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检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用

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本发明公开了检测人Y‑STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包括50对Y‑STR基因座的特异性扩增引物。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述试剂盒采用人类Y染色体上的50对极低突变的STR基因座，其具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，能满足男性罪犯个体识别、亲子鉴定、DNA家谱构建、家系排查的需求等；(2)所述试剂盒可实现2小时内快速批量检测90个样本，且每个样本检测50个Y‑STR基因座；而且整个操作和结果分析方法完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR‑毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握。

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公开/公告号CN112609005A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-06

原文格式PDF
申请/专利权人无锡中德美联生物技术有限公司;
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申请/专利号CN202011496994.2
发明设计人李娟;梅兴林;史明皓;郑卫国;
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申请日2020-12-17
分类号C12Q1/6888(20180101);C12N15/11(20060101);
代理机构32200 南京经纬专利商标代理有限公司;
代理人余俊杰
地址 214174 江苏省无锡市惠山区文惠路18-1
入库时间 2023-06-19 10:30:40

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，涉及一种检测极低突变Y-STR基因座的复合扩增检测试剂盒，具体为检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术

Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。

法医学上将突变率高于1％的基因座称为快速突变基因座(Rapidly Mutating Y-STR)。快速突变基因座具有高突变率的特性，突变率多在1×10

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，适应当前案件现场的复杂性，提供一种抗干扰能力强，灵敏度高，为破案提供线索与证据，满足刑侦快速、高效的工作需求的试剂盒，本发明提供了检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用。

技术方案：检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括50对Y-STR基因座的特异性扩增引物，其中Y-STR基因座为：DYS618、DYS640、DYS497、DYS567、DYS590、DYF390S1、DYS502、DYS615、DYS621、DYF381S2、DYF380S1、DYS545、DYS559、DYS595、DYS536、DYS478、DYS577、DYF405S1、DYS642、DYS625、DYF382S1、DYS436、DYS550、DYS453、DYS494、DYS641、DYS477、DYS480、DYS575、DYS474、DYS588、DYS499、DYS530、DYS538、DYS512、DYS558、DYS485、DYS580、DYS624、DYS491、DYS573、DYS473、DYS571、DYS475、DYS470、DYS634、DYS455、DYS613、DYS488、DYS472。

优选的，所述50对Y-STR基因座的特异性扩增引物序列如下：DYS618、SEQ IDNO.1-2；DYS640、SEQ ID NO.3-4；DYS497、SEQ ID NO.5-6；DYS567、SEQ ID NO.7-8；DYS590、SEQ ID NO.9-10；DYF390S1、SEQ ID NO.11-12；DYS502、SEQ ID NO.13-14；DYS615、SEQ IDNO.15-16；DYS621、SEQ ID NO.17-18；DYF381S2、SEQ ID NO.19-20；DYF380S1、SEQ IDNO.21-22；DYS545、SEQ ID NO.23-24；DYS559、SEQ ID NO.25-26；DYS595、SEQ ID NO.27-28；DYS536、SEQ ID NO.29-30；DYS478、SEQ ID NO.31-32；DYS577、SEQ ID NO.33-34；DYF405S1、SEQ ID NO.35-36；DYS642、SEQ ID NO.37-38；DYS625、SEQ ID NO.39-40；DYF382S1、SEQ ID NO.41-42；DYS436、SEQ ID NO.43-44；DYS550、SEQ ID NO.45-46；DYS453、SEQ ID NO.47-48；DYS494、SEQ ID NO.49-50；DYS641、SEQ ID NO.51-52；DYS477、SEQ ID NO.53-54；DYS480、SEQ ID NO.55-56；DYS575、SEQ ID NO.57-58；DYS474、SEQ IDNO.59-60；DYS588、SEQ ID NO.61-62；DYS499、SEQ ID NO.63-64；DYS530、SEQ ID NO.65-66；DYS538、SEQ ID NO.67-68；DYS512、SEQ ID NO.69-70；DYS558、SEQ ID NO.71-72；DYS485、SEQ ID NO.73-74；DYS580、SEQ ID NO.75-76；DYS624、SEQ ID NO.77-78；DYS491、SEQ ID NO.79-80；DYS573、SEQ ID NO.81-82；DYS473、SEQ ID NO.83-84；DYS571、SEQ IDNO.85-86；DYS475、SEQ ID NO.87-88；DYS470、SEQ ID NO.89-90；DYS634、SEQ ID NO.91-92；DYS455、SEQ ID NO.93-94；DYS613、SEQ ID NO.95-96；DYS488、SEQ ID NO.97-98；DYS472、SEQ ID NO.99-100。

优选的，所述50对Y-STR基因座的特异性扩增引物的浓度如下：DYS618、0.15μM；DYS640、0.15μM；DYS497、0.12μM；DYS567、0.15μM；DYS590、0.15μM；DYF390S1、0.1μM；DYS502、0.1μM；DYS615、0.1μM；DYS621、0.1μM；DYF381S2、0.2μM；DYF380S1、0.2μM；DYS545、0.1μM；DYS559、0.1μM；DYS595、0.1μM；DYS536、0.1μM；DYS478、0.2μM；DYS577、0.12μM；DYF405S1、0.12μM；DYS642、0.08μM；DYS625、0.1μM；DYF382S1、0.1μM；DYS436、0.15μM；DYS550、0.15μM；DYS453、0.1μM；DYS494、0.12μM；DYS641、0.12μM；DYS477、0.12μM；DYS480、0.15μM；DYS575、0.15μM；DYS474、0.08μM；DYS588、0.12μM；DYS499、0.2μM；DYS530、0.1μM；DYS538、0.2μM；DYS512、0.2μM；DYS558、0.2μM；DYS485、0.2μM；DYS580、0.2μM；DYS624、0.15μM；DYS491、0.1μM；DYS573、0.1μM；DYS473、0.15μM；DYS571、0.12μM；DYS475、0.12μM；DYS470、0.15μM；DYS634、0.1μM；DYS455、0.15μM；DYS613、0.2μM；DYS488、0.12μM；DYS472、0.18μM。

表1 50对特异性扩增引物序列信息

优选的，所述50对Y-STR基因座的特异性扩增引物分为5组：第1组，DYS618、DYS640、DYS497、DYS567、DYS590、DYF390S1、DYS502、DYS615、DYS621、DYF381S2；第2组，DYF380S1、DYS545、DYS559、DYS595、DYS536、DYS478、DYS577、DYF405S1、DYS642、DYS625；第3组，DYF382S1、DYS436、DYS550、DYS453、DYS494、DYS641、DYS477、DYS480、DYS575、DYS474；第4组，DYS588、DYS499、DYS530、DYS538、DYS512、DYS558、DYS485、DYS580、DYS624、DYS491、DYS573；第5组，DYS473、DYS571、DYS475、DYS470、DYS634、DYS455、DYS613、DYS488、DYS472；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。

优选的，所述荧光染料为AMC、FITC、PE、ALEX或TRUR，且每组采用的荧光标记不同。

优选的，第1组荧光染料为AMC，第2组荧光染料为FITC，第3组荧光染料为PE，第4组荧光染料为ALEX，第5组荧光染料为TRUR。

优选的，所述试剂盒包括复合扩增体系，体系包括A-Reaction Mix和sdH

优选的，所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性20秒，60℃退火90秒，共30个循环；最后72℃终延伸20分钟。以上扩增产物无需处理，直接采用法医领域常用的毛细管电泳检测即可获得结果。

以上任一所述检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒在法医鉴定、男性个体识别、DNA家谱构建或家系排查中的应用。

有益效果：(1)本发明所述试剂盒采用人类Y染色体上的50对极低突变的STR基因座，其具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，能满足男性罪犯个体识别、亲子鉴定、DNA家谱构建、家系排查的需求等；(2)所述试剂盒可实现2小时内快速批量检测90个样本，且每个样本检测50个Y-STR基因座；而且整个操作和结果分析方法完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR-毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握。

附图说明

图1是本发明所述试剂盒的基因座排布图；

图2是实施例2所述样本血斑直接扩增分型图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1. 50个极低突变Y-STR基因座的筛选。

通过对DYS618、DYS640、DYS497、DYS567、DYS590、DYS579、DYF390S1、DYS615、DYS621、DYF381S2、DYF380S1、DYS545、DYS619、DYS559、DYS595、DYS536、DYS478、DYS577、DYF405S1、DYS502、DYS642、DYS625、DYF382S1、DYS388、DYS426、DYS435、DYS436、DYS581、DYS550、DYS453、DYS494、DYS584、DYS641、DYS477、DYS480、DYS575、DYS474、DYS588、DYS499、DYS448、DYS530、DYS538、DYS512、DYS558、DYS583、DYS434、DYS485、DYS580、DYS624、DYS491、DYS573、DYS473、DYS571、DYS475、DYS470、DYS634、DYS455、DYS613、DYS488、DYS472、DYS489、DYS454、DYS476、DYS554、DYS561、DYS521、DYS574、DYS631、DYS525和DYS578共70个Y染色体STR基因座的基因多态性和突变率的研究，最后筛选出DYS618、DYS640、DYS497、DYS567、DYS590、DYF390S1、DYS502、DYS615、DYS621、DYF381S2、DYF380S1、DYS545、DYS559、DYS595、DYS536、DYS478、DYS577、DYF405S1、DYS642、DYS625、DYF382S1、DYS436、DYS550、DYS453、DYS494、DYS641、DYS477、DYS480、DYS575、DYS474、DYS588、DYS499、DYS530、DYS538、DYS512、DYS558、DYS485、DYS580、DYS624、DYS491、DYS573、DYS473、DYS571、DYS475、DYS470、DYS634、DYS455、DYS613、DYS488、DYS472共50个极低突变的Y染色体STR基因座。

2. 50个Y染色体极低突变STR基因座排布

根据以上50个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：DYS618、DYS640、DYS497、DYS567、DYS590、DYF390S1、DYS502、DYS615、DYS621、DYF381S2为第1组，荧光染料标记物为AMC；DYF380S1、DYS545、DYS559、DYS595、DYS536、DYS478、DYS577、DYF405S1、DYS642、DYS625为第2组，荧光染料标记物为FITC；DYF382S1、DYS436、DYS550、DYS453、DYS494、DYS641、DYS477、DYS480、DYS575、DYS474为第3组，荧光染料标记物为PE；DYS588、DYS499、DYS530、DYS538、DYS512、DYS558、DYS485、DYS580、DYS624、DYS491、DYS573为第4组，荧光染料标记物为ALEX，DYS473、DYS571、DYS475、DYS470、DYS634、DYS455、DYS613、DYS488、DYS472为第5组，荧光染料标记为TRUR；基因座排布如图1。

实施例2

1.PCR反应buffer和扩增程序调节

(1)PCR反应的buffer(即A-Reaction Mix)包含扩增反应所必须的各种离子和dNTP混合物，根据PCR需要还可以添加一些特异性PCR增强剂。但是为了能够提高PCR反应的扩增特异性、扩增效率以及抗干扰能力，需要对以上各种组分进行浓度的优化。

本发明试剂盒中PCR反应buffer包含的组分优化的浓度范围如下表。

(2)PCR扩增程序和普通PCR不一样，在于无需延伸步骤。具体扩增程序为：

2.扩增反应体系及数据分析。

本试剂盒中扩增体系组分及含量见下表：

1μL PCR产物，9.5μL去离子甲酰胺和0.5μL AGCU SIZ-500，混匀，95℃3min并立即冰浴3min。使用3500XL型基因分析仪以1.2kv，28s的进样模式进行电泳，整个电泳时间30-40min。电泳数据通过GeneMapper IDX v 1.4分析软件进行等位基因分型。标准血卡直扩检测结果如图2所示。

实施例3不同家系男性个体样本测试

选取两个不同家系男性个体样本，按实施例4提供的方法进行扩增产物分析，结果如下表：

结果显示，两个样本在Y37只差4步，可能不是一个家系，经过Y50检测显示，50个位点的分型相同，实属同一家系。高突变的基因座就可能导致误判排除。Y50低突变基因座可以作为强有力的支持。也证明本试剂盒有家系区分的能力。试剂盒完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR-毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握；同时，本试剂盒优选特异性好、抗干扰强的复合扩增引物，可实现样本检测免提取直接扩增。

序列表

<110> 无锡中德美联生物技术有限公司

<120> 检测人Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用

<160> 100

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA