本申请要求于2018年8月23日提交的美国临时申请序列号62/721,884的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及包含一种或多种抗脂肪酶表面活性剂的治疗性蛋白质的药物制剂。本发明还涉及减少包含治疗性蛋白质的药物制剂中的聚集体和/或颗粒形成并且延长此类药物制剂的储存寿命的方法。
背景技术
在大分子制剂中包含表面活性剂是稳定生物分子、防止粘附到表面、避免空气-水界面处的转换、防止表面诱发的变性以及限制原本会导致聚集的自缔合事件的常用策略。蛋白质聚集可在药物加工、长期储存、运输和施用期间发生。然而，已证实添加表面活性剂可使可在过滤、搅拌、冻-融、冻干、重构、施用和储存期间影响蛋白质的界面相互作用最小化。目前，制药工业在大分子商业制剂中使用的主要表面活性剂是聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80)。这些表面活性剂中的每种表面活性剂均具有它们的优点，例如，它们减少界面处的蛋白质自缔合并防止蛋白质聚集。然而，使用这些表面活性剂的主要缺点涉及它们的氧化降解(Kerwin BA，“Polysorbates 20 and 80 Used in theFormulation of Protein Biotherapeutics:Structure and Degradation Pathways”，J.Pharm.Sci.97(8):2924-35(2008年)，该文献据此全文以引用方式并入)和催化降解(LaBrenz SR，“Ester Hydrolysis of Polysorbate 80in mAb Drug Product:Evidencein Support ofthe Hypothesized Risk After the Observation of VisibleParticulate in mAb Formulations”，J.Pharm.Sci.，103:2268-2277(2014年)，该文献据此全文以引用方式并入)，这继而不利地影响大分子制剂的稳定性和储存寿命。
可通过与抗氧化剂(例如，甲硫氨酸)或与色氨酸共配制来减轻蛋白质制剂中聚山梨醇酯的氧化降解(参见例如授予Alavattam等人的美国专利申请公布号2014/0322203)。然而，聚山梨醇酯的酶促降解被归因于宿主细胞脂肪酶和酯酶的存在(LaBrenz SR，“EsterHydrolysis of Polysorbate 80 in mAb Drug Product:Evidence in Support of theHypothesized Risk After the Observation of Visible Particulate in mAbFormulations”，J.Pharm.Sci.,103:2268-2277(2014年))，其仍然是生物制药开发的重大挑战。虽然存在用于去除宿主细胞蛋白质(HCP)的纯化方法，但是此类方法通常不足以去除所有HCP，并且它们在制造水平上的实施通常成本过高。因此，痕量的某些宿主细胞蛋白质(包括一些脂肪酶)通常保留在生物制药产品中(Chiu等人，“Knockout of a Difficult-to-Remove CHO Host Cell Protein,Lipoprotein Lipase,for Improved PolysorbateStability in Monoclonal Antibody Formulations”，Biotech.Bioeng.114(5):1006-1015(2017年))。因此，本领域需要找到具有聚山梨醇酯表面活性剂的有利特性而没有与降解相关的一些缺点的表面活性剂，即，该表面活性剂能够有效防止蛋白质聚集和蛋白质转换，但对宿主细胞蛋白质介导的降解具有抗性。
本发明涉及克服本领域中与大分子制剂中宿主细胞蛋白质介导的表面活性剂降解相关的缺陷。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种药物制剂。本发明的药物制剂包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质、药学上可接受的载体和一种或多种聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂，其中该一种或多种PFA表面活性剂对脂肪酶降解具有抗性。
本发明的另一方面涉及一种减少包含生物组合物的药物制剂中的聚集体和/或颗粒形成的方法。该方法涉及提供生物组合物，其中生物组合物包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质；以及在该生物组合物中掺入一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂作为聚山梨醇酯表面活性剂的替代物。
本发明的另一方面涉及一种延长包含生物组合物的药物制剂的储存寿命的方法。该方法涉及提供生物组合物，其中生物组合物包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质；以及在该生物组合物中掺入一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂作为聚山梨醇酯表面活性剂的替代物。
本发明的另一方面涉及一种制备具有稳定表面活性剂浓度的药学上可接受的治疗性蛋白质制剂的方法。该方法涉及提供药学上可接受的治疗性蛋白质组合物，以及将一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂掺入该治疗性蛋白质组合物中，从而制备药学上可接受的治疗制剂，该治疗制剂具有在制剂的储存寿命内保持稳定的表面活性剂浓度。
聚山梨醇酯目前是制药工业使用的标准表面活性剂。然而，聚山梨醇酯的降解可由于残余的宿主细胞蛋白质杂质(即脂肪酶)而在大分子制剂中发生。完整聚山梨醇酯水平随时间推移的降低连同聚山梨醇酯降解物颗粒(例如，游离脂肪酸)和大分子不稳定聚山梨醇酯降解物的形成导致制剂不稳定性、缩短的药物产品储存寿命、更长的开发时间以及更频繁的制造活动，所有这些都减少了患者对治疗分子的接触。如本文所示，出乎意料地发现，聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂与它们的配对聚山梨醇酯表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)相同地并且在一些情况下更好地起到稳定生物治疗剂的作用。与聚山梨醇酯表面活性剂不同，PFA对宿主细胞脂肪酶引起的降解具有抗性；因此，PFA表面活性剂的浓度随时间推移在制剂中保持稳定，并且能够保护制剂的治疗性分子以免聚集和颗粒形成。因此，当表面活性剂暴露于脂肪酶时，该治疗性分子制剂的稳定性与对应的含有聚山梨醇酯表面活性剂的治疗性分子制剂相比显著提高。
附图说明
图1A至图1C是示出聚山梨醇酯表面活性剂(即，聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80))和聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂(即，
图2是示出在18天的过程中暴露于固定在小珠上的脂肪酶的储备溶液中的表面活性剂水平(％w/v)的图。完整的聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(80)的水平在暴露过程中显著下降，而PFA表面活性剂(即，
图3A至图3C是示出通过SEC评估的在表面活性剂暴露于脂肪酶后聚山梨醇酯和PFA表面活性剂在三种不同抗体制剂中的保护作用的图。基于在T0处(白色条)、在振摇应力后(于环境温度以250RPM振摇72小时)(灰色条)以及在热应力后(于25℃温育3个月，然后经受以250RPM振摇72小时的应力)(黑色条)每种制剂中存在的单体百分比评估抗体稳定性。所测试的三种抗体制剂包括双特异性mAb A(图3A)、双特异性mAb B(图3B)和IgG4 mAb C(图3C)。
图4A至图4C是示出通过动态光散射(DLS)评估的在表面活性剂暴露于脂肪酶后聚山梨醇酯和PFA表面活性剂在三种不同抗体制剂中的保护作用的图。使用DLS分析测量热应力后(于25℃保持3个月，并且以250RPM振摇72小时)每种抗体制剂中的粒度分布。合并至峰1(2nm-8nm)的颗粒代表单体，而峰2至峰4中的颗粒代表8nm至10,000nm范围内的较大颗粒，其表示聚集体。图4A示出双特异性mAb A的DLS结果，图4B示出双特异性mAb B的DLS结果，并且图4C示出IgG4 mAb C的DLS结果。
图5是示出浓度为90mg/ml和5mg/ml的mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性的图。用于测定的对照包含NaOH、HCl、猪酯酶(Sigma产品编号：E2884-5KU)、水和无蛋白质的制剂缓冲液。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及一种药物制剂。本发明的药物制剂包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质、药学上可接受的载体和一种或多种聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂，其中该一种或多种PFA表面活性剂对脂肪酶降解具有抗性。
本发明的“药物制剂”是这样的制剂，该制剂为允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
根据本发明的该方面，药物制剂是包含治疗性蛋白质的生物药物制剂。如本文所用，“治疗性蛋白质”涵盖由两种或更多种偶联氨基酸制得的任何治疗性产品。治疗性蛋白质包括非重组血清分离蛋白及其肽或多肽片段、重组蛋白及其肽或多肽片段、抗体及其抗原结合部分、以及抗体模拟物。治疗性蛋白质还包括重组和非重组融合蛋白和肽、嵌合蛋白和肽、蛋白质和肽缀合物、以及抗体和抗体片段融合物(例如，Fc融合蛋白)、嵌合体和缀合物。治疗性蛋白质还包括工程化蛋白质支架，例如III型纤连蛋白结构域支架结合蛋白或单体。
在一个实施方案中，治疗性蛋白质是抗体。抗体包括全长抗体、其抗原结合片段和抗体衍生物。合适的抗体包括任何种类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)和任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的多克隆和单克隆抗体。抗体可以是人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体(例如，双特异性或三特异性抗体)。合适的抗体片段包括但不限于包含完整抗体的抗原结合区或抗原结合结构域的任何分子，例如包含重链可变区(V
在另一个实施方案中，治疗性蛋白质是抗体衍生物。抗体衍生物包括例如但不限于单链抗体(scFv)、串联scFv、双抗体、三抗体或线性抗体。
如本文所述的药物制剂的示例性治疗性抗体包括但不限于抗TNF-α/IL-17Aduobody CNTO 9762(授予Chiu等人的美国专利申请公布号20170218092，该专利申请据此全文以引用方式并入)；抗CD38抗体达雷木单抗(授予Doshi等人的美国专利申请公布号20160367663，该专利申请据此全文以引用方式并入)；抗凝血酶抗体Ichorcumab(授予Huntington等人的美国专利9,518,128和9,605,082，这些专利据此全文以引用方式并入)；抗EGFR/c-Met duobody CNTO 4424(授予Chiu等人的美国专利9,695,242，该专利据此全文以引用方式并入)；抗IL23抗体古塞库单抗(CNTO-1959)(授予Benson等人的美国专利7,935,344，该专利据此全文以引用方式并入)；抗IL12抗体优特克单抗(
药物制剂中的治疗性蛋白质的浓度将根据多个因素而变化，该因素包括但不限于治疗性蛋白质的活性、待治疗的病症、预期接收人群体的年龄、施用途径等。因此，本发明的药物制剂具有在约10mg/mL至约250mg/mL的范围内或在这些值之间的任何范围内的治疗性蛋白质浓度。在一些实施方案中，治疗性蛋白质的浓度大于约250mg/mL。在一些实施方案中，治疗性蛋白质的浓度在约10mg/mL至250mg/mL、50mg/mL至250mg/mL、100mg/mL至250mg/mL、150mg/mL至250mg/mL、200mg/mL至250mg/mL、10mg/mL至200mg/mL、20mg/mL至200mg/mL、50mg/mL至200mg/mL、100mg/mL至200mg/mL、150mg/mL至200mg/mL、10mg/mL至150mg/mL、50mg/mL至150mg/mL、100mg/mL至150mg/mL、10mg/mL至100mg/mL、50mg/mL至100mg/mL、10mg/mL至50mg/mL中任一者的范围内或在这些范围之间的任何范围内。
根据本发明的该方面，药物制剂的治疗性蛋白质是由生物来源(例如，原代细胞群或无限增殖化细胞系)制得的蛋白质。在一个实施方案中，治疗性蛋白质在哺乳动物细胞系中产生。合适的哺乳动物细胞系包括仓鼠细胞系诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHODG44和DUXB11(Gibco,Gaithersburg,MD)、CHO-K1(美国典型培养物保藏中心(ATCC)#CCL-61)、CHO-S(Gibco)、Freestyle CHO-S(Invitrogen,Carlsbad,CA)、CHO-T(Acyte,Brisbane,Australia)和CHO3E7(加拿大国家研究委员会(CNRC)#L-11992)。合适的哺乳动物细胞系还包括小鼠细胞系，例如小鼠骨髓瘤NS0细胞系(欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)#85110503)和小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0(ATCC-CRL-1581)。合适的哺乳动物细胞还包括人细胞系，诸如人羊水细胞例如CAP细胞和CAP-T细胞(Cevec,Koln,Germany)、人视网膜细胞例如PER.C6细胞(Crucell,Leiden,Netherlands)或人胚肾细胞例如Freestyle HEK2930F细胞(Invitrogen)、HEK 2936E(CNRC#L-11266)、HEK 293T(ATCC#CRL-11268)。
如本文所述的药物制剂中的脂肪酶或酯酶活性将根据多个因素而变化，该因素包括但不限于治疗性蛋白质的浓度、治疗性蛋白质的生物来源以及所采用的治疗性蛋白质纯化方法。在一个实施方案中，药物制剂中的脂肪酶活性为≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物，其中一个“单位”的脂肪酶/酯酶活性在25℃和pH 8.0处每分钟将1.0μmol丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇。
本发明的药物制剂还包含一种或多种聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂。一种或多种PFA表面活性剂的掺入在包含在生物系统如细胞中产生的治疗性蛋白质的药物制剂中是尤其有利的，因为PFA对转移到制剂中的残余宿主细胞蛋白质引起的降解具有抗性。具体地，PFA对不能从治疗性蛋白质制剂中充分去除并且在极低浓度下具有高活性的宿主细胞脂肪酶具有抗性。
PFA(也称为醇乙氧基化物)涵盖一类非离子表面活性剂，这类非离子表面活性剂含有经由醚键附接到亲水性环氧乙烷(EO)链的疏水性烷基链。这类表面活性剂由式I的通式结构定义。
R(OCH
PFA的烷基链R的长度和线性度有所变化，但是长度通常介于8个和18个碳之间，在一些实施方案中，长度介于11个至15个碳之间。EO链的长度(即，式I的n)也在约1个至约40个EO单元的长度内变化。在一个实施方案中，本发明的药物制剂的PFA包括具有包含约5个至约40个环氧乙烷单元(即，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39或40个EO单元)的环氧乙烷链的PFA。
虽然PFA是主要用于衣物洗涤剂和其他家用产品中的表面活性剂，但是PFA尚未被用于生物分子的药物制剂、具体地包含治疗性蛋白质诸如抗体的药物制剂中。然而，如本文所示，出乎意料地发现，这类表面活性剂的作用与聚山梨醇酯表面活性剂相同，并且在一些情况下优于聚山梨醇酯表面活性剂例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80(制药工业在大分子商业制剂中利用的主要表面活性剂)。与聚山梨醇酯表面活性剂不同，PFA对宿主细胞脂肪酶引起的降解具有抗性；因此，PFA表面活性剂的浓度随时间推移在制剂中保持稳定，并且能够保护制剂的治疗性蛋白质以免聚集和颗粒形成。因此，当表面活性剂暴露于脂肪酶时，该治疗性蛋白质制剂的稳定性与对应的含有聚山梨醇酯表面活性剂的治疗性蛋白质制剂相比显著提高。
在一个实施方案中，本发明的药物制剂包含聚氧乙烯月桂基醚(CAS号9002-92-0)。示例性聚氧乙烯月桂基醚包括但不限于聚氧乙烯(23)月桂基醚(也以商品名
在另一个实施方案中，本发明的药物制剂包含聚氧乙烯油基醚(CAS号9004-98-2)。示例性聚氧乙烯油基醚包括但不限于聚氧乙烯(20)油基醚(也以商品名
在另一个实施方案中，本发明的药物制剂包含聚氧乙烯硬脂基醚(Cas号9005-00-9)。示例性聚氧乙烯硬脂基醚包括但不限于聚氧乙烯(20)硬脂基醚(也以商品名
在另一个实施方案中，本发明的药物制剂包含聚氧乙烯鲸蜡基醚(Cas号9004-95-9)。示例性聚氧乙烯鲸蜡基醚包括但不限于聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(也以商品名
在一个实施方案中，本发明的药物制剂包含约0.001％至约0.4％(w/v)的PFA表面活性剂。在一个实施方案中，该药物制剂包含约0.005％至约0.2％(w/v)的PFA表面活性剂。在一个实施方案中，该药物制剂包含约0.01％至约0.1％(w/v)的PFA表面活性剂(即，约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％)。在另一个实施方案中，该药物制剂包含约0.01％至约0.09％(w/v)的PFA表面活性剂。在另一个实施方案中，该药物制剂包含约0.01％至约0.06％(w/v)的PFA表面活性剂。在另一个实施方案中，该药物制剂包含约0.01％至约0.04％(w/v)的PFA表面活性剂。
本发明的药物制剂是稳定制剂。如本文所述，“稳定制剂”是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。优选地，该制剂在储存时基本上保持其物理和化学稳定性以及其生物活性。加工和储存期间的PFA表面活性剂的稳定水平有助于本文所述制剂的稳定性。在一个实施方案中，该制剂在适当的储存条件下保持其PFA起始水平的70％。在另一个实施方案中，该制剂在适当的储存条件下保持其PFA表面活性剂起始水平的75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，在将制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，PFA的>90％保持完整。
在一些实施方案中，在将制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，PFA的>95％在制剂中保持完整。
在另一个实施方案中，在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，PFA的>90％保持完整。在一些实施方案中，在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，PFA的>95％保持完整。
在另一个实施方案中，在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，PFA的>90％保持完整。在一些实施方案中，在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，PFA的>95％保持完整。
本领域已知的各种分析技术可用于测量本发明的药物制剂中的蛋白质稳定性。稳定性可在所选量的光暴露和/或温度处测量达所选时间段。可以多种不同的方式定性和/或定量评估稳定性，包括聚集体形成的评估。可通过例如但不限于尺寸排阻色谱法、浊度和/或通过目视检查来评估聚集体形成。还可基于颗粒和亚可见颗粒形成来评估稳定性，这可使用例如但不限于动态光散射、纳米颗粒跟踪分析、共振质量测量、光阻法和流动成像来估计。在另一个实施方案中，使用例如但不限于光应力测定或2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)应力测定，通过ROS形成的评估来测量稳定性。在另一个实施方案中，基于蛋白质的特定氨基酸残基的氧化来评估稳定性。该分析可使用抗体检测来进行。例如，通过单克隆抗体检测来检测Trp残基和/或Met残基。在另一个实施方案中，通过使用阳离子交换色谱法、成像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳估计电荷异质性来评估稳定性。适于根据本文所述的方法使用的稳定性的其他量度包括但不限于氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE或毛细管电泳SDS分析，以比较还原抗体和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；以及评估蛋白质的生物活性或靶结合功能(例如，抗体的抗原结合功能)。
在一个实施方案中，与包含相同治疗性蛋白质但用聚山梨醇酯表面活性剂配制的药物制剂相比，本发明的药物制剂具有增强的稳定性。在一个实施方案中，本发明的药物制剂的稳定性通过制剂中保持其所需单体状态(对比二聚体或三聚体聚集状态)的治疗性蛋白质的百分比来表征。因此，在一个实施方案中，如本文所述的包含PFA表面活性剂的药物制剂中的治疗性蛋白质的>90％在其储存寿命期间处于单体状态。在另一个实施方案中，药物制剂中的治疗性蛋白质的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％在其整个储存寿命期间处于所需的单体状态。
在另一个实施方案中，在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，治疗性蛋白质的>90％处于单体状态。在另一个实施方案中，在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
在另一个实施方案中，在将制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，治疗性蛋白质的>90％处于单体状态。在一些实施方案中，在将制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
在另一个实施方案中，在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，治疗性蛋白质的>90％处于单体状态。在另一个实施方案中，在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
在另一个实施方案中，本发明的制剂是稳定制剂，如由其对亚可见颗粒形成的抗性所示。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每个容器(例如，1mL至50mL小瓶或0.25mL至2mL注射器)≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
在另一个实施方案中，本文所述的治疗性蛋白质药物制剂在冷藏期间对亚可见颗粒形成具有抗性。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每个容器≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
在另一个实施方案中，本文所述的治疗性蛋白质药物制剂在长期冷藏期间对亚可见颗粒形成具有抗性。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每个容器≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
在另一个实施方案中，本文所述的治疗性蛋白质药物制剂是稳定制剂，如它们对可见颗粒形成的抗性所示。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，如本文所述的制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
如本文所述的稳定的治疗性蛋白质药物制剂在冷藏期间对可见颗粒形成具有抗性。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，如本文所述的制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
在另一个实施方案中，本文所述的治疗性蛋白质药物制剂在长期冷藏期间对可见颗粒形成具有抗性。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，如本文所述的制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
在另一个实施方案中，本发明的稳定制剂具有低浊度。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后的浊度为≤18.0NTU(比浊法浊度单位)。
在另一个实施方案中，稳定的治疗性蛋白质药物制剂在冷藏期间具有低浊度。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后的浊度为≤18.0NTU。
在另一个实施方案中，稳定的治疗性蛋白质药物制剂在冷藏期间具有低浊度。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后的浊度为≤18.0NTU。
本发明的药物制剂还可包含任何合适的辅助剂中的至少一种，诸如但不限于稀释剂、粘结剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。此类无菌溶液的非限制性示例和制备方法是本领域熟知的，参见例如Gennaro AR.，Remington's PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing Co.(1990年)，该文献据此全文以引用方式并入。
可用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和低聚糖；衍生糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，药物赋形剂和添加剂可以单独或组合的方式存在，其单独或组合具有1-99.99重量％或体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。还可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/抗体成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。碳水化合物赋形剂占本文所述药物制剂的约0.5％至约15％w/v。
本发明的制剂还可包含缓冲剂或pH调节剂。通常，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。缓冲盐通常以约5mM至约50mM的浓度存在于本发明的药物制剂中。
制剂的pH可在约pH 4至约pH 10、约pH 5至约pH 9、或约pH 6至约pH 8的范围内。在一个实施方案中，本发明的制剂具有介于约pH 6.8和约pH 7.8之间的pH。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和磷酸钠缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
此外，本发明的药物制剂可包含聚合物赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
本发明的药物制剂还可包含一种或多种药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指与治疗性蛋白质一起配制的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。
本文所述的药物制剂可根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的治疗性蛋白质的浓度可在按重量计小于约0.5％、通常到至少约1％、到多达15、20％、25％、30％或>30％范围内变化，并且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其他人蛋白质例如人血清白蛋白在内的合适媒介物和制剂在例如REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，第21版，(2006年)中有所描述，该文献据此全文以引用方式并入。
本发明的另一方面涉及一种减少包含生物组合物的药物制剂中的聚集体和/或颗粒形成的方法。该方法涉及提供生物组合物，其中生物组合物包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质；以及在该生物组合物中掺入一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂作为聚山梨醇酯表面活性剂的替代物。
本发明的另一方面涉及一种延长包含生物组合物的药物制剂的储存寿命的方法。该方法涉及提供生物组合物，其中生物组合物包含约20mg/mL至约200mg/mL的治疗性蛋白质；以及在该生物组合物中掺入一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂作为聚山梨醇酯表面活性剂的替代物。
本发明的另一方面涉及一种制备具有稳定表面活性剂浓度的药学上可接受的治疗性蛋白质制剂的方法。该方法涉及提供药学上可接受的治疗性蛋白质组合物，以及将一种或多种抗脂肪酶聚乙氧基化脂肪醇(PFA)表面活性剂掺入该治疗性蛋白质组合物中，从而制备药学上可接受的治疗制剂，该治疗制剂具有在制剂的储存寿命内保持稳定的表面活性剂浓度。
如本文所述的方法尤其适用于具有≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性的生物组合物，其中一个“单位”的活性在25℃和pH8.0处每分钟将1.0μmol丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇。生物组合物中的这一脂肪酶活性水平足以引起聚山梨醇酯降解，随后危及生物组合物的稳定性。因此，在一个实施方案中，如本文所述的方法涉及提供生物组合物的药物制剂，其中生物组合物具有≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性。将所述一种或多种抗脂肪酶PFA表面活性剂掺入该生物组合物中作为聚山梨醇酯表面活性剂的替代物将减轻表面活性剂随时间推移的降解，并且减少生物组合物和药物制剂中的聚集体和/或颗粒形成。此类药物制剂将具有延长的储存寿命以及在制剂的储存寿命期间稳定的表面活性剂。在某些实施方案中，如本文所述的方法提供了具有一种或多种抗脂肪酶PFA表面活性剂的生物组合物的药物制剂，其中生物组合物具有≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性。在某些其他实施方案中，如本文所述的方法提供了具有一种或多种抗脂肪酶PFA表面活性剂的生物组合物的药物制剂，其中生物组合物具有≥1、≥0.9、≥0.8、≥0.7、≥0.6、≥0.5、≥0.4、≥0.3、≥0.2、≥0.1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性。在某些实施方案中，如本文所述的方法提供了具有一种或多种抗脂肪酶PFA表面活性剂的生物组合物的药物制剂，其中生物组合物具有≥0.1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性。
在另一个实施方案中，本发明的方法还涉及在掺入所述一种或多种抗脂肪酶PFA表面活性剂之前测量生物组合物的脂肪酶活性。测量生物样品中的脂肪酶活性的合适方法是本领域已知的，参见例如Hernandez-Garcia等人，“An Improved Method to MeasureLipase Activity in Aqueous Media”，Anal.Biochem.530:104-106(2017年)；Tietz和Repique，“Proposed Standard Method for Measuring Lipase Activity in Serum by aContinuous Sampling Technique”，Clin.Chem.19(11):1268-1275(1973年)；Ehnholm等人，“Two Methods Compared forMeasuring Lipase Activity in Plasma after HeparinAdministration”，Clin.Chem.30(9):1568-70(1984年)，这些文献据此全文以引用方式并入。一般来讲，测量生物样品的脂肪酶活性的合适方法涉及测量由存在于样品中的酯酶/脂肪酶引起的乙酸-4-硝基苯酯向4-硝基苯酚的转化。该转化可使用分光光度法监测、检测和定量。例如，在pH>6.0处，转化的4-硝基苯酚呈黄色，并且其产量可在400nm处监测。如上所述，将抗脂肪酶PFA表面活性剂掺入生物组合物中，该生物组合物具有≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物的脂肪酶/酯酶活性。
本发明的方法可用于包含任何上述治疗性蛋白质中任一种治疗性蛋白质的药物组合物，该治疗性蛋白质包括但不限于非重组血清分离蛋白及其肽、重组蛋白或其肽、抗体或其抗原结合部分、抗体衍生物和/或抗体-药物缀合物。
根据本发明的这些方法，药物制剂包含衍生于生物来源(即，细胞群或细胞系)的治疗性蛋白质。可从其获得治疗性蛋白质的细胞系包括但不限于哺乳动物CHO细胞系、PER.C6细胞系和Sp2/0细胞系，如上所述。制剂中的治疗性蛋白质的浓度在约10mg/mL至约250mg/mL的范围内或在如上所述的这些值之间的任何范围内。在一些实施方案中，治疗性蛋白质的浓度大于约250mg/mL。在一些实施方案中，治疗性蛋白质的浓度在约10mg/mL至250mg/mL、50mg/mL至250mg/mL、100mg/mL至250mg/mL、150mg/mL至250mg/mL、200mg/mL至250mg/mL、10mg/mL至200mg/mL、50mg/mL至200mg/mL、100mg/mL至200mg/mL、150mg/mL至200mg/mL、10mg/mL至150mg/mL、50mg/mL至150mg/mL、100mg/mL至150mg/mL、10mg/mL至100mg/mL、50mg/mL至100mg/mL、10mg/mL至50mg/mL中任一者的范围内或在这些范围之间的任何范围内。
根据本发明的该方面，将一种或多种PFA表面活性剂掺入包含在生物系统如细胞中产生的治疗性蛋白质的药物制剂中是尤其有利的，因为PFA对转移到制剂中的残余宿主细胞蛋白质引起的降解具有抗性。具体地，PFA对未从并且不能从治疗性蛋白质制剂中充分去除并且在极低浓度下具有高活性(≥1单位/mL纯化猪酯酶或其等同物)的宿主细胞脂肪酶具有抗性。如上所述，合适的PFA表面活性剂具有式I的通式结构。在一个实施方案中，亲水性环氧乙烷链的长度包含约1个至约40个单元。在一个实施方案中，环氧乙烷链的长度包含约5个至约40个环氧乙烷单元。
在一个实施方案中，将聚氧乙烯月桂基醚例如聚氧乙烯(23)月桂基醚(也以商品名
在一个实施方案中，将所述一种或多种PFA表面活性剂掺入药物制剂中，使得组合物包含0.001％至约0.4％(w/v)的PFA表面活性剂。在一个实施方案中，所述方法制备包含约0.005％至约0.2％(w/v)PFA表面活性剂的药物制剂。在一个实施方案中，所述方法制备包含约0.01％至约0.1％(w/v)PFA表面活性剂的药物制剂。在另一个实施方案中，所述方法制备包含约0.01％至约0.09％(w/v)PFA表面活性剂的药物制剂。在另一个实施方案中，所述方法制备包含约0.01％至约0.06％(w/v)PFA表面活性剂的药物制剂。在另一个实施方案中，所述方法制备包含约0.01％至约0.04％(w/v)PFA表面活性剂的药物制剂。
本发明的方法制备具有稳定表面活性剂浓度的治疗性蛋白质药物制剂。根据这些方法，在将制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，PFA的>90％在制剂中保持完整。在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，PFA的>95％在制剂中保持完整。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，PFA的>90％保持完整。在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，PFA的>95％保持完整。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，PFA的>90％保持完整。在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，PFA的>95％保持完整。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备稳定的治疗性蛋白质制剂，其中在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，治疗性蛋白质(例如，抗体)的>90％处于单体状态。在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后，制剂中的治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
本发明的方法制备稳定的治疗性蛋白质药物制剂，其中在将制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，治疗性蛋白质(例如，抗体)的>90％处于单体状态。在一些实施方案中，本文所述的方法制备治疗性蛋白质制剂，其中在将制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后，治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，治疗性蛋白质(例如，抗体)的>90％处于单体状态。在另一个实施方案中，本发明的方法制备制剂，其中在将制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后，治疗性蛋白质的>95％处于单体状态。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备对亚可见颗粒形成具有抗性的稳定制剂。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每个容器≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
本发明的方法制备在冷藏期间对亚可见颗粒形成具有抗性的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，该方法制备制剂，该制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每个容器≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备在长期冷藏期间对亚可见颗粒形成具有抗性的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每个容器≤6000个颗粒(尺寸≥10μm)和每个容器≤600个颗粒(尺寸≥25μm)。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备对可见颗粒形成具有抗性的稳定制剂。在一个实施方案中，该方法制备制剂，该制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
本发明的方法制备在冷藏期间对可见颗粒形成具有抗性的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约1℃至约10℃处储存至少约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备在长期冷藏期间对可见颗粒形成具有抗性的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每毫升≤80个颗粒(尺寸≥70μm)。在另一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后包含每毫升≤10个颗粒(尺寸≥70μm)。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备具有低浊度的稳定制剂。在一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约22℃至约28℃处储存至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月之后具有≤18.0NTU(比浊法浊度单位)。
本发明的方法制备在冷藏期间具有低浊度的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，本文所述的方法制备制剂，该制剂在约1℃至约10℃处储存约六个月、至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月或至少约48个月之后具有≤18.0NTU。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备在冷藏期间具有低浊度的稳定的治疗性蛋白质药物制剂。在一个实施方案中，如本文所述的制剂在约-15℃至约-90℃处储存至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月、至少约30个月、至少约36个月、至少约42个月、至少约48个月、至少约54个月、至少约60个月、至少约66个月或至少约72个月之后的浊度为≤18.0NTU。
在另一个实施方案中，本发明的方法制备药物制剂，其中该制剂的储存寿命比对应的包含聚山梨醇酯表面活性剂的制剂的储存寿命长至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约十个月、至少约十一个月或至少约十二个月。
已总体地描述了本发明，通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，所述实施例仅以示例的方式给出并且绝不限制本发明的范围。
材料：本研究中研究的表面活性剂包括PFA和聚山梨醇酯。两种PFA，即
为了评估mAb制剂中不同表面活性剂的保护作用，将聚山梨醇酯和PFA添加到三种不同mAb的制剂中。mAb A和mAb B是双特异性抗体，并且mAb C是IgG4单克隆抗体。mAb A和mAb B的制剂包含10mM组氨酸、8.5％(w/v)蔗糖，pH为5.7。mAb C制剂由10mM磷酸钠、8.5％(w/v)蔗糖、10ppm EDTA组成，pH为7.1。所有三种mAb在其相应制剂中的浓度为50mg/mL。将3％(w/v)表面活性剂储备溶液添加到mAb制剂中，以在每种mAb的最终制剂中产生0.01％和0.04％(w/v)的聚山梨醇酯或PFA浓度。在制备每种制剂之后，将材料填充到具有1mL填充量的高压消毒2R玻璃小瓶中，塞住并卷边密封。然后将这些瓶装制剂分成三个条件：T0对照、振摇应力(于环境温度在轨道式震荡器上以250RPM振摇72小时)以及热应力(于25℃温育3个月)后接振摇应力(以250RPM振摇72小时)。用小瓶一式三份地评估每个制剂条件。使用尺寸排阻色谱法(SEC)评估表面活性剂类型和浓度的影响。
图1A至图1C是示出通过SEC评估的处于所需单体状态的每种制剂的百分比的图。含聚山梨醇酯的制剂和含PFA的制剂的比较显示出当制剂暴露于振摇应力和热应力时的类似单体百分比结果。在0.01％(w/v)的低表面活性剂水平处，SEC结果表明，对于在25℃储存3个月然后经受振摇应力的应力条件，PFA(Brij O20和Brij L23)制剂比聚山梨醇酯(PS20和PS80)制剂保持更高的单体含量百分比(Student's t检验，p<0.01)。这些发现结果表明，在低浓度处，PFA制剂能够提供比聚山梨醇酯更多的针对热应力和振摇应力的保护。
将PFA表面活性剂和聚山梨醇酯表面活性剂的储备溶液在18天的时间内暴露于固定在小珠上的脂肪酶。在测试过程中定期定量溶液中的表面活性剂水平，以确定脂肪酶介导的降解程度。
对暴露于脂肪酶的溶液中的完整聚山梨醇酯水平的定量表明，3天后完整聚山梨醇酯含量降低>50％(参见图2)。相比之下，在至多18天的整个暴露持续时间内，PFA表面活性剂水平基本上保持不变(图2)。这些结果突出了PFA对脂肪酶介导的降解的抗性相对于聚山梨醇酯的差异，并且证实了尽管存在来自抗体制造过程的残余宿主细胞蛋白质，PFA表面活性剂仍会在mAb制剂中保持完整。
另外的研究评估了PFA制剂和聚山梨醇酯制剂在表面活性剂暴露于脂肪酶后保持其保护作用的能力。向mAb制剂中添加已暴露于脂肪酶小珠的表面活性剂，然后经受振摇应力或者热应力后接振摇。然后分别使用SEC和DLS评估mAb制剂的可溶性聚集和颗粒物。
SEC结果证实了脂肪酶暴露对聚山梨醇酯表面活性剂的有害影响以及对mAb稳定性的相关影响。在一些情况下，暴露于脂肪酶的聚山梨醇酯的存在导致与不含任何表面活性剂的对照制剂更低的单体含量百分比(参见图3A，将0.01％PS80和0.04％PS80与无表面活性剂比较，以及图3C，将0.01％PS20与无表面活性剂比较)。这突出了在涉及脂肪酶暴露的制剂环境中使用聚山梨醇酯表面活性剂的缺点。相比之下，在每种研究的mAb中，尽管存在脂肪酶暴露，PFA制剂仍保持其保护作用。在0.01％(w/v)的表面活性剂水平处，每种mAb的PFA制剂在所有应力条件下均优于聚山梨醇酯制剂和无表面活性剂对照。在更高的0.04％(w/v)的表面活性剂水平处，通过SEC测量，某些mAb未表现出可溶性聚集体的大幅减少，但是脂肪酶介导的聚山梨醇酯降解的有害影响通过不溶性颗粒形成而显露无遗。
脂肪酶暴露对制剂稳定性的影响还在评估颗粒形成随表面活性剂的变化的正交测定诸如DLS中得到证实。DLS粒度分布结果表明，与PFA制剂相比，暴露于脂肪酶的聚山梨醇酯制剂更易于形成较大尺寸的颗粒(参见图4A至图4C)。对于低表面活性剂水平和高表面活性剂水平，PFA制剂中基本上所有散射强度均来源于合并在峰1中的粒度，其与单体尺寸范围相关。这与具有显著量的散射的聚山梨醇酯制剂形成对比，聚山梨醇酯制剂的散射来源于8nm至300nm范围内的较大颗粒(图4A至图4B)。
正交DLS测定为SEC结果提供补充，并且证实了在脂肪酶可以降解含酯键的表面活性剂的条件下，PFA制剂在其保护mAb免于可溶性聚集和不溶性颗粒形成的能力方面优于聚山梨醇酯制剂。
为了测定不利于治疗性蛋白质制剂的宿主细胞来源的酯酶/脂肪酶活性的阈值水平，在包含不同浓度的纯化治疗性蛋白质(抗体)的制剂中测定酯酶/脂肪酶活性。代表性实施例示于图5中，其中分析了浓度为90mg/ml和5mg/ml的mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性。如图5所示，包含5mg/mL总蛋白质的mAb D制剂表现出较低水平的酯酶/脂肪酶活性(参见图5的图中的最后一个条柱)。虽然该水平的酯酶/脂肪酶活性是可检测的并且影响是可测量的，但已确定的是，就聚山梨醇酯降解和治疗性蛋白质的稳定性而言，低于该活性水平的酯酶/脂肪酶活性可以是可接受的。因此，低于mAb D的5mg/mL样品中存在的酯酶/脂肪酶活性被确定为可接受的酯酶/脂肪酶活性水平。对于可接受的酯酶/脂肪酶活性水平的更谨慎的截止值将为比存在于mAb D的5mg/mL样品中的活性<10％的活性。
数据分析确定，5mg/mL mAb D样品中的酯酶/脂肪酶活性为酯酶对照(猪酯酶；Sigma PN E2884-5KU，CAS号9016-18-6，EC3.1.1.1)的1％，该酯酶对照具有125U/mL活性。基于该分析，mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性的可接受水平对应于<1.25单位/mL猪酯酶。四舍五入为正确位数的有效数字，mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性的可接受水平对应于<1单位/mL猪酯酶。在某些实施方案中，mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性的可接受水平对应于<1单位/mL猪酯酶、<0.9单位/mL猪酯酶、<0.8单位/mL猪酯酶、<0.7单位/mL猪酯酶、<0.6单位/mL猪酯酶、<0.5单位/mL猪酯酶、<0.4单位/mL猪酯酶、<0.3单位/mL猪酯酶、<0.2单位/mL猪酯酶或<0.1单位/mL猪酯酶。在某些实施方案中，mAb D制剂中的酯酶/脂肪酶活性的可接受水平对应于<0.1单位/mL猪酯酶。因此，对应于≥1单位/mL猪酯酶的酯酶/脂肪酶活性水平被认为不利于治疗性蛋白质制剂。在某些其他实施方案中，对应于≥1单位/mL猪酯酶、≥0.9单位/mL猪酯酶、≥0.8单位/mL猪酯酶、≥0.7单位/mL猪酯酶、≥0.6单位/mL猪酯酶、≥0.5单位/mL猪酯酶、≥0.4单位/mL猪酯酶、≥0.3单位/mL猪酯酶、≥0.2单位/mL猪酯酶或≥0.1单位/mL猪酯酶的酯酶/脂肪酶活性水平被认为不利于治疗性蛋白质制剂。在某些其他实施方案中，对应于≥0.1单位/mL猪酯酶的酯酶/脂肪酶活性水平被认为不利于治疗性蛋白质制剂。根据本文提供的数据，聚山梨醇酯表面活性剂可能不是酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶的制剂的最佳选择。在某些其他实施方案中，聚山梨醇酯表面活性剂可能不是酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶、≥0.9单位/mL猪酯酶、≥0.8单位/mL猪酯酶、≥0.7单位/mL猪酯酶、≥0.6单位/mL猪酯酶、≥0.5单位/mL猪酯酶、≥0.4单位/mL猪酯酶、≥0.3单位/mL猪酯酶、≥0.2单位/mL猪酯酶或≥0.1单位/mL猪酯酶的制剂的最佳选择。相反，数据表明，在酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶的制剂中应避免使用聚山梨醇酯表面活性剂。此外，数据表明，在酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶、≥0.9单位/mL猪酯酶、≥0.8单位/mL猪酯酶、≥0.7单位/mL猪酯酶、≥0.6单位/mL猪酯酶、≥0.5单位/mL猪酯酶、≥0.4单位/mL猪酯酶、≥0.3单位/mL猪酯酶、≥0.2单位/mL猪酯酶或≥0.1单位/mL猪酯酶的制剂中应避免使用聚山梨醇酯表面活性剂。在某些其他实施方案中，在酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥0.1单位/mL猪酯酶的制剂中应避免使用聚山梨醇酯表面活性剂。相反，如本文所述的聚乙氧基化脂肪醇表面活性剂应当用于酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶的制剂中。在某些其他实施方案中，如本文所述的聚乙氧基化脂肪醇表面活性剂应当用于酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥1单位/mL猪酯酶、≥0.9单位/mL猪酯酶、≥0.8单位/mL猪酯酶、≥0.7单位/mL猪酯酶、≥0.6单位/mL猪酯酶、≥0.5单位/mL猪酯酶、≥0.4单位/mL猪酯酶、≥0.3单位/mL猪酯酶、≥0.2单位/mL猪酯酶或≥0.1单位/mL猪酯酶的制剂中。在某些其他实施方案中，如本文所述的聚乙氧基化脂肪醇表面活性剂应当用于酯酶/脂肪酶活性水平对应于≥0.1单位/mL猪酯酶的制剂中。
虽然本文已经描绘和详述了优选的实施方案，但对于相关领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明的实质的情况下进行各种修改、添加、取代等，并因此认为这些在如下权利要求中所定义的本发明的范围之内。
机译： 用于大分子治疗制剂的抗脂肪酶降解表面活性剂
机译： 用于大分子治疗制剂的脂肪酶降解抗性表面活性剂
机译： 脂肪酶降解抗性表面活性剂用于大分子治疗制剂
