技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)属胡麻科胡麻属，是古老的油料作物之一，主要种植在亚洲、非洲的热带和亚热带地区。我国是世界芝麻生产、消费和贸易大国，种植面积和产量居世界首位。芝麻在我国种植范围广泛，其中河南、湖北、安徽、江西是我国最主要的芝麻种植区，种植面积超过全国的70％。本世纪以来，受机械化程度低、产量波动大、经济效益少、种植结构调整和环境等因素影响，我国芝麻种植面积呈震荡下行态势。
芝麻作为一种传统的食物，因其丰富的营养价值和独特的风味儿，备受人们的喜爱。芝麻籽粒的含油量平均在50％左右，蛋白质含量25％左右，富含不饱和脂肪酸、维生素E及钙、镁等矿物质成分，尤其含有芝麻素、芝麻林素等抗氧化功能性成分。芝麻素和芝麻林素是主要的木脂素成分。其中芝麻素最早在1890年由日本学者从芝麻油精炼过程中获得。随后，大量研究证实芝麻素和芝麻林素在保护肝脏、降血糖、降血压、消炎抗肿、抗雌激素、治疗帕金森(PD)等方面发挥着积极的作用。高芝麻素、芝麻林素含量的芝麻品种，成为食品、保健、医药、化工等多个行业的重要需求。
尽管芝麻具有很高的药理意义和营养价值，但很少有报道描述芝麻芝麻素和芝麻林素生物合成调控的遗传基础。近年来，随着人们对高品质芝麻的需求，育种家们的焦点也逐渐从含油量、千粒重等产量性状转移到提高芝麻品质性状(蛋白质、木脂素、甾醇、脂肪酸)的目标中来。世界上多个国家包括日本、韩国、中国等都把培育高芝麻素、芝麻林素含量的品种作为育种目标之一。
我国芝麻种质资源库目前已收集保存8000多份不同来源的材料(杨文娟等，2018)，但对这些材料芝麻素含量的分析还比较少，发掘出的高芝麻素含量材料还难以满足育种需求。与产量等复杂的农艺性状相似，含油量、蛋白质含量、芝麻素含量等品质性状也是典型的受多基因控制的数量性状。利用分子标记技术开展数量性状位点(Quantitativetrait locus,QTL)遗传定位及分子标记辅助育种被证明是解决作物产量、品质等复杂性状遗传改良的有效手段。因此，本发明在精细定位芝麻芝麻素含量主效基因位点的基础上，开发获得与其紧密连锁的分子标记，用于芝麻育种过程中较高芝麻素后代的分子辅助选择。
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点qSmin11-1。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种与芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM1776及其引物。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种上述芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点的分子标记鉴定方法。
本发明所要解决的技术问题之四是提供一种上述所述的分子标记ZMM1776的引物在芝麻育种过程中较高芝麻素含量后代的筛选及早期预测中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
提供一种与芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM1776引物，引物序列为：
ZMM1776F：5’-GCACACATGGGCTGCTACTA-3’
ZMM1776R：5’-TCGTTTGAAACTTGTCCGAA-3’
上述与芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点紧密连锁的分子标记的鉴定方法，用ZMM1776F和ZMM1776R扩增芝麻叶片或其他组织总DNA，如果扩增获得168bp的扩增片段时，则表明存在本发明所述的较高芝麻素含量的主效基因位点，预测该芝麻籽粒芝麻素含量较高。
上述与芝麻芝麻素含量主效基因位点qSmin11-1紧密连锁的分子标记引物ZMM1776在芝麻育种后代芝麻素含量筛选及早期预测中的应用。
按上述方案，所述与芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点qSmin11-1紧密连锁的分子标记ZMM1776在芝麻育种后代芝麻素含量筛选及早期预测中的应用，具体应用方法为：用所述分子标记ZMM1776的引物扩增芝麻育种后代叶片或其他组织总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得168bp的扩增片段，则预测该芝麻含有较高芝麻素含量的主效基因位点，说明该芝麻籽粒芝麻素含量较高。
本发明所述的芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点是通过以下步骤筛选的：
(1)利用芝麻素含量差异显著的两个芝麻品种中芝13(芝麻素4.38mg/g)和ZZM2748(芝麻素0.86mg/g)进行杂交，获得F
(2)提取亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA；
(3)利用自主设计开发的SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
(4)将筛选得到的多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析，构建遗传连锁图谱，结合芝麻素含量的表型数据进行QTL定位，检测到芝麻第11号连锁群一个主效基因位点qSmin11-1，可解释芝麻素表型67.69％的变异，与其紧密连锁(遗传距离0.21cM)的分子标记为SSR标记ZMM1776，其引物序列为：
ZMM1776F：5’-GCACACATGGGCTGCTACTA-3’
ZMM1776R：5’-TCGTTTGAAACTTGTCCGAA-3’
本发明的优点在于：
本发明首次定位了1个调控芝麻籽粒芝麻素含量变异的主效基因位点qSmin11-1，可解释芝麻素表型67.69％的变异，同时发现了一个与该主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM1776，使得芝麻芝麻素含量主效基因位点的定位工作居于同领域前列。
本发明提供的芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点的分子标记鉴定方法，可以预测芝麻芝麻素含量的高低，进而可以快速筛选较高芝麻素含量材料或株系，用于芝麻育种过程中较高芝麻素后代的筛选，辅助芝麻素含量育种选择，目标明确，成本较低。传统育种方法中，芝麻籽粒芝麻素含量受环境和群体密度影响较大，准确性低。本发明中芝麻素含量主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响，可以在收获前进行早期筛选和淘汰，大大提高了选择效率，节约了生产成本。
附图说明
图1为芝麻(中芝13×ZZM2748)RIL群体芝麻素含量的分布图。
图2为连锁群图谱。图中星号所示为芝麻素含量主效基因位点qSmin11-1在连锁群上的位置，与其紧密连锁的分子标记为ZMM1776。
图3为分子标记ZMM1776的引物在(中芝13×ZZM2748)RIL群体亲本及34个株系中扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1595-2008《芝麻中芝麻素含量的测定高效液相色谱法》(李培武等，中华人民共和国农业部发布，2008)的方法鉴定芝麻籽粒芝麻素含量，用于比较分析不同材料芝麻素含量差异，参照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1芝麻籽粒芝麻素含量主效基因位点的发掘
(1)构建高低芝麻素含量芝麻重组自交系(RIL)群体并鉴定其籽粒芝麻素含量大小
利用芝麻素含量差异显著的两个芝麻品种中芝13(芝麻素4.38mg/g)和ZZM2748(芝麻素0.86mg/g)进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F8代分离群体，即重组自交系(RIL)群体。
在湖北武汉阳逻种植该群体，植株成熟后，收获亲本及RIL各株系的芝麻种子，每个株系收获的种子混合后用来测定芝麻素含量。结果见图1，统计分析表明芝麻籽粒芝麻素含量变异呈连续性双峰分布，说明芝麻芝麻素含量属于数量性状。
(2)亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA的提取
利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.将各亲本及RIL分离群体叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-70℃)取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，0.1MTris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；
D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。
(3)引物的开发及多态性的筛选
根据芝麻基因组序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)在开发SSR引物。SSR引物具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffiold搜索SSR，然后用Primer5.0软件设计SSR引物。共设计了8550对SSR引物，在此基础上，对这些引物进行亲本间多态性筛选。筛选结果表明，有525对引物在双亲间有差异，多态率为5.9％。多态性筛选程序如下：
A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。
B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：
PCR(聚合酶链式反应)体系：
PCR(聚合酶链式反应)扩增程序：
(4)PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果
将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：
胶板制备：
玻璃板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用无尘纸巾均匀涂抹硅烷化剂(AMMRESCO)，长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。
反硅烷化剂：500ml稀释液(95％无水乙醇，0.5％冰醋酸，4.5％ddH2O)中加1-2ml亲和硅烷；
6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液:5.7％(质量比)丙烯酰胺，0.3％(质量比)N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42％(质量比)尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10％(质量比)过硫酸铵390ul和TEMED 39ul。
电泳：
去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。
1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；
上样缓冲液：98％(体积比)去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％(质量比)二甲苯青FF，0.005％(质量比)溴酚蓝。
银染法染色：
将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液(含0.15％的AgNO3)中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液(含0.2％的NaOH，0.04％的甲醛，35℃)中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。
(5)上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析及芝麻籽粒芝麻素含量基因位点定位
将上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色及带型统计(父本带型统计为a，母本带型统计为b)，得到群体基因型数据，根据连锁交换规律，利用软件Joinmap3.0构建遗传连锁图谱(图2为第11号连锁群图谱)，最小LOD值设为2.5。然后利用RIL群体的548个株系的芝麻素含量的表型数据、基因型数据及遗传连锁图谱数据，以Windows QTL Cartographer 2.5软件的为主，QTL IciMapping version 4.1测得的结果作为辅助参考，两个软件均采取复合区间作图法(Composite Interval Mapping,CIM)，进行基因定位分析。结果在第11号连锁群上定位到影响芝麻籽粒芝麻素含量高低的主效基因位点qSmin11-1，可解释芝麻素表型67.69％的变异(即贡献率67.69％)。该位点来自于较高芝麻素含量品种中芝13的等位基因具有增加芝麻素含量的效应，与其紧密连锁(遗传距离0.21cM)的分子标记为SSR标记ZMM1776，其引物序列为：
ZMM1776F：5’-GCACACATGGGCTGCTACTA-3’
ZMM1776R：5’-TCGTTTGAAACTTGTCCGAA-3’
实施例2上述主效基因位点qSmin11-1紧密连锁的分子标记ZMM1776的引物在芝麻育种后代籽粒芝麻素含量筛选及早期预测中的应用
利用芝麻素含量差异显著的两个芝麻品种中芝16(芝麻素4.91mg/g)和ZZM2748(芝麻素0.86mg/g)杂交后构建包含548个株系的RIL群体(F
表1分子标记辅助选择得到的芝麻素含量高于群体均值的202个株系
机译： 适用于增强水稻籽粒多糖多肽，米糠的第一提取物和芝麻素的第二提取物的伤口愈合的组合物
机译： 芝麻素类化合物含量高的组合物
机译： 芝麻素含量高的成分
