一些实施方案中，多种第一靶核酸包括在病毒感染中较高的基因，并且多种第二靶核酸包括在细菌感染中较高的基因。例如，多种第一靶核酸可以包括IFI27、JUP和LAX1；并且多种第二靶核酸可以包括HK3、TNIP1、GPAA1和CTSB。

在一些实施方案中，测试样品含有多种第一靶核酸和多种第二靶核酸。使用回归模型，基于树的机器学习模型，支持向量机模型或人工神经网络(ANN)模型，基于多种第一靶核酸的相对丰度值和多种第二靶核酸的相对丰度值来估计诊断分数。

在一些实施方案中，第一实时定量等温扩增测定和第二实时定量等温扩增测定各自是实时定量环介导的等温扩增(LAMP)测定。

在一些实施方案中，第一反应容器中的第一反应和第二反应容器中的第二反应中的每一个使用热启动机制开始。

应当理解，图6中所示的具体步骤提供了根据本发明的一些实施方案通过进行实时定量等温扩增来估计诊断分数的具体方法。也可以根据替换实施方案进行其它步骤序列。例如，本发明的替换实施方案可以以不同的顺序进行上面概述的步骤。此外，图6中所示的各个步骤可以包括多个子步骤，所述多个子步骤可以根据各个步骤以多种序列进行。此外，根据特定的应用，可以增加或去除附加的步骤。本领域技术人员将认识到许多变化，修改和替换。

M.平台/装置

在一些方面，本公开提供了用于获得测试样品中靶核酸的相对丰度值的平台或装置。可以使用用于进行所述方法的任何合适的装置或平台。在一些实施方案中，所述装置可用于相对定量测试样品中的宿主哺乳动物核酸，其中所述宿主哺乳动物核酸反映具有急性感染，例如细菌或病毒感染的宿主。在一些实施方案中，急性感染已经诱导脓毒病。

在一些实施方案中，所述装置是微流体装置。在一些实施方案中，微流体装置允许在同一反应容器中扩增靶核酸和参照核酸。在另一个实施方案中，微流体装置允许在不同的反应容器(例如，单独的孔)中扩增靶核酸和参照核酸。

能够将样品加热至恒定温度并监测荧光、浊度、发光、吸光度(颜色)或磁/电磁电流的任何装置都可以用于等温扩增。在一些实施方案中，所述装置是来自ThermoFisherScientific的TaqMan基因表达测定。

在一些实施方案中，用于实施该方法的装置包括荧光标记检测系统，例如但不限于Applied Biosystem QuantStudio实时PCR系统(在等温条件下)。

如本领域技术人员显而易见的是，用于进行本发明的平台或装置可以包括任何有用的尺寸(例如，长度，宽度和深度)。在一些实施方案中，所述装置是利用一个或多个含有靶核酸和参照核酸的反应容器的台式装置。在一些实施方案中，反应容器容纳在单个单元中，例如96孔板。在一些实施方案中，反应容器(或多个外壳单元)可以在装置中顺序地或同时地储存、测试和/或分析。

图7显示了根据一些实施方案使用实时定量等温扩增测定来估计相对丰度值的设备700的示意性框图。

设备700包括一个或多个反应容器710。每个反应容器710被配置成容纳含有至少一种靶核酸和参照核酸的测试样品的等分试样。每个反应容器710进一步被配置成容纳用于等温扩增至少一种靶核酸和参照核酸的主混合物。主混合物还包括用于检测至少一种靶核酸和参照核酸的荧光标记。

在一些实施方案中，一个或多个反应容器710至少包括第一反应容器和第二反应容器。第一反应容器可以被配置用于容纳测试样品的第一等分试样和用于第一靶核酸的等温扩增的主混合物的第一部分。第二反应容器可以被配置用于容纳测试样品的第二等分试样和用于第二靶核酸的等温扩增的主混合物的第二部分。在一些实施方案中，一个或多个反应容器710包括第三反应容器，其被配置用于容纳测试样品的第三等分试样和用于参照核酸的等温扩增的主混合物的第三部分。

设备700还包括等温扩增装置720，用于在一个或多个反应容器710中开始等温扩增反应。例如，等温扩增装置720可以包括加热元件和温度控制，以将反应容器710及其内容物加热到开始等温扩增至少一种靶核酸和参照核酸所需的温度。等温扩增反应可以产生与至少一种靶核酸相关的荧光和与参照核酸相关的荧光。

设备700还包括光学耦合到一个或多个反应容器710的一个或多个荧光检测器730。每个荧光检测器730被配置为在等温扩增反应期间实时检测与各靶核酸相关的荧光或与参照核酸相关的荧光。因此，与各靶核酸相关的荧光强度可以作为时间的函数来测量，并且与参照核酸相关的荧光强度可以作为时间的函数来测量。在一些实施方案中，每个荧光检测器被配置为在等温扩增反应期间以规则的间隔检测与各靶核酸相关的荧光。例如，在等温扩增反应期间，可以每分钟一次，每30秒一次，每20秒一次，每10秒一次，每5秒一次或每秒一次发生规则的荧光检测间隔。

设备700还包括计算机存储器740。在一些实施方案中，计算机存储器被配置为存储一个或多个标准曲线。例如，第一标准曲线可以提供将第一靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第一函数。第二标准曲线可以提供将第二靶核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第二函数。第三标准曲线可以提供将参照核酸的起始拷贝数与达到阈值的时间相关联的第三函数。第一标准曲线，第二标准曲线和第三标准曲线可以从校准物样品的先前等温扩增反应获得，并存储在存储器740中，用于随后的测试样品的等温扩增反应。在一些实施方案中，计算机存储器740被配置为存储一个或多个阈值荧光强度值。

设备700还包括耦合到荧光检测器730和存储器740的计算机处理器750。存储器740还可以存储要由计算机处理器750执行的指令。

在一些实施方案中，处理器750被配置为基于与第一靶核酸相关的荧光强度作为时间的函数和所存储的第一阈值荧光强度值来确定第一靶核酸的第一达到阈值的时间，并且使用由第一标准曲线提供的第一函数，基于第一达到阈值的时间来估计测试样品中第一靶核酸的起始拷贝数。处理器750进一步被配置为基于与第二靶核酸相关的荧光强度作为时间的函数和所存储的第二阈值荧光强度值来确定第二靶核酸的第二达到阈值的时间，并且使用由第二标准曲线提供的第一函数，基于第二达到阈值的时间来估计测试样品中第二靶核酸的初始拷贝数。处理器750进一步被配置为基于与参照核酸相关的荧光强度作为时间的函数和所存储的第三阈值荧光强度值来确定参照核酸的第三达到阈值的时间，并且使用由第三标准曲线提供的第三函数，基于第三达到阈值的时间来估计测试样品中的参照核酸的初始拷贝数。处理器750进一步被配置为基于第一靶核酸的起始拷贝数和参照核酸的起始拷贝数来估计测试样品中第一靶核酸相对于参照核酸的相对丰度值，并且基于第二靶核酸的起始拷贝数和参照核酸的起始拷贝数来估计测试样品中第二靶核酸相对于参照核酸的相对丰度值。处理器750可以被配置为基于第一靶核酸的第一相对丰度值和第二靶核酸的第二相对丰度值来估计测试样品的诊断分数。

N.试剂盒

在一些方面，本公开提供用于计算测试样品中靶核酸的相对丰度值的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一个反应容器和一种或多种用于进行实时定量等温扩增的组分(例如RNA聚合酶、逆转录酶和/或DNA聚合酶)。在一些实施方案中，试剂盒可以包括两个或更多个反应容器(例如，第一反应容器和第二反应容器)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于等温扩增的主混合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于实时定量等温扩增的主混合物。试剂盒可附有用于解释来自实时定量等温扩增测定的结果的说明书。用于进行实时定量等温扩增测定的说明书(例如，书面，CD-ROM等)也可包括在试剂盒中。

实施例

提供以下实施例用于说明，但不限制所要求保护的发明。

实施例1：等温扩增测定设置

等温测定引物包括正向内引物(FIP)和正向外引物(F3)以及相应的反向内引物(BIP)和反向外引物(B3)，以及正向和反向速率增强引物(FR，BR)。使用ThermoStart(也称为热启动)LAMP 2X Master Mix(NEB，CAT#E1700S)进行测定，将制造商的方案调整为20μL总反应体积，并添加任选的荧光染料至最终浓度1x。添加引物至最终浓度为1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3和0.4μM FR/BR。用1mM dUTP(ThermoFisher CAT#R0133)补充测定以提高测定保真度。以含有经验优化质量的样品材料的标准1μL体积添加模板。最后，添加水以使每个反应的最终体积达到20μL。将测定分布在96孔板(ThermoFisher CAT#4346906)中，用于使用实时PCR仪器定量扩增。

在QuantStudio 6 Flex实时PCR系统(ThermoFisher)上使用FAM/SYBR Green通道进行定量等温扩增以监测染料荧光。循环条件包括在25℃下保持5分钟的步骤，随后在65℃下保持60分钟的步骤，在此期间以20秒的间隔监测荧光。使用含有温启动聚合酶的NEB试剂盒确保仅当溶液温度达到45℃时才引发等温反应。这允许通过确保在不同运行中确定的等效的达到阈值的时间(Tt)表示在那些运行中从反应开始的相等时间流逝来比较板/运行之间的测定。这也允许将测定校准到先前确定的标准曲线，从而可以比较不同效率的测定用于相对靶标定量。

实施例2：获得标准曲线和计算相对丰度

为了校准等温扩增测定，由商业供应商(例如，Integrated DNA Technologies)合成对应于感兴趣的mRNA序列的双链DNA模板，以用作定量对照样品。将冻干的合成模板重悬于TE缓冲液(20mM Tris pH8.0，0.5mM EDTA)至最终浓度为约1×10

实施例3：阈值强度的选择

阈值是所使用的荧光染料或探针以及在其上检测荧光的仪器的函数。作为一般原理，通过鉴定线性扩增期中显著高于背景信号的，并且在多个实验重复中保持得到的达到阈值的时间(Tt)的最低标准偏差的点来确定阈值。当确定标准曲线和测量感兴趣的样品中的靶标丰度时，对于给定的靶标必须使用相同的阈值。尽管当为每种靶标确定唯一的标准曲线时，对于不同的靶标不必使用相同的阈值，但是重要的是在不进行标准曲线校准的相对比较中针对所有靶标保持相同的阈值。

实施例4：通过等温扩增的相对靶核酸定量以及与金标准mRNA定量测定的比较

为了使用如本文所述的等温扩增测定评价来自患者血液样品的相对mRNA定量的性能，测定靶核酸(本文称为“生物标志物IFI27”)相对于参照核酸(本文称为“管家基因YWHAB”)的相对丰度值，并将其与使用在NanoString nCounter(NanoString TechnologiesInc.，Seattle)上进行的金标准mRNA定量测定获得的测量结果进行比较。NanoString精度高，是一次测定多基因表达水平的有用工具；然而，其对于临床应用也可能太慢(每次测定4-6小时)。

样品选择和RNA提取

为了说明在临床环境中预期的靶核酸丰度范围，除了一组健康对照(6)之外，还从具有病毒感染(6)或细菌性脓毒病(8)的患者中选择样品(参见表1)。将样品收集在PAXgene血液RNA管(PreAnalytiX，GmbH)中，并且在-80C储存之前根据制造商的方案进行处理。

在分析时，将样品在室温下解冻2小时，然后倒置超过10次以使真空容器的内容物均匀化。使用Qiacube(Qiagen，Maryland)对各样品的等分试样进行最终RNA纯化，并使用Qubit荧光计(ThermoFisher Scientific，Waltham)定量纯化的总RNA(参见表1)。

结果-相对丰度评价

为了评价靶核酸相对于参照核酸的相对丰度，使用上述一步逆转录-等温扩增测定，在50ng总RNA的单丛(single-plex)中扩增每种靶核酸或参照核酸。

测定每个样品中每种靶核酸和每种参照核酸的达到阈值的时间(Tt)，然后使用先前测定的标准曲线转化成Log

同样的RNA样品也在NanoString nCounter上分析，其提供样品中存在的宿主mRNA转录本的直接定量而不扩增。将使用NanoString nCounter获得的IFI27和YWHAB的转录本丰度值进行对数转化，并确定这些值的比率，并且与使用上述等温扩增测定获得的测量值相比较。

为了量化等温扩增测定相对于金标准的性能，将使用等温扩增测定确定的相对丰度值作为使用NanoString nCounter确定的值的函数作图，并计算所有样品中这些测量之间的皮尔森相关系数(参见图7)。

表1：临床样品诊断、靶核酸和参照核酸丰度

图8显示了将通过等温扩增测定和金标准NanoString nCounter确定的靶核酸(IFI27)相对于参照核酸(YWHAB)丰度相关联的相关图(具有皮尔森系数)。对于两种测定，将值绘制为Log

等温扩增测定与金标准测定表现出异常的相关性(r＝0.97)，表明在相对丰度测量中具有极好的一致性。重要的是，对于两种测定，代表不同诊断的组(例如，细菌性脓毒病，病毒感染或健康样品)聚集，表明当使用等温扩增测定时维持了临床效用。

实施例5：HostDx-Fever qLAMP测定以及与金标准mRNA定量测定的比较

一组7种基因先前被鉴定为可用于分类病毒感染或细菌感染的生物标志物。这7种基因包括在病毒感染中较高的IFI27、JUP、LAX1和在细菌感染中较高的HK3、TNIP1、GPAA1、CTSB(参见美国专利申请公开2019/0144943)。基于七种生物标志物的水平的综合诊断分数(称为Fever分数或Host-Dx-Fever分数)可以使用几何平均值的差异(DGM)来估计，如根据下式所表示的：

在一个实验中，在分析验证群组中验证七种靶基因中的每一种的HostDx-FeverqLAMP测定。提取总RNA，并在QuantStudio6 qPCR机上一式三份进行LAMP测定。分析金标准是NanoString nCounter绝对mRNA计数。对于两种技术，将HostDx-Fever分数计算为如等式(8)所示的mRNA测定的DGM。

使用等温扩增在没有标准曲线的情况下的相对定量

在实验中，用两组测定测试相同的细菌和病毒临床样品。每一组测定靶向先前鉴定的七种生物标志物，当使用DGM方法组合时，所述生物标志物产生可将细菌感染与病毒感染分离的单一诊断分数。第一组测定使用NanoString nCounter数字mRNA平台，其中将管家标准化计数提供到DGM等式(例如，等式(8))。

第二组测定是靶向相同mRNA的一组等温qLAMP测定。将每个测定的达到阈值的时间Tt提供到DGM等式(例如，等式(8))。注意，将达到阈值的时间直接提供到DGM等式，而不是使用标准曲线将其转换成绝对拷贝数。

图9A显示了将通过等温扩增测定和通过金标准NanoString nCounter确定的诊断分数相关联的相关图(具有皮尔森系数)。黑圈表示病毒感染；灰圈表示细菌感染。为了便于解释，直线表示通过标准线性回归分析的曲线拟合。等温扩增测定与金标准测定表现出异常的相关性((r＝0.944)。这表明即使不使用标准曲线，qLAMP技术也可以在相关临床样品中相对于分析金标准产生高度精确的诊断结果。

图9B显示了基于qLAMP测定的HostDx-Fever分数分布。图9C显示了基于NanoString nCounter的HostDx-Fever分数分布。注意，代表不同诊断(例如，细菌感染或病毒感染)的组对于两种类型的测定聚集。这表明在任一技术上运行的HostDx-Fever可以准确地区分感染类别，并且HostDx-Fever生物标志物对潜在的定量技术相对不敏感。然而，这两种技术的最佳临床截止值可能不同，因为即使在保持相似的相对定量的同时，技术平台也可以产生不同的绝对数。

实施例6：多体积等温qLAMP测定

进行实验以测试在给定模板浓度下询问较大体积是否可在线性动态范围的下端提高qLAMP测定的成功率。这些假设是：(i)qLAMP，类似于qPCR，测量在反应容器中积累任意但固定的靶基因阈值拷贝数所需的时间；(ii)在饱和结合条件下，达到阈值数所需的时间取决于(a)反应开始时存在的拷贝数，和(b)每单位时间的增加速率(称为反应效率或扩增效率)。

在实验中，在两个不同体积：10μL和50μL中维持相同浓度的模板。如果测得的达到阈值的时间Tt落在预定的截止值以下，则认为等温扩增是成功的。截止值可以定义为线性回归拟合成标准曲线滴定的y截距，如下所示，或通过其它方法。

图10示出了一个例子，其中截止值被定义为线性回归拟合成标准曲线滴定的y截距。圆圈1010是用于各种输入浓度的测量的达到阈值的时间。直线1020表示通过线性回归拟合获得的标准曲线。水平虚线1030指示y截距(例如，如等式(1)或等式(2)所表示的标准曲线中的“b”的值)。因此，在一些实施方案中，如果测量的达到阈值的时间Tt落在水平虚线930之下，则可以认为等温扩增是成功的。

在实验中，在96孔板上，48个孔中的每一个填充有10μL的测试样品的相应第一等分试样，并且其他48个孔中的每一个填充有50μL的测试样品的相应第二等分试样。第一等分试样和第二等分试样具有相同的模板浓度。

图11显示了qLAMP测定的实验结果。黑色圆圈表示对于20-μL反应体积测得的达到阈值的时间Tt；灰色圆圈表示对于50-μL反应体积测得的达到阈值的时间Tt。该插图显示了在20和40个时间周期(每个20秒)之间的达到阈值的时间范围的放大版本。虚线水平线表示预定的截止Tt值，如上所述。如图所示，较高体积的反应显示较早的达到阈值的时间和较高的成功率。

实验证明，对于分布在给定体积中的固定数量的模板分子，如果固定数量接近线性动态范围的下端，则询问较大的体积部分将具有产生精确(线性)测量的较高概率。因此，使用较大的孔体积来测定低丰度生物标志物物可以改善线性动态范围，从而扩展可以用该测定成功运行的样品的数量。

应当理解，在此描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物，专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。