用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法及试剂组合

摘要

本发明公开了用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法包括：收集患者的浆膜腔积液；在浆膜腔积液中加入一定剂量的红细胞裂解液，混匀得到待检测浆膜腔积液；在设定环境下将待检测浆膜腔积液初次离心作用至设定时长；向离心作用后的待检测浆膜腔积液中加入样本稀释液，重悬沉淀成单细胞悬液并计数；在离心管中加入淋巴细胞分离液，将单细胞悬液置于淋巴细胞分离液层面之上，再次离心作用至设定时长后弃上清留沉淀；提取沉淀物质的RNA并检测各项指标的表达水平；取若干病理组织切片，提取病理组织切片的RNA并检测各项指标的表达水平；将沉淀物质与病理组织切片各项指标的表达水平进行逐一对应比较，确定是否进行重组人血管内皮抑素胸腔的注射治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及浆膜腔积液治疗措施，更具体地说是用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法及试剂组合。

背景技术

恶性浆膜腔积液是晚期恶性肿瘤常见的并发症，主要包括恶性腹腔积液、恶性胸腔积液和恶性心包积液等，最常见于消化道恶性肿瘤、妇科肿瘤、肺癌和乳腺癌等。如，在肺癌患者中约20％并发有恶性胸腔积液(Malignant pleural effusion，MPE)，并且肺腺癌是形成胸腔积液的主要病理类型，并考虑与恶性肿瘤新生血管生成相关，常规的治疗方法难以起效，治疗效果较差，此类患者往往处于疾病的终末期，生存期较短，一般维持时间约为4-6个月。恶性浆膜腔积液的临床处理较为困难和棘手，肿瘤大小，浆膜腔积液量，积液增长速度以及生存期密切相关。因此，在针对恶性浆膜腔积液的治疗中的主要目的在于改善患者的生活质量，延长生存期。

近年来，针对浆膜腔积液的治疗大多采用多手段的综合治疗措施，包括局部化疗药物的个体化优选，生物治疗的序贯治疗，局部热疗以及放射治疗等措施，均显示了较好的治疗疗效。因此，寻求更好的治疗恶性浆膜腔积液的治疗方法始终是目前恶性浆膜腔积液治疗的主要内容。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法及试剂组合。

本发明采用以下技术方案：一种用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法，包括以下步骤：

(a)收集患者的浆膜腔积液；

(b)在浆膜腔积液中加入一定剂量的红细胞裂解液，吹打混匀，得到待检测浆膜腔积液；

(c)在设定环境下将待检测浆膜腔积液初次离心作用至设定时长；

(d)向离心作用后的待检测浆膜腔积液中加入样本稀释液，重悬沉淀成单细胞悬液，对单细胞悬液进行计数；

(e)在离心管中先加入若干淋巴细胞分离液，后将单细胞悬液置于淋巴细胞分离液层面之上，在设定环境下再次离心作用至设定时长后弃上清留沉淀；

(f)提取沉淀物质的RNA并检测RNA内各项指标的表达水平；

(g)取若干病理组织切片，提取病理组织切片的RNA并检测RNA内各项指标的表达水平；

(h)将沉淀物质的RNA内各项指标的表达水平与病理组织切片的RNA内各项指标的表达水平进行逐一对应比较，以确定是否进行重组人血管内皮抑素胸腔的注射治疗。

其进一步技术方案为，所述步骤(a)之前还包括步骤(i)治疗前将浆膜腔穿刺，尽可能放尽患者的浆膜腔积液。

其进一步技术方案为，所述步骤(b)在浆膜腔积液中加入一定剂量的红细胞裂解液，吹打混匀，得到待检测浆膜腔积液进一步包括：在浆膜腔积液中加入5-8倍体积的4℃预冷的红细胞裂解液。

其进一步技术方案为，所述步骤(c)在设定环境下将待检测浆膜腔积液初次离心作用至设定时长进一步包括：取300g待检测浆膜腔积液，在4℃环境下离心作用5min。

其进一步技术方案为，所述步骤(d)向离心作用后的待检测浆膜腔积液中加入样本稀释液，重悬沉淀成单细胞悬液，对单细胞悬液进行计数中的所述样本稀释液为，2mL含有80％的胎牛血清样本稀释液，所述胎牛血清样本稀释液调节浓度为1x108个/mL。

其进一步技术方案为，所述步骤(e)在离心管中先加入若干淋巴细胞分离液，后将单细胞悬液置于淋巴细胞分离液层面之上，在设定环境下再次离心作用至设定时长后弃上清留沉淀进一步包括：取15mL离心管，先加入5mL的淋巴细胞分离液，后将5mL单细胞悬液沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，在20℃环境下通过垂直离心机离心作用20min后，弃上清留沉淀。

其进一步技术方案为，所述步骤(f)提取沉淀物质的RNA并检测RNA内各项指标的表达水平中所述各项指标包括：VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1a、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bcl-xl RNA表达水平指标。

本发明还提供了一种用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的试剂组合，适用于前述的用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法，所述试剂组合包括红细胞裂解液、胎牛血清样本稀释液和淋巴细胞分离液。

本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明提供的用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法及试剂组合，通过腹水中非血细胞检测相关基因的表达，且区别于常规检测方法中对比样本为正常人群样本，本发明所提供的方法中选用的对比样本为患者自身样本，更有效地提升了对比样本的可信度，且排除了腹水中血细胞的干扰，精确地检测浆膜腔积液中恶性细胞的相关基因表达情况以利于后续针对性地选择相应的治疗方案。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明技术手段，可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征及优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

图1为本发明的用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行结合和组合。

浆膜腔是浆膜壁层和脏层之间的间隙，分为胸膜腔、腹膜腔、心包腔等。腔内有少许浆液，起润滑作用，病理情况下可增多，形成胸水、腹水、心包积液等。临床送检的浆膜腔积液均属于病理性，浆膜腔积液内的细胞成分包括间皮细胞、非上皮来源的血液细胞，还可能存在肿瘤细胞。良性病变(如肺炎、肺梗死、流感、肝脓肿、结核病、心衰等等)或恶性病变(肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、恶性间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、消化系统肿瘤等等)都可以引起浆膜腔积液。

实施例中所用血管内皮生长因子受体抑制剂均为重组人血管内皮抑素注射液(Endostar)，规格：15mg/支，购自烟台麦得津生物工程股份有限公司，于4℃保存。红细胞裂解液、淋巴细胞分离液购自天津灏阳生物有限公司，PCR试剂购自Takara公司。引物序列如下表所示：

患者情况简介：2018年深圳市罗湖区人民医院患者一例，患者女，55岁，诊断子宫内膜癌，已行子宫内膜癌根治术，1年前发现双肺多发转移，2月前患者出现心悸，活动后气促，CT提示右侧大量胸腔积液，超声定位后，行胸腔穿刺置管。

请参阅附图1，采用本发明提供的用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法进行治疗前预测：

S100治疗前将浆膜腔穿刺，尽可能放尽患者的浆膜腔积液。

治疗前尽可能放尽胸腔积液，引流出患者血性胸腔积液3250ml，收集患者胸腔积液及病理标本，行胸水常规化验。

S101收集患者的浆膜腔积液；

S102在浆膜腔积液中加入一定剂量的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，得到待检测浆膜腔积液；

收集患者浆膜腔积液50ml，加入400ml的4℃预冷的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀。

S103在设定环境下将待检测浆膜腔积液初次离心作用至设定时长；

S104向离心作用后的待检测浆膜腔积液中加入样本稀释液，重悬沉淀成单细胞悬液，对单细胞悬液进行计数；

4℃环境条件下，取300g试剂离心作用5min，再用2mL含有80％的胎牛血清样本稀释液重悬沉淀成单细胞悬液，计数，使用样本稀释液调节浓度为1x108个/mL。

S105在离心管中先加入若干淋巴细胞分离液，后将单细胞悬液置于淋巴细胞分离液层面之上，在设定环境下再次离心作用至设定时长后弃上清留沉淀；

取15mL离心管，先加入5mL的淋巴细胞分离液，后将5mL上步重悬液沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，500g 20℃垂直离心机内离心20min，弃上清留沉淀。

S106提取沉淀物质的RNA并检测RNA内各项指标的表达水平；

提取沉淀物质的RNA，检测VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1a、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bcl-xlRNA表达水平等指标。

S107取若干病理组织切片，提取病理组织切片的RNA并检测RNA内各项指标的表达水平；

取5mg病理组织切片，提取其RNA，检测VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1a、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bcl-xlRNA表达水平等指标。

S108将沉淀物质的RNA内各项指标的表达水平与病理组织切片的RNA内各项指标的表达水平进行逐一对应比较，以确定是否进行重组人血管内皮抑素胸腔的注射治疗。

将沉淀物质的RNA内各项指标的表达水平与病理组织切片的RNA内各项指标的表达水平进行逐一对应比较后得到的检测结果显示，患者胸水肿瘤细胞较病理组织中表达明显增高，遂行重组人血管内皮抑素胸腔注射治疗。

患者经过重组人血管内皮抑素胸腔注射治疗后，患者胸腔治疗期间胸水常规化验指标中红细胞变化如下表所示：

根据敏感性预测结果可知，患者浆膜腔积液治疗为血管内皮生长因子受体抑制剂敏感性，遂行重组人血管内皮抑素治疗后患者胸水量明显减少，胸水中红细胞数量明显减少，表明治疗产生实际效果。

与现有技术相比，本实施例的用于预测对重组人血管内皮抑素敏感性的方法及试剂组合，通过腹水中非血细胞检测相关基因的表达，且区别于常规检测方法中对比样本为正常人群样本，本发明所提供的方法中选用的对比样本为患者自身样本，更有效地提升了对比样本的可信度，且排除了腹水中血细胞的干扰，精确地检测浆膜腔积液中恶性细胞的相关基因表达情况以利于后续针对性地选择相应的治疗方案，使患者避免进一步遭受创伤的前提下，预测对重组人血管内皮抑素敏感性，明确是否会产生目标治疗效果，以减少患者身体创伤和节省不必要的开支。

上述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。本发明的保护范围以权利要求书为准。