抗海蟾蜍毒素抗体及其应用

摘要

本发明提供了嵌合的、人源化的和人的单克隆抗体(mAb)及其片段，其以高亲和力特异性结合至海蟾蜍毒素(MBG)。抗MBG mAb及其片段可用于治疗MBG相关疾病，包括高血压疾病和纤维化疾病，可选地与另外的治疗剂组合。此外，抗MBG mAb及其片段可用于诊断目的，包括检测生物学样本中的MBG和诊断MBG相关疾病。

说明书

本发明是在政府机构NIH/NICHD(国家儿童健康与发展研究所)授予的第1R43HD072745-01批准号的政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。

序列表的正式文本以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与本说明书同时提交，其文件名为“PRI002_ST25.txt”，创建日期为2018年6月7日，大小为52KB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并在此以其全文形式被援引加入本文。

背景技术

高血压与多种疾病有关。一种高血压疾病是先兆子痫(PE)。PE是妊娠的严重并发症，表征为妊娠20周后高血压(舒张压≥90mmHg)和蛋白尿(24小时内≥300mg)。PE有时或经常伴有水肿(例如肺水肿)、脑病、癫痫发作、肾功能不全、肝功能衰竭、子宫内生长受限(IUGR)和早产，后两者不利于胎儿和新生儿的生存和健康。PE发生在约5-10％的怀孕中，是全世界母婴发病率和死亡率的主要原因。PE的唯一已知有效疗法是新生儿的早产。

另外，纤维化导致许多疾病。一种纤维化疾病是糖尿病肾病(DN)，其也表征为高血压。DN影响约15-25％的1型糖尿病患者和约30-40％的2型糖尿病患者，并且是世界上最常见的终末期肾病(ESRD)的病因。临床DN涉及一系列病理事件，包括肾小球内毛细血管压力和肾小球滤过率(GFR)的初始升高、肾小球肥大、系膜基质扩张、肾小球基底膜增厚、小动脉透明变性、结节性肾小球硬化、肾小管间质纤维化和损伤、以及蛋白尿(包括白蛋白尿)。例如，肾小球毛细血管的瘢痕形成(肾小球硬化)会损害肾小体的过滤过程，并使蛋白质从血液中泄漏到尿液中，从而导致蛋白尿。DN患者的血糖控制差会加剧疾病进展为肾功能不全和GFR下降，从而可导致ESRD。

发明内容

本公开内容提供了抗体，包括以高亲和力特异性结合至海蟾蜍毒素(MBG)的抗体片段。抗体可以是单克隆的，并且可以是人的、嵌合的或人源化的抗体。包括其片段的嵌合抗MBG抗体可能具有非人(例如鼠)互补决定区(CDR)和非人框架区，以及可选地一个或多个人恒定域。包括其片段的人源化抗MBG抗体可能具有非人(例如鼠)CDR和人框架区，以及可选地与CDR相邻的非人框架氨基酸残基和可选地一个或多个人恒定域。人抗MBG抗体及其片段可能具有人CDR和人框架区，以及可选地一个或多个人恒定域。

所公开的人类抗体代表来自文库的抗海蟾蜍毒素抗体，该文库代表与海蟾蜍毒素结合的抗体的原始人类基因组库。在人噬菌粒文库(代表抗体的原始人类基因组库)上淘选鉴定了数十个MBG特异性克隆。大于100种人抗体(Fab)的后续表征将人抗体减少为14种独特抗体，这些抗体在竞争性ELISA筛选中显示与MBG结合。因此，从文库获得的人抗体代表可以结合海蟾蜍毒素的原始人基因组库中发现的那些抗体。

本文所述的抗MBG抗体可以包括为抗体提供所需性质的修饰。例如，修饰可以增加抗体的血清半衰期，或者修饰可以减少血清半衰期。修饰还可以增加抗体的效应物功能，例如增加抗体-MBG复合物的清除率。修饰可以降低免疫原性，或减少由抗MBG抗体引起的其它不想要的副作用或不良事件。

本文所述的抗MBG抗体可以中和或抑制MBG的生物学作用和效应，因此可用于治疗MBG相关疾病。例如，本文所述的抗MBG抗体可用于抑制MBG在细胞上的受体结合。本文所述的抗体可用于抑制由海蟾蜍毒素在细胞中诱导的PKC-δ的核易位。本文所述的抗体可用于减少由海蟾蜍毒素引起的内皮细胞对增殖的抑制。本文所述的抗体可用于减少由海蟾蜍毒素引起的内皮细胞对血管生成的抑制。MBG相关疾病可以包括，例如急性呼吸窘迫综合征和/或外伤性脑损伤。其它MBG相关疾病包括，例如高血压(例如原发性高血压)、高血压相关疾病(例如先兆子痫)和纤维化相关疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病性肾病)。这些MBG相关疾病可以通过向患有MBG相关疾病的受试者施用一种或多种本文所述的抗体来治疗。

本文所述的抗MBG抗体可用于诊断目的。所述MBG诊断使用抗体来检测MBG。这些诊断可以在体外或体内进行。所述诊断可以例如定量样品中的MBG或检测MBG的位置和/或该位置的MBG浓度。这些诊断可用于确定受试者是否患有MBG相关疾病，以及可选地，MBG相关疾病的严重程度。

附图说明

通过参考下面的详细描述，将获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，以下详细描述阐述了本公开内容的说明性实施例以及附图。

图1示出了在直接ELISA结合实验中人源化抗MBG的抗原结合。图1a比较了6种人源化的抗MBG抗体，而图1b比较了人源化抗MBG抗体和亲本3E9抗体。

图2a是Western印迹，示出了与单独的MBG(2nM)或与MBG(2nM)加抗MBG抗体一起孵育的原代心脏成纤维细胞核中蛋白激酶C-δ(PKC-δ，78kDa)的相对量。

图2b是Western印迹，示出了与MBG(10nM)或与MBG(10nM)加抗MBG抗体一起孵育的原代心脏成纤维细胞核中蛋白激酶C-δ(PKC-δ，78kDa)的相对量。

图3a示出了与单独的MBG(2nM)或与MBG(2nM)加人抗MBG抗体(20μg/mL)一起孵育的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖水平。

图3b示出了与单独的MBG或与MBG(2nM)加人源化抗MBG抗体(2.5-10μg/mL)一起孵育的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖水平。

图4示出了OD

图5示出了用于测量生物样品中MBG的竞争性ELISA测定中MBG的标准曲线。

具体实施方式

尽管在此描述了本公开内容的各种实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本文所述的实施例的多种修改和改变以及变化和替代对本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解，在实践本公开内容中可以采用本文所述的实施例的各种替代方案。还应理解，本公开内容的每个实施例可以可选地与本文所述的与该实施例一致的其它实施例中的任何一个或多个组合。

在以列表格式(例如，以马库什组)表示元素之处，应当理解，还公开了元素的每个可能的子组，并且可以从列表或组中除去任何一个或多个元素。

还应理解，除非有明显的相反指示，否则在本文描述或要求保护的包括一个以上动作或步骤的任何方法中，该方法的动作或步骤的顺序不必要限于所记载的该方法的动作或步骤的顺序，而是本公开内容涵盖其中顺序如此受限的实施例。

还应理解，一般，在说明书或权利要求书中的一个实施例被提及包括一个或多个特征时，本公开内容还涵盖由这些特征组成或基本上由这些特征组成的实施例。

还应理解，本公开内容的任何实施例，例如在现有技术中发现的任何实施例，都可以明确地从权利要求中排除，而不管说明书中是否记载了特定的排除。

还应理解，本文中提及肽、多肽或蛋白质，例如抗体或其片段，包括其药学上可接受的盐，除非另外特别声明或上下文另有明确说明。这样的盐可以具有正净电荷、负净电荷或没有净电荷。

本文包含标题以供参考并有助于定位某些部分。标题不旨在限于在那些标题下的部分中描述的实施例和概念的范围，并且那些实施例和概念可在整个公开内容中的其它部分中应用。

本文引用的所有专利文献和所有非专利文献都以其全文形式被援引加入本文，其程度如同每篇专利文献或非专利文献被具体地和单独地指示以其全文形式被援引加入本文。

I.

除非另有定义或通过在本文中的使用另有明确说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，除非另外特别声明或上下文另有明确说明，否则不定冠词“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及定冠词“所述/该(the)”可以包括复数指代物和单数指代物。

术语“大约”或“近似/大致”是指由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，其部分取决于如何测量或确定该值。在某些实施例中，术语“大约”或“近似/大致”表示在一个标准偏差之内。在某些实施例中，当没有记载特定的误差范围(例如，图表或数据表中给出的平均值的标准偏差)时，术语“大约”或“近似/大致”是指当考虑到重要数字时，涵盖所述值的范围以及通过向上或向下舍入使其也包括在所述值中的范围。在某些实施例中，术语“大约”或“近似/大致”是指在特定值的±10％、5％、4％、3％、2％或1％之内。每当术语“大约”或“近似/大致”在一系列两个或更多个数值或一系列两个或更多个数值范围中位于第一个数值之前时，术语“大约”或“近似/大致”适用于该系列数值或该系列数值范围中的每个数值。

术语“抗体”是指在功能上被定义为结合蛋白并且在结构上被定义为包含被识别为源自免疫球蛋白编码基因的框架区的氨基酸序列的蛋白质。抗体可以由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一个或多个多肽组成。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知典型的γ免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端定义了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(V

抗体以完整的免疫球蛋白或许多特征明确的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)'

抗体还包括重链二聚体，例如骆驼科动物的抗体。由于骆驼科动物中的重链二聚体IgG的V

在骆驼科动物中，抗体库的多样性取决于V

可以通过例如2005年2月17日公开的美国专利申请公开号US20050037421中公开的方法来制备维持骆驼科动物的可变区的体内多样性的骆驼科动物来源的抗体可变区的文库，该篇专利以其全文形式被援引加入本文。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是抗体作用的重要机制。可以通过几种方法来增强ADCC，其中许多方法涉及具有改善的Fc受体结合的终产物抗体。已显示抗体Fc区中的氨基酸取代增加了对NK细胞上的FcγRIIIa受体的Fc结合亲和力(Natsume等人,DrugDesign,Development and Therapy,2009,vol.3,pp.7-16，该篇文献以其全文形式被援引加入本文)并改善ADCC活性。改善ADCC的另一种方法是改变抗体糖基化的糖组成。这通过制成缺少岩藻糖残基的抗体来进行，也就是说，抗体是‘a-fucosylated’或‘de-fucosylated’的抗体。一种方法涉及改变/修饰抗体的糖基化位点，使得不能将岩藻糖添加到抗体中(专利：6194551，2001年2月27日)。另一种方法是通过例如酶促降解或通过任何其它方式除去岩藻糖来除去抗体上预先存在的岩藻糖。另一种方法涉及宿主表达系统的基因工程，使得不能将岩藻糖转移或添加到抗体中，例如通过抑制或缺失岩藻糖基转移酶活性来进行(美国专利申请公开号：20070134759，2007年6月14日；和20080166756，2008年7月10日，二者均以其全文形式被援引加入本文)。

如本文所使用的，术语“抗原”是指能够在适当条件下诱导特异性免疫应答并能够与该应答产物反应的物质，例如与特异性抗体或特异性致敏的T-淋巴细胞或两者反应。抗原可以是可溶性物质，例如毒素和外来蛋白质，或微粒，例如细菌和组织细胞；然而，只有蛋白质或多糖分子中被称为抗原决定簇(表位)的部分与抗体或淋巴细胞上的特异性受体结合。更广泛地讲，术语“抗原”可用于指抗体结合或需要抗体的任何物质，无论该物质是否具有免疫原性。对于此类抗原，可以通过重组方法来鉴定抗体，而与任何免疫应答无关。

如本文所使用的，抗体的术语“结合特异性”是指抗体结合的抗原的同一性，优选地指抗体结合的表位的同一性。

如本文所使用的，术语“嵌合多核苷酸”是指多核苷酸包含野生型区域和突变区域。也可能意味着多核苷酸包含来自一个多核苷酸的野生型区域和来自另一相关多核苷酸的野生型区域。

如本文所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指通过Kabat和Chothia举例说明的本领域公认的术语。CDR一般也称为高变区或高变环(Chothia and Lesk(1987)JMol.Biol.196:901；Chothia等人(1989)Nature 342:877；E.A.Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1987)；和Tramontano等人(1990)J Mol.Biol.215:175，所有文献均以其全文形式被援引加入本文)。“框架区”或“FR”是指V结构域的CDR侧翼的区域。CDR和框架区的位置可以使用本领域中各种众所周知的定义来确定，例如Kabat，Chothia,InternationalImMunoGeneTics database(IMGT)和AbM(参见，例如，Johnson et al.,supra；Chothia&Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia C.et al.,1989,Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature 342,877-883；Chothia C.et al.,1992,structural repertoire of the human VH segments J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol 1997,273(4))。抗原结合位点的定义也描述如下：Ruiz等人,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.,28,219-221(2000)；和Lefranc,M.-P.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；MacCallum等人,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,J.Mol.Biol.,262(5),732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203,121-153,(1991)；Pedersen等人,Immunomethods,1,126,(1992)；和Rees等人,In Sternberg M.J.E.(ed.),ProteinStructure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141-172 1996，所有文献均以其全文形式被援引加入本文)。

每当术语“至少”或“大于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”或“大于”适用于该系列数值中的每个数值。

术语“异源的”是指在与其相关的氨基酸或与之关联的核苷酸序列未天然发现的氨基酸或核苷酸序列。

术语“天然”或“天然存在”当应用于对象是指可以在自然界中发现对象的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界中的来源分离出并且未被人为在实验室中故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

每当术语“不超过”或“小于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“不超过”或“小于”适用于该系列数值中的每个数值。

术语“多核苷酸”是指由核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物。核酸类似物包括那些包含非天然存在的碱基、与天然存在的磷酸二酯键以外的其它核苷酸键合的核苷酸、或/和通过磷酸二酯键以外的键连接的碱基。核苷酸类似物的非限制性示例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、磷酰胺、硼酸磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪合成。术语“核酸分子”通常是指较大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指较短的多核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包含不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这也包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

术语“多肽”是指由天然或/和非天然氨基酸残基、其天然存在的结构变体、或/和其合成的非天然存在的类似物组成的聚合物，通过肽键连接。合成多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。多肽也可以在表达编码多肽的核酸序列的细胞中重组产生。术语“蛋白质”通常是指较大的多肽。术语“肽”通常是指较短的多肽。在某些实施例中，肽包含不超过约50、40或30个氨基酸残基。多肽包括抗体及其片段。本文使用常规记法来描绘多肽序列：多肽序列的左手端是氨基(N)-末端；多肽序列的右手端是羧基(C)-末端。

多肽可以包括可以在多肽的合成或细胞生产过程中进行的一种或多种修饰，例如一种或多种翻译后修饰，无论一种或多种修饰是否是故意的。修饰可包括但不限于糖基化(例如，N-连接的糖基化和O-连接的糖基化)、脂化、磷酸化、硫酸化、乙酰化(例如，N-末端的乙酰化)、酰胺化(例如，C-末端的酰胺化)、羟基化、甲基化、分子内或分子间二硫键的形成、两个侧链之间的内酰胺的形成、焦谷氨酸的形成和泛素化。作为另一个示例，多肽可以连接至天然聚合物(例如多糖)或合成聚合物(例如，聚乙二醇[PEG])、脂质化(例如用C

术语“保守取代”是指用功能、结构或化学上相似的天然或非天然氨基酸取代多肽中的氨基酸。在某些实施例中，以下基团各包含彼此保守取代的天然氨基酸：

1)甘氨酸(Gly/G)，丙氨酸(Ala/A)；

2)异亮氨酸(Ile/I)，亮氨酸(Leu/L)，蛋氨酸(Met/M)，缬氨酸(Val/V)；

3)苯丙氨酸(Phe/F)，酪氨酸(Tyr/Y)，色氨酸(Trp/W)；

4)丝氨酸(Ser/S)，苏氨酸(Thr/T)，半胱氨酸(Cys/C)；

5)天门冬酰胺(Asn/N)，谷氨酰胺(Gln/Q)；

6)天冬氨酸(Asp/D)，谷氨酸(Glu/E)；和

7)精氨酸(Arg/R)，赖氨酸(Lys/K)，组氨酸(His/H)。

在其他的实施例中，以下基团各包含彼此保守取代的天然氨基酸：

1)非极性的：Ala，Val，Leu，Ile，Met，Pro(脯氨酸/P)，Phe，Trp；

2)疏水性的：Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp；

3)脂肪族的：Ala，Val，Leu，Ile；

4)芳香族的：Phe，Tyr，Trp，His；

5)不带电荷的极性或亲水性的：Gly，Ala，Pro，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr(酪氨酸可被视为具有极性侧基的疏水氨基酸)；

6)含脂肪族羟基或巯基的：Ser，Thr，Cys；

7)含酰胺的：Asn，Gln；

8)酸性的：Asp，Glu；

9)碱性的：Lys，Arg，His；和

10)小的：Gly，Ala，Ser，Cys。

在其它实施例中，氨基酸可如下分组列出：

1)疏水性的：Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Tyr；

2)芳香族的：Phe，Tyr，Trp，His；

3)中性亲水性的：Gly，Ala，Pro，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln；

4)酸性的：Asp，Glu；

5)碱性的：Lys，Arg，His；和

6)影响骨架方向的残基：Pro，Gly。

相对于亲本多肽具有一个或多个修饰的多肽可以适当地称为亲本多肽的“类似物”、“衍生物”或“变体”。

本公开内容涵盖多肽的药学上可接受的盐，包括具有正净电荷的那些、具有负净电荷的那些以及没有净电荷的那些。

术语“药学上可接受的”是指适合与受试者的组织和器官接触而没有过度刺激、过敏反应、免疫原性和毒性，与合理的收益/风险比相当，并且对预期用途有效的物质(例如，活性成分或赋形剂)。药物组合物的“药学上可接受的”赋形剂或载体也与组合物的其它成分相容。

术语“严格的杂交条件”是指在50％甲酰胺中在5XSSC在42℃的温度下杂交，并在60℃下在0.2XSSC中洗涤过滤器。(1XSSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠。)严格的杂交条件还涵盖较低的离子强度和较高的洗涤温度，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；与变性剂(例如甲酰胺)杂交，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液在pH 6.5在42℃下和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或在42℃的50％甲酰胺，5XSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5X Denhardt’s溶液，超声鲑鱼精子DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％葡聚糖硫酸酯，在42℃下在0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和在55℃下的50％的甲酰胺中洗涤，然后在55℃下由含EDTA的0.1XSSC进行高严格洗涤。

术语“受试者”是指动物，包括但不限于哺乳动物，例如灵长类动物(例如人、黑猩猩或猴子)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、沙鼠或仓鼠)、兔形动物(例如兔子)、猪类(例如猪)、马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗)或猫科动物(例如猫)。

在两个多肽或多核苷酸的上下文中，术语“基本上同源”或“基本上同一”是指当使用序列比较算法或通过目视检查进行测量来比较和排列以获得最大对应性时，具有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸或核酸残基同一性的两个或更多个序列或亚序列。术语“基本上同源”或“基本上同一”可以表示至少约70％的氨基酸或核酸残基同一性。术语“基本上同源”或“基本上同一”可以表示至少约85％的氨基酸或核酸残基同一性。基本同源性或同一性可以存在于长度至少约20、30、40、50、100、150或200个残基的序列区域上。在比较生物聚合物的任一或两者的全长上，序列可以是基本上同源或同一的。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)的寻找相似性方法；通过这些算法的计算机化实现方式(例如，美国威斯康星州麦迪逊市的遗传学计算课题组(Genetics Computer Group)的威斯康星州遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过目视检查来进行。

一种有用的算法示例是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对从一组相关序列中创建多序列比对，以显示关系和百分比序列同一性。它还绘制了树或树状图，显示用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.,35:351-360(1987)的渐进比对方法的简化。所用的方法类似于Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)所描述的方法。该程序可以比对可达约300个序列，每个序列的最大长度约为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序始于两个最相似序列的成对比对，产生两个比对序列的簇。然后将该簇与下一个最相关的序列或比对的序列簇进行比对。通过两个单独序列的成对比对的简单扩展，来比对两个序列簇。最终的比对通过一系列渐进的成对比对实现。通过为序列比较区域指定特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数来运行该程序。例如，可以使用以下参数将参考序列与其它测试序列进行比较，以确定百分比序列同一性关系：默认空位(gap)权重(3.00)、默认空位长度权重(0.10)和加权末端空位。对于产生序列的多重比对有用的另一种算法是Clustal W(参见，例如，Thompson等人,Nucleic Acids Research,22:4673-4680[1994])。

适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个示例是BLAST算法，其描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)。可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高分序列对(HSP)，这些短字在与数据库序列中相同长度的字词比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T称为邻域字得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul 1990)。这些最初的邻域字命中(neighborhood word hits)充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后将字命中(word hits)沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况，将停止字命中在每个方向上的扩展：累积比对得分比其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认值，例如字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值，例如字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915[1989])。

除了计算百分比序列同一性外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5787[1993])。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率[P(N)]，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。在某些实施例中，如果在测试多核苷酸与参考多核苷酸的比较中最小总和概率小于约0.1、0.01或0.001，则认为多核苷酸与参考序列相似。

在一些实施例中，如果两个多肽仅在保守氨基酸取代方面不同，则一个多肽与第二多肽基本上是同源或相同的。在某些实施例中，如本文所述，如果两个多核苷酸在严格条件下或在高度严格条件下彼此杂交，则两个核酸序列基本上是同源或相同的。

术语“治疗有效量”是指化合物的量，当给予受试者时，该量足以预防、降低所治疗的病症发展的风险，延缓发作，减缓发展或引起消退，或在某种程度上减轻病症或该病症的一种或多种症状或并发症。术语“治疗有效量”还指足以引起研究人员、兽医、医生或临床医师寻求的细胞、组织、器官、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物的量。

术语“治疗(treat,treating,treatment)”包括减轻、改善或消除医学病症或与该病症相关的一种或多种症状或并发症，以及减轻、改善或消除该病症的一种或多种原因。提及医学病症的“治疗”包括预防病症。术语“预防”包括防范、降低发展的风险和延迟医学病症或与该病症相关的一种或多种症状或并发症的发作。

II.

本文描述的抗体对海蟾蜍毒素(MBG)具有特异性，并且包括上述所有形式。可以将抗体工程化以用于特定生物体。生物体可以是人、犬科动物或有商业价值的家畜，例如猪、马、狗、猫、鸡或其它鸟类。抗体的此类工程化包括例如使用本领域已知的任何库技术或单克隆技术进行人源化、人工程化、嵌合化或分离人(或其它生物体)抗体。

亲和力成熟可以与本文公开的抗体一起使用以获得期望的亲和力的抗MBG抗体。当从动物(例如，携带人类抗体库的转基因动物)获得抗MBG抗体时，在转基因动物中制备的抗体可以经历亲和力成熟。可替换地，可以使用链改组方法和/或对编码VH和VL的核酸进行突变，然后通过筛选和/或选择具有更大亲和力的抗体，对来自转基因动物或来自其它技术(例如展示技术)的抗体进行亲和力成熟。

使非人类抗体的免疫原性最小化同时保留特异性和亲和力的最广泛使用的方法涉及将非人类抗体的CDR移植到通常根据其与非人类框架的结构同源性选择的人类框架上(Jones等人,1986,Nature 321:522-5；美国专利号5,225,539，二者均以其全文形式被援引加入本文)。最初，这些方法导致亲和力的极大损失。然而，随后结果表明，可以通过在框架中关键位置恢复维持非人类CDR 1和2的规范结构所需的非人类残基来恢复某些亲和力(Bajorath等人,1995,J Biol Chem270:22081-4；Martin等人,1991,MethodsEnzymol.203:121-53；Al-Lazikani,1997,J Mol Biol 273:927-48，所有文献均以其全文形式被援引加入本文)。恢复CDR3的天然构象是一个更加不确定的规划，因为它们的结构更具可变性。

对传统CDR移植方法的改进使用了多种杂种选择方法，其中在连续的几轮选择中，非人类抗体的部分已与互补人类抗体序列的文库结合在一起，以进行抗原结合，在此过程中，大多数非人类序列逐渐被人类序列取代。其它方法包括链替换技术，其中保留了非人类CDR3，仅在执行的步骤中分别替换了其余的V区(包括框架和CDR 1和2)。

通过使用与用于制备用于人类的抗体的CDR移植方法类似的方法，将CDRs工程改造到受试者物种的框架区中，可以使用这些技术来制备适用于非人类受试者的抗体。

嵌合抗MBG抗体可以使用起始抗MBG抗体并将起始抗MBG抗体的可变区移植到所需可变域恒定区上来制备。例如，通过将小鼠VL和VH区与人类恒定区CL(轻链恒定区)和至少CH1(重链恒定区1)结合来制备嵌合抗体。嵌合抗体中使用的VH区为：

EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGTTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARARYGYGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1)

嵌合抗体中使用的VL区为：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:2)

例如，使用CDR制备抗MBG人源化抗体：

VH CDR1:DSITSGYWN(SEQ ID NO:3)

VH CDR2:YISYSGTTYYNPSLKS(SEQ ID NO:4)

VH CDR3:ARYGYGFDY(SEQ ID NO:5)

VL CDR1:RSSQSIVHSNRNTYLE(SEQ ID NO:6)

VL CDR2:KVSNRFS(SEQ ID NO:7)

VL CDR3:FQGSHVPLT(SEQ ID NO:8)

将三个VH CDR放入人类重链可变区的框架序列中以产生VH链：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARYGYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)

将该VH命名为H1。将取代引入SEQ ID NO:9的框架区，以产生两条额外的VH链：

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYIGYISYSGTTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARYGYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYMGYISYSGTTYYNPSLKSRITISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCARARYGYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)

将SEQ ID NO:10命名为H2并将SEQ ID NO:11命名为H3。

将三个VL CDR置于轻链中人类可变区的框架序列中，以产生VL链：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNRNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:12)

将SEQ ID NO:12命名为L1。将取代引入SEQ ID NO:12的框架区中，以产生额外的VL链：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNRNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:13)

将SEQ ID NO:13命名为L2。VL链SEQ ID NO:12与每条HL链(SEQID NO:9、10和11)结合，以产生三种不同的抗体(H1L1、H2L1和H3L1)。VL链SEQ ID NO:13也与每条HL链(SEQID NO:9、10和11)结合，以产生三种不同的抗体(H1L2、H2L2和H3L2)。

从人类展示文库中获得人抗MBG抗体。获得了十四种抗MBG抗体，这十四种人抗体重链和轻链的序列如下。命名为236/237的人抗体具有VH和VL序列：

236/237VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARYNWNYVLFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:14)

236/237VL

QAVLTQPSSVSAAPRQRVTISCSGSASNIGRNGVSWYHQVPGKAPRLLLSHDGLVTSGVPDRLSVSKSGTSASLAISGLHSDDEGDYYCAVWDDSLNAVVFGGGTKLTVLS

(SEQ ID NO:15)

236/237VH的VH CDR序列为：

236/237VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

236/237VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

236/237VH CDR3 ARARYNWNYVLFDY(SEQ ID NO:18)

236/237VL的VL CDR序列为

236/237VL CDR1 ASNIGRNG(SEQ ID NO:19)

236/237VL CDR2 HDG(SEQ ID NO:20)

236/237VL CDR3 AVWDDSLNAVV(SEQ ID NO:21)

命名为201/202的人抗体具有VH和VL序列：

201/202VH

QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARASIAARTFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:22)

201/202VL

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:23)

201/202VH的VH CDR序列为：

201/202VH CDR1 GGSISSGGYY(SEQ ID NO:24)

201/202VH CDR2 IYYSGNT(SEQ ID NO:25)

201/202VH CDR3 ARASIAARTFDY(SEQ ID NO:26)

201/202VL的VL CDR序列为

201/202VL CDR1 SSNIGNNY(SEQ ID NO:27)

201/202VL CDR2 DNN(SEQ ID NO:28)

201/202VL CDR3 GTWDSSLSAYV(SEQ ID NO:29)

命名为203/204的人抗体具有VH和VL序列：

203/204VH

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLQLKSVTPEDTAVYYCARVRPPAATFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:30)

203/204VL

QSVVTQPPSVSAAPGQKVSISCSGGSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPRLLIYENNNRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLRAVVFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO:31)

203/204VH的VH CDR序列为：

203/204VH CDR1 GGSISSYY(SEQ ID NO:32)

203/204VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

203/204VH CDR3 ARVRPPAATFDY(SEQ ID NO:33)

203/204VL的VL CDR序列为

203/204VL CDR1 SSNIGNNY(SEQ ID NO:27)

203/204VL CDR2 ENN(SEQ ID NO:34)

203/204VL CDR3 GTWDSSLRAVV(SEQ ID NO:35)

命名为206/208的人抗体具有VH和VL序列：

206/208VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVNLRGAFDIWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:36)

206/208VL

QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYENNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO:37)

206/208VH的VH CDR序列为：

206/208VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

206/208VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

206/208VH CDR3 ARVNLRGAFDI(SEQ ID NO:38)

206/208VL的VL CDR序列为

206/208VL CDR1 SSNIGAGYD(SEQ ID NO:39)

206/208VL CDR2 ENN(SEQ ID NO:34)

206/208VL CDR3 GTWDSSLSAVV(SEQ ID NO:40)

命名为238/239的人抗体具有VH和VL序列：

238/239VH

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVVVARTGTTISWFDPWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:41)

238/239VL

QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVDTYRIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCVIWHSSAWVFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO:42)

238/239VH的VH CDR序列为：

238/239VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

238/239VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

238/239VH CDR3 ARVVVARTGTTISWFDP(SEQ ID NO:43)

238/239VL的VL CDR序列为

238/239VL CDR1 SGINVDTYR(SEQ ID NO:44)

238/239VL CDR2 YKSDSDK(SEQ ID NO:45)

238/239VL CDR3 VIWHSSAWV(SEQ ID NO:46)

命名为240/241的人抗体具有VH和VL序列：

240/241VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLRYSSGWYADPWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:47)

240/241VL

LPVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQLPGTAPKLLIYNNNQRPSGVPDRFSGSKSGASASLAISGLQSEDEADYYCVAWDGSLSGVVFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO:48)

240/241VH的VH CDR序列为：

240/241VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

240/241VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

240/241VH CDR3 ARLRYSSGWYADP(SEQ ID NO:49)

240/241VL的VL CDR序列为

240/241VL CDR1 SSNIGSNI(SEQ ID NO:50)

240/241VL CDR2 NNN(SEQ ID NO:51)

240/241VL CDR3 VAWDGSLSGVV(SEQ ID NO:52)

命名为205/207的人抗体具有VH和VL序列：

205/207VH

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARFHTWAPRAFDIWGQGTMVTVSS

(SEQ ID NO:53)

205/207VL

QSVVTQPPSVSAAPGQEVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSALFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO:54)

205/207VH的VH CDR序列为：

205/207VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

205/207VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

205/207VH CDR3 ARFHTWAPRAFDI(SEQ ID NO:55)

205/207VL的VL CDR序列为

205/207VL CDR1 SSNIGNNY(SEQ ID NO:27)

205/207VL CDR2 DNN(SEQ ID NO:28)

205/207VL CDR3 GTWDSSLSAL(SEQ ID NO:56)

命名为R4CE-1E的人抗体具有VH和VL序列：

R4CE-1E VH

QVQLQESGSGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSSGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVQLWQRGFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:57)

R4CE-1E VL

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDVGVYYCMQALQAPLTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:58)

R4CE-1E VH的VH CDR序列为：

R4CE-1E 8VH CDR1 GGSISSSGYY(SEQ ID NO:59)

R4CE-1E 8VH CDR2 IYHSGST(SEQ ID NO:60)

R4CE-1E 8VH CDR3 ARVQLWQRGFDY(SEQ ID NO:61)

R4CE-1E VL的VL CDR序列为

R4CE-1E 8VL CDR1 QSLLHSNGYNY(SEQ ID NO:62)

R4CE-1E 8VL CDR2 LGS(SEQ ID NO:63)

R4CE-1E 8VL CDR3 MQALQAPLT(SEQ ID NO:64)

命名为2A-F8的人抗体具有VH和VL序列：

2A-F8 VH

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVTWSDYRDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:65)

2A-F8 VL

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSRRVAWFQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:66)

2A-F8 VH的VH CDR序列为：

2A-F8 9VH CDR1 GGSFSGYY(SEQ ID NO:67)

2A-F8 9VH CDR2 INHSGST(SEQ ID NO:68)

2A-F8 9VH CDR3 VTWSDYRDY(SEQ ID NO:69)

2A-F8 VL的VL CDR序列为

2A-F8 9VL CDR1 QSVTSRR(SEQ ID NO:70)

2A-F8 9VL CDR2 GAS(SEQ ID NO:71)

2A-F8 9VL CDR3 QQYGSSPLT(SEQ ID NO:72)

命名为R4CE-7G的人抗体具有VH和VL序列：

R4CE-7G VH

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGGTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARTTYSYGPGFDPWGQGTLVTVSSASTKG

(SEQ ID NO:73)

R4CE-7G VL

QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGTYYVSWYQQFPGTVPKLLIYDNTQRPSEIPDRFSASKSGTSVTLDITGLQTGDEGDYYCATWDSNLKSVVFGGGTKVAVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

(SEQ ID NO:74)

R4CE-7G的VH CDR序列为：

R4CE-7G 10VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

R4CE-7G 10VH CDR2 IYYSGGT(SEQ ID NO:75)

R4CE-7G 10VH CDR3 ARTTYSYGPGFDP(SEQ ID NO:76)

R4CE-7G的VL CDR序列为

R4CE-7G 10VL CDR1 SSNIGTYY(SEQ ID NO:77)

R4CE-7G 10VL CDR2 DNT(SEQ ID NO:78)

R4CE-7G 10VL CDR3 ATWDSNLKSVV(SEQ ID NO:79)

命名为R4CE-10H的人抗体具有VH和VL序列：

R4CE-10H VH

QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVMYYYGSGSPYWYFDLWGRGTLVTVSS

(SEQ ID NO:80)

R4CE-10H VL

QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGKNFVSWYQQFPGTAPKFLIYENSKRPSGIPDRISGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSY

(SEQ ID NO:81)

R4CE-10H的VH CDR序列为：

R4CE-10H 11VH CDR1 GGSISSGGYY(SEQ ID NO:82)

R4CE-10H 11VH CDR2 IYHSGST(SEQ ID NO:83)

R4CE-10H 11VH CDR3 ARVMYYYGSGSPYWYFDL(SEQ ID NO:84)

R4CE-10H的VL CDR序列为

R4CE-10H 11VL CDR1 SSNIGKNF(SEQ ID NO:85)

R4CE-10H 11VL CDR2 ENS(SEQ ID NO:86)

R4CE-10H 11VL CDR3 GTWDSSLSAVV(SEQ ID NO:40)

命名为1B-6C的人抗体具有VH和VL序列：

1B-6C VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSLTAADTAVYYCARVPAIRSSAIFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:87)

1B-6C VL

QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCFGSRSNIGNNYVSWYQQFPGTAPQLLIFDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLGITGVQTGDEAEYYCGAWDSSLSAGAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

(SEQ ID NO:88)

1B-6C的VH CDR序列为：

1B-6C-12VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

1B-6C-12VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

1B-6C-12VH CDR3 ARVPAIRSSAIFDY(SEQ ID NO:89)

1B-6C的VL CDR序列为

1B-6C-12VL CDR1 RSNIGNNY(SEQ ID NO:90)

1B-6C-12VL CDR2 DNN(SEQ ID NO:28)

1B-6C-12VL CDR3 GAWDSSLSAGAV(SEQ ID NO:91)

命名为1B-6E的人抗体具有VH和VL序列：

1B-6E-13VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVAPYSSSPSFDYWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO:92)

1B-6E VL

LPVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRNTGNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS

(SEQ ID NO:93)

1B-6E的VH CDR序列为：

1B-6E-13VH CDR1 GYSISSGYY(SEQ ID NO:94)

1B-6E-13VH CDR2 IYHSGST(SEQ ID NO:95)

1B-6E-13VH CDR3 ARVAPYSSSPSFDY(SEQ ID NO:96)

1B-6E的VL CDR序列为

1B-6E-13VL CDR1 SSNIGRNT(SEQ ID NO:97)

1B-6E-13VL CDR2 SNN(SEQ ID NO:98)

1B-6E-13VL CDR3 AAWDDSLNGVV(SEQ ID NO:99)

命名为2A-5A的人抗体具有VH和VL序列：

2A-5A VH

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARFSRGGPFLWGRGTLVTVSS

(SEQ ID NO:100)

2A-5A VL

QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGSYSVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAYVFGSGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

(SEQ ID NO:101)

2A-5A的VH CDR序列为：

2A-5A-14VH CDR1 GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)

2A-5A-14VH CDR2 IYYSGST(SEQ ID NO:17)

2A-5A-14VH CDR3 ARFSRGGPFL(SEQ ID NO:102)

2A-5A的VL CDR序列为

2A-5A-14VL CDR1 SSNIGSYS(SEQ ID NO:103)

2A-5A-14VL CDR2 DNN(SEQ ID NO:28)

2A-5A-14VL CDR3 GTWDSSLSAYV(SEQ ID NO:29)

人VH区中的八个具有GGSISSSSYY(SEQ ID NO:16)的相同CDR1。人VH区中的八个具有IYYSGST(SEQ ID NO:17)的相同CDR2。人VL区中的四个具有DNN(SEQ ID NO:28)的相同CDR2。人VL区中的三个具有SSNIGNNY(SEQ ID NO:27)的相同CDR1。可以将人抗体的上述CDR序列移植到来自其它物种的抗体的框架区上。上述人CDR序列也可以以组合方式混合和匹配以制备新的抗MBG抗体。还可以使用例如吝啬突变(parsimonious mutagenesis)(例如Balint和Larrick，1993)使人抗MBG抗体亲和力成熟，以获得对MBG具有更大结合亲和力的抗MBG抗体。

本文公开的任何抗MBG抗体都可以采用多种形式，包括例如抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和其它消化片段，以及重组片段例如，scFv、双抗体、三抗体、四抗体、Bis-scFv、微型抗体、Fab2或Fab3)或全长抗体，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG全长抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。全长IgA可以是IgA1或IgA2。

本公开内容涵盖抗MBG抗体的药学上可接受的盐，包括具有正净电荷的那些、具有负净电荷的那些和不具有净电荷的那些，并且包括但不限于抗MBG抗体的盐，包括其片段作为化合物，在药物组合物中，在其治疗和诊断用途以及在其生产中。

III.

抗MBG抗体可包括延长抗体片段的半衰期(T

在某些实施例中，抗MBG抗体片段包括单个部分。在其它实施例中，抗MBG抗体片段包括两个或更多个基本相似或相同的部分或两个或更多个相同类型的部分。在其它实施例中，抗MBG抗体片段包括两个或更多个不同类型的部分，或两个或更多个部分的不同类型。

部分可以是与新生儿Fc受体(FcRn)结合的人血清白蛋白(HSA)或其一部分(例如，结构域III)。HSA的标称血清半衰期约为19天，这部分是由于其分子量(MW)为约67kDa和它的高度阴离子表面。

蛋白质与HSA的共价或非共价结合可赋予额外好处。例如，HSA可以保护蛋白质，从而使蛋白质不易受到蛋白水解切割的影响，免疫原性也较低。

主要的FcRn结合位点位于HSA的结构域III中。结构域III跨越了609-aa全长HSA的388-585位。结构域I还有助于HSA与FcRn结合，这可以部分解释为什么结构域III作为单个结构域对FcRn的亲和力比全长HSA低约10倍。

HSA或其FcRn结合部分可以可选地具有一种或多种赋予有益特性或作用的突变。在一些实施例中，HSA或其FcRn结合部分具有一种或多种增强pH依赖性HSA与FcRn的结合或/和增加HSA半衰期的突变，例如K573P或/和E505G/V547A。

HSA或其FcRn结合部分可以连接至抗MBG抗体片段上的任何合适的位置或位点。在一些实施例中，将HSA或其FcRn结合部分可选地通过接头重组融合或化学缀合至抗MBG抗体片段的重链或/和轻链的N端或/和C端。

在其它的实施例中，延长部分包括或为非共价结合白蛋白(HAS)的部分。将抗MBG抗体片段连接至白蛋白结合部分可使抗体片段享有与将抗体片段连接至HSA相同的益处。此外，与HSA的非共价结合使得能够从HSA-抗体片段复合物中缓慢且持续地释放抗体片段。另外，白蛋白结合部分能够基于与白蛋白的结合亲和纯化抗体片段。

在其它实施例中，延长部分包括或为非结构化多肽。非结构化多肽与蛋白质的连接通过增加其分子量、流体动力学半径/体积和整体大小来增加其半衰期，从而减少其肾脏清除率。非结构化多肽一般具有骨架和侧链，骨架在体温下在水溶液中采用随机链构象，而侧链具有较低的趋势参与与水分子的相互作用以外的分子内相互作用或分子间相互作用，而水分子通常倾向于在生理条件下具有不带电的侧链的较小的亲水性氨基酸。疏水性氨基酸可参与分子内相互作用或分子间相互作用，包括与细胞膜和细胞组分的非特异性疏水相互作用。在不带电荷的亲水性氨基酸中，苏氨酸可形成β片，半胱氨酸可形成二硫键，酪氨酸相当大并且其苯环可参与疏水相互作用，天冬酰胺和谷氨酰胺可形成聚集体。

可以将非结构化多肽连接至抗MBG抗体片段上的任何合适的位置或位点。在一些实施例中，将非结构化多肽可选地通过接头重组融合或化学缀合至抗MBG抗体片段的重链或/和轻链的N端或/和C端。同样，抗MBG抗体片段可以连接至非结构化多肽上的任何合适的位置或位点。在一些实施例中，将抗MBG抗体片段可选地通过接头重组融合或化学缀合至非结构化多肽的N端或C端。

在其它实施例中，延长部分包括或为衍生自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β亚基的羧基末端肽(CTP)。相对于hCG-βCTP，延长的CTP(附着在蛋白质上的CTP作为延长的部分)可以具有hCG-βCTP的野生型序列，或可以具有一个或多个取代、添加或缺失，或其任何组合或全部。CTP可以连接到抗MBG抗体片段上的任何合适位置或位点。在一些实施例中，将CTP可选地通过接头重组融合或化学缀合至抗MBG抗体片段的重链或/和轻链的N端或/和C端。同样，抗MBG抗体片段可以连接到CTP上的任何合适的位置或位点。在一些实施例中，将抗MBG抗体片段可选地通过接头重组融合或化学缀合至CTP的N端或C端。

在一些实施例中，将多肽延长部分可选地通过接头重组融合至抗MBG抗体片段的重链或轻链的N端或C端。多肽延长部分与抗体片段的重组融合有利于生产，避免额外的缀合和纯化步骤，并使产物异质性最小。在某些实施例中，多肽延长部分通过接头重组融合至抗MBG抗体片段。接头/间隔基减少空间位阻并促进抗体片段和延长部分的独立功能。接头的使用还可以增强融合蛋白的表达。在某些实施例中，接头包含约4-30个氨基酸残基。在某些实施例中，接头包含从约6或8个氨基酸残基至约20个氨基酸残基，或从约6或8个氨基酸残基至约15个氨基酸残基。

在其它实施例中，延长部分包括或为合成聚合物的1、2、3、4、5或更多个部分。合成聚合物可以是可生物降解的或不可生物降解的。可用作延长部分的可生物降解的聚合物包括但不限于，聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)(PMPC)和聚[寡(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)(POEGMA)。用作延长部分的不可生物降解的聚合物包括但不限于聚(乙二醇)(PEG)、聚甘油、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯)(PHPMA)、聚恶唑啉和聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)。

在一些实施例中，合成聚合物包括或为PEG。一个或多个PEG部分与蛋白质的缀合可通过增加其分子量、流体动力学半径/体积和整体大小来延长其半衰期，从而减少其肾脏清除率。聚乙二醇化可以增加溶解度，减少聚集和免疫原性，并避免蛋白质的吞噬作用。PEG是柔韧的，不带电荷且不可生物降解，具有相对较低的免疫原性，并已获得美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration)的批准为GRAS(一般认为是安全的)。一个或多个PEG部分独立地可以是直链或支链的。此外，一个或多个PEG部分可独立地终止于羟基、甲氧基(mPEG)或另一个封端基团。

在一些实施例中，一种或多种合成聚合物部分的单独质量(例如，平均分子量)或总质量为约10-50、10-20、20-30、30-40或40-50kDa，或约10、20、30、40或50kDa。一个或多个合成聚合物部分的单独质量(例如，平均分子量)或总质量也可以大于约50kDa，例如约50-100、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100kDa，或约60、70、80、90或100kDa。此外，单个合成聚合物部分的质量(例如，平均分子量)可以小于约10kDa，例如约1-5或5-10kDa，或约5kDa。在某些实施例中，一个或多个合成聚合物(例如PEG)部分的单独质量(例如，平均分子量)或总质量为约20或40kDa。可以基于合成聚合物的长度来调节修饰蛋白质的半衰期，其中更长的聚合物一般赋予更长的半衰期。

可以将一个或多个合成聚合物部分偶联至抗MBG抗体片段上的任何合适的位置或位点。在一些实施例中，一个或多个合成聚合物部分可选地通过接头化学缀合至抗MBG抗体片段的重链或/和轻链的N端、C端或/和一个或多个侧链[例如，可接近的赖氨酸侧链氨基或半胱氨酸硫醇基]。

在一些实施例中，包括一个或多个延长部分的抗MBG抗体片段是sdAb、scFv、Fv或Fab。在某些实施例中，抗MBG抗体片段是Fab 2A-F8。

作为非限制性示例，可将非人(例如鼠)、人源化或人MBG结合V

IV.

本公开的其它实施例涉及药物组合物，其包括本文所述的嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。组合物可以可选地包含另外的治疗剂。一般，药物组合物包含治疗有效量的抗MBG抗体或其片段、一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体，以及可选地治疗有效量的另外的治疗剂，并被配制用于向受试者施用用于治疗用途。还可以将抗MBG抗体或其片段施用于受试者以用于诊断用途，例如用于成像。

药物组合物一般根据现行的良好生产规范(GMP)来制备，例如，联邦食品、药品和化妆品法案§501(a)(2)(B)和国际协调会议Q7指导方针的建议或要求。

药物组合物/制剂可以无菌形式制备。例如，用于通过注射或输液肠胃外施用的药物组合物/制剂一般是无菌的。根据本领域技术人员已知的药物级灭菌标准，例如在美国药典第797、1072和1211章以及21Code of Federal Regulations211中公开或要求的那些，合成或制造无菌药物组合物/制剂。

药学上可接受的赋形剂和载体包括药学上可接受的物质、材料和媒介物。赋形剂类型的非限制性示例包括液体和固体填充剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、表面活性剂、分散剂、崩解剂、乳化剂、湿润剂、悬浮剂、增稠剂、溶剂、等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、吸收延迟剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抗微生物剂、抗菌剂、抗真菌剂、螯合剂、助剂、甜味剂、调味剂、着色剂、包封材料和涂层材料。此类赋形剂在药物制剂中的使用是本领域已知的。例如，传统的媒介物和载体包括但不限于油(例如，植物油，例如橄榄油和芝麻油)、水性溶剂{例如，盐水、缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水[PBS])和等渗溶液(例如，Ringer溶液)}和有机溶剂(例如，二甲基亚砜[DMSO]和醇[例如，乙醇、甘油和丙二醇])。除了就目前而言任何传统赋形剂或载体与抗MBG抗体或其片段不相容之外，本公开内容涵盖传统赋形剂和载体在含有抗MBG抗体或其片段的制剂中的使用。参见例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins(Philadelphia,Pennsylvania)(2005)；Handbook of Pharmaceutical Excipients,5th Ed.,Rowe等人,Eds.,The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association(2005)；Handbook of Pharmaceutical Additives,3rd Ed.,Ash and Ash,Eds.,GowerPublishing Co.(2007)；以及Pharmaceutical Pre-formulation and Formulation,Gibson,Ed.,CRC Press(Boca Raton,Florida)(2004)。

适当的制剂可以取决于多种因素，例如选择的给药途径。包含抗MBG抗体或其片段的药物组合物的潜在给药途径包括但不限于口服的、肠胃外的(包括皮内的、皮下的、肌内的、血管内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的、髓内的、鞘内的和局部的)、腔内的、和局部的(包括皮肤/表皮的、经皮的、粘膜的、经粘膜的、鼻内的(例如，通过鼻喷剂或滴剂)、眼内的(例如，通过眼药水)、肺部的(例如，通过口服或经鼻吸入)、口腔的、舌下的、直肠的[例如，通过栓剂]和阴道的[例如，通过栓剂])。可将局部制剂设计成产生局部或全身治疗作用。在某些实施例中，抗MBG抗体或其片段通过注射(例如以推注)或在一段时间内输注肠胃外(例如，静脉内，皮下，肌内或腹膜内)施用。

可用于制备肠胃外制剂的赋形剂和载体包括但不限于溶剂(例如水性溶剂，例如水、盐水、生理盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、平衡盐溶液(例如Ringer's BSS)和右旋糖水溶液)、等渗/等渗剂(例如盐[例如，NaCl、KCl和CaCl

赋形剂可以可选地包括一种或多种增加蛋白质稳定性、增加蛋白质溶解度、抑制蛋白质聚集或降低溶液粘度的物质，或其任何组合或全部。此类物质的示例包括但不限于亲水性氨基酸(例如精氨酸和组氨酸)、多元醇(例如肌醇，甘露醇和山梨糖醇)、糖类{例如葡萄糖(包括D-葡萄糖[右旋糖])、乳糖、蔗糖和海藻糖}、渗透剂(例如海藻糖、牛磺酸、氨基酸[例如甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸和γ-氨基丁酸]和甜菜碱[例如三甲基甘氨酸和三甲胺N-氧化物]和非离子表面活性剂{例如烷基多糖苷、

对于肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)给药，可以预先制备抗MBG抗体或其片段在含有一种或多种赋形剂的水性溶剂中的无菌溶液或悬浮液，并可以在例如预装注射器中提供。可替换地，可以在冻干(冷冻干燥)之前将抗MBG抗体或其片段溶解或悬浮在水性溶剂中，所述水性溶剂可以可选地包含一种或多种赋形剂。肠胃外给药前不久，可以用例如无菌水重构储存在合适容器(例如小瓶)中的冻干的抗MBG抗体或其片段，所述无菌水可以可选地包含一种或多种赋形剂。如果抗MBG抗体或其片段要通过输注(例如静脉内)给药，则可以将重构的抗MBG抗体或其片段的溶液或悬浮液添加至含有例如无菌盐水(例如约0.9％NaCl)的输液袋中并在其中稀释。

增强较小蛋白质的透粘膜渗透的赋形剂包括但不限于环糊精、烷基糖类(例如烷基糖苷和烷基麦芽糖苷[例如十四烷基麦芽糖苷])和胆汁酸(例如胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、甘脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和脱氢胆酸)。

增强较小蛋白质的经上皮或经皮渗透的赋形剂包括但不限于化学渗透增强剂(CPE，包括脂肪酸[例如油酸])、细胞穿透肽{CPP，包括富含精氨酸的CPP[例如聚精氨酸，例如R

在一些实施例中，抗MBG抗体或其片段是从持续释放的组合物中递送的。如本文所使用的，术语“持续释放的组合物”涵盖持续释放、长期释放、延长释放、缓慢释放和控制释放的组合物、系统和设备。蛋白质递送系统在例如Banga(在上)中讨论。持续释放的组合物可以在持久的时间内递送治疗有效量的抗MBG抗体或其片段。在一些实施例中，持续释放的组合物在至少约3天、1周、2周、3周、1个月(4周)、6周、2个月、3个月或更长的时间内递送抗MBG抗体或其片段。持续释放的组合物可以例如肠胃外(例如静脉内、皮下或肌肉内)给药。

蛋白质的持续释放的组合物可以是例如颗粒系统、脂质或油性组合物或植入物的形式。颗粒系统包括但不限于纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、微粒、微球和微胶囊。纳米颗粒系统一般具有小于约1μm的直径或等效尺寸。在某些实施例中，纳米颗粒、纳米球或纳米胶囊的直径或等效尺寸不超过约500、400或300nm，或不超过约200、150或100nm。在一些实施例中，微粒、微球或微胶囊的直径或等效尺寸为约1-200、100-200或50-150μm，或约1-100、1-50或50-100μm。纳米或微胶囊通常在中央核心中包含治疗剂，而治疗剂通常分散在整个纳米或微粒或球体中。在某些实施例中，静脉内施用纳米颗粒系统，而皮下或肌内施用微粒系统。

在一些实施例中，持续释放的颗粒系统或植入物由可生物可降解的聚合物或/和水凝胶制成。在某些实施例中，可生物降解的聚合物包括乳酸或/和乙醇酸[例如，基于L-乳酸的共聚物，例如聚(L-丙交酯-共-乙交酯)或聚(L-乳酸-共-D，L-2-羟基辛酸)]。可以构成水凝胶的聚合物的非限制性示例包括聚乙烯醇、丙烯酸酯聚合物(例如聚丙烯酸钠)和具有相对大量亲水基团(例如羟基或/和羧酸基)的其它均聚物和共聚物。可以选择颗粒系统或植入物的可生物降解的聚合物，以使该聚合物在预计治疗期结束时会基本完全降解，并且使聚合物降解的副产物(如聚合物)具有生物相容性。

可替换地，蛋白质的持续释放的组合物可以由不可生物降解的聚合物组成。不可生物降解的聚合物的示例包括但不限于泊洛沙姆(例如泊洛沙姆407)。蛋白质的持续释放的组合物可以由其它天然或合成的物质或材料组成，例如羟磷灰石。

蛋白质的持续释放的脂质或油性组合物可以是例如脂质体、微团(例如，由可生物降解的天然或/和合成聚合物构成的那些，例如乳糖体(lactosomes))和在油中的乳剂的形式。

可以将持续释放的组合物配制成或设计为储库，其可以例如皮下或肌内注射或植入。储库可以是例如聚合物颗粒系统、聚合物植入物或脂质或油性组合物的形式。储库制剂可以在生物相容性溶剂系统中包括蛋白质和例如生物可降解的聚合物[例如聚(丙交酯-共-乙交酯)]或半生物可降解的聚合物(例如乳酸和PEG的嵌段共聚物)的混合物，无论这种混合物是否形成颗粒系统或植入物。

药物组合物可以以单剂量单位剂型存在，其中所有活性和非活性成分在合适的系统中结合，并且不需要混合组分以形成待施用的组合物。单位剂型一般包含有效剂量的治疗剂。单位剂型的代表性示例是一次性使用的笔(pen)，其包括用于胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌内)注射治疗剂的预充式注射器、针头和针头套。

可替换地，可以将药物组合物作为试剂盒提供，其中将治疗剂、赋形剂和载体(例如溶剂)提供在两个或多个单独的容器(例如安瓿、小瓶、管、瓶或注射器)中，并且需要组合以形成待施用的组合物。试剂盒可以包含用于储存、制备和施用组合物(例如，要静脉内或皮下注射的溶液)的用法说明。

试剂盒可以以单位剂型包含所有活性和非活性成分，或者在两个或多个单独的容器中包含活性成分和非活性成分，并且可以包含用于施用或使用药物组合物治疗医学病症的用法说明。

在一些实施例中，试剂盒包含抗MBG抗体或其片段或包括抗MBG抗体或其片段的药物组合物，以及用于施用或使用抗MBG抗体或其片段或包括抗MBG抗体或其片段的药物组合物以治疗MBG相关疾病的说明书。

V.

可以将上述抗MBG抗体施用于患有MBG相关疾病或综合症的受试者。当受试者是人时，抗MBG抗体可以是嵌合小鼠-人抗体、人源化抗体或人抗体。此类嵌合、人源化和人抗体如上所述。MBG相关疾病和综合征包括，例如急性呼吸窘迫综合征、外伤性脑损伤、高血压(例如原发性高血压)、高血压相关疾病(例如先兆子痫)和纤维化相关疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病性肾病)。MBG相关疾病还包括有败血症、创伤以及复杂的严重肺炎和烧伤背景的重症患者。

海蟾蜍毒素(MBG)水平升高与患有急性呼吸窘迫综合征的受试者有关。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种危及生命的疾病，患病率为每100,000人每年64例，死亡率为40-52％。可以通过向受试者施用抗MBG抗体来解决急性呼吸窘迫综合征的MBG相关影响。抗MBG抗体从受试者去除MBG，因此降低了升高的MBG水平。MBG水平的降低应减少MBG升高带来的有害影响。

海蟾蜍毒素(MBG)水平升高与患有外伤性脑损伤(例如脑震荡)的受试者有关。MBG不仅引发炎症，而且维持炎症反应。外伤性脑损伤与血脑屏障渗透性增加有关，MBG可以穿过BBB并进入中枢神经系统。全身性或直接向CNS施用抗MBG抗体可通过清除系统中的MBG来降低CNS中的MBG(并通过允许更多CNS MBG进入血液来降低CNS MBG)，或通过抗体介导的清除降低CNS中的MBG。MBG水平的降低可以减轻受试者中的CNS炎症，并降低CNS中其它MBG相关的影响。

原发性高血压，也称为原发性或自发性高血压，影响约90-95％的高血压患者。原发性高血压主要是由于血管收缩或容量扩张引起的(Laragh 1982)。容量扩张是由于钠和水保留增加导致血液中流体的增加。过度容量扩张可能由例如患有充血性心力衰竭(CHF)、肾功能衰竭或肝功能衰竭等疾病的患者中高饮食NaCl摄入或钠处理能力受损引起。海蟾蜍毒素(MBG)是一种强心类固醇(CTS)，其作用类似于洋地黄。MBG是血压的重要调节剂，与高血压和高血压相关疾病的发病机制有关。MBG是有效的血管收缩剂(Bagrov,EJP 1995)。此外，容量扩张诱发MBG的合成和分泌，包括与容量扩张相关的症状，例如原发性高血压、原发性醛固酮增多症、先兆子痫(PE)、CHF和慢性肾功能衰竭(Bagrov 2009)。MBG是先兆子痫的病因，例如，通过诱发血管收缩和血管纤维化。向正常妊娠大鼠施用MBG导致血压升高，类似于在饮用盐水并注射了醛固酮前体脱氧皮质酮乙酸酯(DOCA)的妊娠大鼠中观察到的血压升高，这是PE的容量扩张大鼠模型(Vu 2005)。PE患者的血浆MBG水平比血压正常的孕妇高5倍，并且血浆MBG水平与PE严重程度相关联(Lopatin 1999和Agunanne 2011)。此外，原发性高血压或CHF患者的血浆MBG水平增加7倍，而慢性肾功能衰竭患者的血浆MBG水平增加70倍以上(Puschett,AJKD 2010)。

血浆MBG水平升高与各种疾病相关，其特征在于Na

MBG抑制细胞滋养层(CTB)细胞的增殖、迁移和侵袭，这对于正常的胎盘发育至关重要(LaMarca 2006和Uddin，Placenta 2008)。在所有分娩的大约7％中，PE表征为CTB细胞无法侵入子宫及其血管系统，尤其是血管内CTB细胞应侵入的螺旋动脉。这导致通过胎盘流向胎儿的血流量减少，这可能导致子宫内生长受限(IUGR)。此外，MBG与NKA的结合诱导p38介导的细胞凋亡和绒毛外CTB细胞系中的应激信号传导(Ehrig 2015)。此外，在绒毛外CTB细胞系中，MBG诱导由MAPK p38和c-Jun NH

此外，MBG通过诱导内皮细胞凋亡并破坏内皮细胞之间的紧密连接而引起内皮功能障碍，其增加PE的血管渗透性/渗漏特性(Uddin,AJN and AJPRICP2009)。内皮功能障碍以及血管炎症还会导致高血压中外周血管阻力增强和血管损伤(Versari 2009和Marchesi2008)。

MBG与NKA结合会刺激EGFR介导的细胞信号传导，其导致氧化应激和纤维化(Bagrov 2008)。MBG诱导肾脏和心血管组织的纤维化，包括尿毒症性心肌病中的心脏纤维化(Kennedy 2006和Elkareh 2007和2009)。纤维化是在器官或组织中的修复或反应过程中通常响应于损伤或炎症而形成的过量纤维结缔组织。纤维化涉及刺激的成纤维细胞铺设结缔组织，包括胶原蛋白和糖胺聚糖。胶原蛋白和弹性蛋白是结缔组织中的主要纤维硬蛋白。转录因子Fli-1是前胶原I和III的转录的负调节剂(抑制因子)，并抑制TGF-β诱导的胶原蛋白合成(Kubo 2003和Czuwara-Ladykowska 2001)。如上所述，低浓度的MBG与成纤维细胞上的NKA结合导致PLC激活，然后激活PKC-δ。PKC-δ的激活诱导其易位到细胞核中，在此磷酸化Fli-1，从而使Fli-1易于蛋白水解降解。磷酸化的Fli-1的蛋白水解导致前胶原I和III的表达增加以及胶原蛋白的合成，从而导致纤维化(Elkareh 2009)。I型胶原蛋白是人体中最丰富的胶原蛋白，形成胶原蛋白纤维，并存在于疤痕组织中。III型胶原蛋白存在于可扩展的结缔组织(例如肺、皮肤和血管系统)中，通常与I型胶原蛋白相联。Fli-1参与了一系列纤维化疾病的发病机制，包括局部性和全身性硬皮病，其中Fli-1缺乏促进了纤维化皮肤和血管病变中胶原蛋白的产生(Kubo 2003和Asano AJP and JDS 2010)。

MBG诱导PE的血管纤维化(Nikitina 2011)，并且动脉僵硬是先兆子痫和慢性高血压妊娠的特征(Tihtonen 2006和Kaihura 2009)。来自PE患者的脐动脉表现出Fli-1表达降低、前胶原I和III表达增加、以及内皮素-1诱导的血管收缩后对硝普钠的血管舒张作用的反应减弱，并且用1和10nM MBG持续24小时体外治疗正常脐动脉外植体可模仿PE的相同特性(Nikitina 2011)。

MBG触发肾皮质的肾小球周围和肾小管周围纤维化，并在肾皮质髓交界处形成纤维化瘢痕(部分通过在肾上皮细胞中诱导上皮向间质转化(EMT))(Fedorova 2009)。亚纳摩尔浓度的MBG通过正常的肾脏和心脏成纤维细胞有效刺激胶原蛋白的合成(Elkareh 2009和2007)。NKA结合Src激酶并起信号复合物的作用，以响应CTS(例如MBG)与肾脏和心血管细胞上NKA的结合(Tian 2006)。Src的激活是成纤维细胞诱导胶原蛋白合成所必需的(Elkareh 2007)。

纤维化损害受影响的器官(例如心脏或肾脏)或组织(例如血管系统或肾小管系统)的结构和功能。关于DN，MBG与肾成纤维细胞和肾上皮细胞(包括肾小管系统的那些)上的NKA结合，并且在低浓度下，MBG诱导NKA/Src引发的信号级联反应，导致胶原蛋白生成和纤维化而不抑制NKA泵送活性。MBG优先结合NKA的α

纤维化与多种疾病有关。发生纤维化的疾病的示例包括但不限于先兆子痫、心肌病(例如糖尿病性心肌病和尿毒症性心肌病)、心脏纤维化、心肌纤维化、胶原蛋白-血管疾病(例如动脉僵硬和血管纤维化)、动脉粥样硬化、慢性心力衰竭、糖尿病肾病、肾小球硬化症、肾脏纤维化、肾管间质纤维化、慢性肾脏疾病(例如慢性肾衰竭)、肝纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝病(例如非酒精性脂肪性肝炎)、酒精性肝病(例如酒精性脂肪性肝炎)、慢性肝病、肝衰竭(例如肝硬化和慢性肝衰竭)、肺纤维化、肾源性全身纤维化(可能影响皮肤和内脏器官，例如心脏、肝和肺)和硬皮病(包括局部硬皮病和全身性硬皮病/系统性硬化症[可能影响皮肤、血管、肌肉和内脏器官例如心脏、肾脏、肺和胃肠道])。

高血压还表征(例如，是其临床特征或并发症)或是(例如，引起或促成)多种疾病的主要危险因素。与高血压相关的疾病的非限制性示例包括先兆子痫、子痫、水肿(例如全身性水肿、周围性水肿、肺水肿和脑水肿)、心血管疾病{例如高血压性心脏病、纤维化疾病(例如心肌病[例如糖尿病性心肌病和尿毒症性心肌病]、心肌纤维化和胶原蛋白-血管疾病[例如动脉僵硬]、动脉硬化(例如动脉粥样硬化和小动脉硬化)、心力衰竭(例如充血性心力衰竭、左侧心力衰竭和右侧心力衰竭)、冠状动脉疾病(例如心肌缺血/梗塞)、主动脉夹层、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)和中风}、肾脏疾病(例如高血压性肾病、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、肾缺血、肾病综合征、肾衰竭[例如急性肾损伤和慢性肾脏疾病]、血尿、蛋白尿和尿毒症、肝衰竭(例如肝硬化)、脑部疾病(例如高血压性脑病、脑出血、颅内出血、颅内高压、中风[例如缺血性中风和出血性中风]和脑梗塞)、眼部疾病(例如视网膜病变[例如高血压性视网膜病]、眼睛血管损伤、视神经乳头水肿、视网膜出血和视力丧失)、纤维蛋白样坏死(例如小动脉的)、代谢综合征、糖尿病(例如2型)和睡眠呼吸暂停(例如阻塞性睡眠呼吸暂停)。

本文所述的嵌合的、人源化的和人的抗MBG抗体及其片段可以用于治疗任何MBG相关的疾病。在某些实施例中，抗体或其片段是H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8。在一些实施例中，疾病与MBG水平升高相关，例如血液、尿液或脑脊髓液(CSF)中。MBG相关疾病的非限制性示例包括高血压(例如原发性[原发性或自发性]高血压、继发性高血压[例如肾血管性高血压、门静脉高血压或肺动脉血高压]、与容量扩张相关的高血压、顽固性高血压和高血压紧急情况[恶性高血压])、妊娠高血压疾病(例如慢性高血压、先兆子痫、子痫和妊娠高血压)、水肿(例如全身性水肿和周围性水肿)、心血管疾病{例如高血压性心脏病、纤维化疾病(例如心肌病[例如糖尿病性心肌病和尿毒症性心肌病]、心脏纤维化、心肌纤维化[例如心肌内膜纤维化]和胶原蛋白-血管疾病[例如动脉僵硬和血管纤维化])、动脉硬化(例如动脉粥样硬化和小动脉硬化)、心力衰竭(例如急性心力衰竭、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、左侧心力衰竭/左心室功能不全和右侧心力衰竭)、冠状动脉疾病(例如心绞痛和心肌局部缺血/梗塞)、主动脉夹层、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)和中风}、肾脏/肾疾病{例如高血压性肾病、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、肾小球硬化、肾纤维化、肾小管间质纤维化、肾缺血、肾病综合征、肾衰竭(例如急性肾损伤、慢加急性肾衰竭和慢性肾病[例如慢性肾衰竭和终末期肾病])、血尿、蛋白尿和尿毒症}、肝脏疾病{例如肝纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝病(例如非酒精性脂肪肝炎)、酒精性肝病(例如酒精性脂肪肝炎)、慢性肝病和肝衰竭(例如肝硬化和慢性肝衰竭)}、肺部疾病(例如肺水肿和肺纤维化[例如特发性肺纤维化])、脑部疾病(例如高血压性脑病、脑出血、颅内出血、脑水肿、颅内高压、脑肿胀、中风[例如缺血性中风和出血性中风]和脑梗塞)、眼部疾病(例如视网膜病[例如高血压性视网膜病]、眼睛血管受损、视神经乳头水肿[视乳头水肿]、视网膜出血、视力损害和丧失)、皮肤疾病(例如肾源性全身纤维化[也可能影响心脏、肝脏和肺等内部器官]和硬皮病[包括局部性硬皮病和全身性硬皮病/全身性硬化症[也可能影响血管、肌肉和内脏器官例如心脏、肾脏、肺和胃肠道)、纤维蛋白样坏死(例如小动脉的)、代谢综合征、糖尿病(包括1型和2型)和睡眠呼吸暂停(例如阻塞性睡眠呼吸暂停)。

在一些实施例中，嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)用于治疗高血压疾病。在某些实施例中，高血压包括或为高动脉血压。在一些实施例中，高血压疾病是高血压(例如原发性高血压、与容量扩张相关的高血压或顽固性高血压)、妊娠高血压疾病(例如慢性高血压或先兆子痫)或其它与高血压相关的疾病{例如心血管疾病(例如高血压性心脏病、心力衰竭[例如充血性心力衰竭]或冠心病[例如心肌缺血/梗塞])或肾脏疾病(例如高血压性肾病、糖尿病性肾病或肾衰竭[例如慢性肾病])}。在某些实施例中，高血压疾病是原发性高血压、先兆子痫、充血性心力衰竭或慢性肾脏疾病。

在其它实施例中，嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)用于治疗纤维化疾病。在一些实施例中，纤维化疾病是先兆子痫、心肌病(例如糖尿病性心肌病或尿毒症性心肌病)、心脏纤维化，心肌纤维化、胶原蛋白-血管疾病(例如动脉僵硬或血管纤维化)、动脉粥样硬化、慢性心力衰竭、糖尿病性肾病、肾纤维化、慢性肾脏疾病(例如慢性肾功能衰竭)、肝纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝炎、慢性肝病、肝功能衰竭(例如慢性肝功能衰竭)或硬皮病(例如局部性硬皮病或全身性硬皮病/全身性硬化症)。在某些实施例中，纤维化疾病是尿毒症心肌病、心肌纤维化、糖尿病性肾病、肾纤维化或肝硬化。

嵌合的、人源化或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)可以通过任何合适的途径施用于受试者。抗体或其片段的潜在给药途径包括但不限于口服、肠胃外(包括皮内、皮下、肌内、血管内、静脉内、动脉内和腹膜内)和腔内。在一些实施例中，抗体或其片段通过注射或输注(例如用渗透泵)胃肠外(例如静脉内、皮下、肌内或腹膜内)施用。抗体或其片段还可以部分取决于病症的类型通过其它途径来施用。例如，抗体或其片段可以通过例如使用剂量吸入器、干粉吸入器或雾化器进行口服吸入来施用，以治疗肺部疾病。作为另一个示例，抗体或其片段可以通过例如髓内、鞘内、颅内、脑内或脑室内注射来施用，以治疗脑部疾病。再例如，抗体或其片段可以通过例如玻璃体内、结膜下、视网膜下或Tenon下注射或植入来施用，以治疗眼部疾病。可替换地，抗体或其片段可以通过滴眼剂局部施用以治疗眼部疾病，其中可以通过共同施用细胞穿透肽(CPP)(例如富含精氨酸的CPP[例如，聚精氨酸，例如R

用嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段治疗MBG相关疾病的治疗有效量和施用频率以及治疗长度可能取决于多种因素，包括疾病的性质和严重性、抗体或其片段的效力、给药方式、年龄、体重、总体健康状况、受试者的性别和饮食以及受试者对治疗的反应，并且可以由治疗医师确定。在一些实施例中，用于治疗MBG相关疾病的抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)的治疗有效量为约1、5或10mg至约200mg，从约1、5或10mg至约150mg，从约1、5或10mg至约100mg，或从约1、5或10mg至约50mg，或治疗医师认为适当，可以单剂量或分剂量给药。在其它实施例中，抗体或其片段的治疗有效量为约1-5mg、5-10mg、10-20mg、20-30mg、30-40mg、40-50mg、50-100mg、100-150mg或150-200mg。在一些实施例中，抗体或其片段的治疗有效量为约1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150或200mg。在某些实施例中，抗体或其片段的治疗有效量为约1-5mg、5-10mg或10-50mg。在另外的实施例中，用于治疗MBG相关疾病的抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)的治疗有效量为约0.01-0.1mg/kg、0.1-0.5mg/kg、0.5-1mg/kg、1-2mg/kg或2-3mg/kg体重，或治疗医师认为适当。在某些实施例中，抗体或其片段的治疗有效量为约0.01-0.1mg/kg、0.1-0.5mg/kg或0.5-1mg/kg体重。

嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段可以以任何合适的频率施用以治疗MBG相关疾病。在一些实施例中，抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)每天一次、每2天一次、每3天一次、每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每6周一次、每2个月一次或每3个月一次施用，或治疗医师认为适当。在某些实施例中，抗体或其片段每周一次或每2周一次施用。

同样地，嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段可以以任何合适的时间长度或以任何合适的总剂量施用来治疗MBG相关疾病。在一些实施例中，抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)在至少约1周、2周、1个月(4周)、6周、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长时间或者治疗医师认为适当的时间内施用。在一些实施例中，与MBG相关的疾病是慢性病。慢性病可以存在例如至少约6周或2个月。在某些实施例中，抗体或其片段在至少约6周、2个月、3个月或6个月的时间内施用。在另外的实施例中，在整个治疗方案中施用1、2、3、4、5或6个剂量的抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)。在某些实施例中，在整个治疗方案中施用1、2或3个剂量的抗体或其片段。

嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)还可以以不规则的方式施用，以治疗MBG相关疾病。例如，抗体或其片段可以以不规则的方式在1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月的时间内施用1、2、3、4、5或更多次。此外，抗MBG抗体或其片段(例如H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)可按需(视需要)施用来治疗MBG相关疾病。例如，抗体或其片段可以以规则或不规则的方式施用1、2、3、4、5或更多次，以治疗高血压直到血压降低到一定水平。一旦血压降低到一定水平，就可以可选地中止抗体或其片段的给药。如果血压达到或超过一定水平，则可以恢复以规则或不规则方式施用抗体或其片段。抗体或其片段的合适剂量、给药频率和治疗时间可以由治疗医师确定。

为了更快速地建立嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段的治疗水平，可以在维持剂量之前施用至少一个负载剂量的抗体或其片段。在一些实施例中，施用抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)的负载剂量，然后是治疗医师认为适当的(i)一个或多个其它负载剂量然后是一个或多个治疗有效的维持剂量，或(ii)一个或多个治疗有效的维持剂量而没有额外负载剂量。药物的负载剂量通常比随后的维持剂量大(例如，大约1.5、2、3、4或5倍)，并且被设计为更快地建立药物的治疗水平。一种或多种治疗有效的维持剂量可以是本文所述的任何治疗有效量。在某些实施例中，负载剂量是维持剂量的约2或3倍。在一些实施例中，抗体或其片段的负载剂量在第1天施用，并且在治疗期间，此后抗体或其片段的维持剂量例如每周一次或每2周一次施用。在某些实施例中，抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)在第1天以约2-10mg、10-20mg或20-100mg，或约3-15mg、15-30mg或30-150mg的负载剂量施用，然后在治疗期间(例如，至少约2、3或6个月)每周一次或每2周一次以约1-5mg、5-10mg或10-50mg的维持剂量施用，其中负载剂量是维持剂量的约2或3倍，并且抗体或其片段经肠胃外(例如静脉内、皮下或肌肉内)施用。

在一些实施例中，在维持剂量之前施用两次负载剂量的抗体或其片段。在一些实施例中，抗体或其片段的第一负载剂量在第1天施用，第二负载剂量例如在约1或2周后施用，并且此后在治疗期间，维持剂量例如每周一次或每两周一次施用。在某些实施例中，第一负载剂量是维持剂量的约3或4倍，而第二负载剂量是维持剂量的约2倍。在一些实施例中，在第1天以约3-15mg、15-30mg或30-150mg，或约4-20mg、20-40mg或40-200mg的第一负载剂量施用抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)，1或2周后以约2-10mg、10-20mg或20-100mg的第二负载剂量施用，随后在治疗期间(例如，至少约2、3或6个月)每周一次或每2周一次以约1-5mg、5-10mg或10-50mg的维持剂量施用，其中第一负载剂量是维持剂量的约3或4倍，第二负载剂量是维持剂量的约2倍，并且抗体或其片段经肠胃外(例如静脉内、皮下或肌肉内)施用。

在一些实施例中，一种或多种另外的治疗剂与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用，以治疗MBG相关疾病，如下所述。

本公开内容提供了一种治疗MBG相关疾病的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本文所述的嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段，可选地与另外的治疗剂组合。本公开内容还提供了本文所述的嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段，或包含本文所述的嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段的组合物，用作药物，可选地与另外的治疗剂组合。另外，本公开内容提供了本文所述的嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段在药物制备中的应用，可选地与另外的治疗剂组合。在一些实施例中，药物用于治疗MBG相关疾病。

一种或多种另外的治疗剂可以可选地与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用来治疗MBG相关疾病。可选的另外的治疗剂可以与抗体或其片段的施用同时(例如，和抗体或其片段在相同的组合物中或在分开的组合物中)或循序(之前或之后)施加至受试者。

在一些实施例中，一种或多种可选的另外的治疗剂选自MBG抑制剂、硫酸镁、抗高血压剂、抗血脂异常剂、抗血小板剂、抗凝血剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗纤维化剂及其组合。

MBG抑制剂的示例包括但不限于脂蟾毒配基(RBG)、螺内酯、坎利酮及其类似物、衍生物和盐。螺内酯是Na

硫酸镁可以具有抗高血压作用，并且可以增强抗MBG抗体及其片段的活性。镁还以剂量依赖性方式降低高血压。

在一些实施例中，一种或多种抗高血压剂与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用来治疗高血压或与高血压相关的疾病。抗高血压剂包括但不限于：MBG抑制剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的拮抗剂、利尿剂、钙通道阻滞剂、α

在其它实施例中，将嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)与抗血脂异常剂、抗血小板剂或抗凝剂或其任何组合或全部结合使用，以治疗心血管或脑血管疾病。在某些实施例中，抗血脂异常剂包括或为他汀类(例如阿托伐他汀或其盐)或/和贝特类(例如非诺贝特)，抗血小板剂包括或为COX-1抑制剂(例如阿司匹林)或/和P2Y

抗血脂异常剂包括但不限于：HMG-CoA还原酶抑制剂、乙酰基-CoA羧化酶(ACC)抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)激动剂、PPAR-δ激动剂、PPAR-γ激动剂、肝X受体(LXR)激动剂、类视黄醇X受体(RXR)激动剂、酰基-CoA胆固醇酰基转移酶(ACAT，也称为固醇O-酰基转移酶[SOAT]，包括ACAT1[SOAT1]和ACAT2[SOAT2])的抑制剂、硬脂酰CoA去饱和酶-l(SCD-1，也称为硬脂酰-CoA δ-9去饱和酶)活性或表达的抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)活性或表达的抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-l)受体激动剂、二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)活性或表达的抑制剂、载脂蛋白模拟肽、omega-3脂肪酸及其类似物、衍生物和盐。

抗血小板剂包括但不限于：环氧合酶(例如COX-1)抑制剂、血栓素(例如A

抗凝剂包括但不限于：维生素K拮抗剂、间接因子Xa抑制剂、直接因子Xa抑制剂、直接凝血酶(因子IIa)抑制剂(DTI)及其类似物、衍生物和盐。

炎症促成多种疾病的病理生理。炎症性疾病包括但不限于自身免疫性疾病(例如1型糖尿病、多发性硬化症和全身性硬化症)、高血压、先兆子痫、水肿、心血管疾病(例如动脉粥样硬化、心肌缺血/梗塞、缺血再灌注损伤[IRI]和外周动脉疾病)、脑部疾病(例如中风和IRI)、肾脏疾病(例如肾小球肾炎)、肝脏疾病(例如肝硬化、非酒精和酒精性脂肪性肝炎和慢性肝病)、眼部疾病(例如年龄相关性黄斑变性[AMD])、代谢综合征、糖尿病(1型和2型)和睡眠呼吸暂停(例如阻塞性睡眠呼吸暂停)。此外，炎症是纤维化的主要刺激因素。

在一些实施例中，一种或多种抗炎剂与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用来治疗炎症性疾病。在某些实施例中，一种或多种抗炎剂包括或为促炎性细胞因子或其受体的抑制剂或其产物(例如，TNF-α或/和IL-6或IL-6R)。

抗炎剂包括但不限于：非甾体类抗炎药(NSAID)、免疫调节剂、免疫抑制剂、抗炎细胞因子和增加其产量的化合物、促炎性细胞因子或其受体的抑制剂，促炎性细胞因子或其受体的产生的抑制剂、促炎性转录因子或它们的活化或表达的抑制剂、促炎性前列腺素(例如前列腺素E

非甾体类抗炎药(NSAID)包括但不限于：醋酸衍生物，邻氨基苯甲酸衍生物(芬那酸)，烯醇酸衍生物(昔康类，oxicams)，丙酸衍生物，水杨酸酯，COX-2-选择性抑制剂，其它种类的NSAID，例如单萜类化合物(例如桉油精和酚类[例如香芹酚])、苯胺吡啶羧酸(例如氯尼辛)、磺酰苯胺类(例如尼美舒利)以及脂氧合酶(例如5-LOX)和环加氧酶(例如COX-2)的双重抑制剂(例如诃黎勒鞣花酸、利克飞龙、2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4-(N-甲基吲哚-3-yl)噻吩和基于二叔丁基苯酚的化合物[例如DTPBHZ、DTPINH、DTPNHZ和DTPSAL])；及其类似物、衍生物和盐。

皮质类固醇的糖皮质激素类别具有抗炎作用和免疫抑制特性。糖皮质激素包括但不限于氢化可的松类型、卤代类固醇、碳酸盐及其类似物、衍生物和盐。

氧化应激涉及，例如活性氧种类(ROS，例如超氧自由基、单线态氧、羟基自由基、氢过氧自由基、过氧化氢和有机氢过氧化物[例如脂质氢过氧化物])、活性氮种类(RNS，例如一氧化氮自由基)、过氧亚硝酸盐、二氧化氮和三氧化二氮)和自由基(例如碳酸盐自由基)，也在多种疾病的病理生理中起着重要作用。以例如氧化应激或/和氧化损伤/伤害为特征的氧化性疾病包括但不限于先兆子痫、心血管疾病(例如动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌缺血/梗塞和IRI)、脑部疾病(例如中风和IRI)、神经退行性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症和阿尔茨海默症、亨廷顿症和帕金森病)、肾脏疾病(例如糖尿病性肾病)、肝脏疾病(例如肝硬化)、眼部疾病(例如AMD)、代谢综合征、糖尿病(1型和2型)和睡眠呼吸暂停(例如阻塞性睡眠呼吸暂停)。此外，氧化剂(例如，ROS和RNS)和氧化的分子(例如，氧化的脂质)可以是高度炎性的。

在一些实施例中，一种或多种抗氧化剂与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用来治疗氧化性疾病。在某些实施例中，一种或多种抗氧化剂包括或为维生素或其类似物(例如维生素E或其类似物，例如α-生育酚或trolox)或/和ROS、RNS或自由基清除剂(例如，褪黑激素或/和谷胱甘肽)。

抗氧化剂包括但不限于：维生素及其类似物，类胡萝卜素，含硫的抗氧化剂，ROS、RNS和自由基的清除剂，产生ROS的酶的抑制剂，模仿或增加抗氧化剂酶的活性或产生的物质，上调抗氧化剂酶的表达的转录因子的激活剂，针对线粒体的抗氧化剂，其它类型的抗氧化剂及其类似物、衍生物和盐。

在另外的实施例中，一种或多种抗纤维化剂与嵌合的、人源化的或人的抗MBG抗体或其片段(例如，H2L2、H3L2、201/202、206/208、236/237或2A-F8)组合使用以治疗与纤维化相关的疾病。在一些实施例中，一种或多种抗纤维化剂包括或为抗炎剂或/和抗氧化剂(例如维生素E或其类似物[例如α-生育酚或trolox]、含硫的抗氧化剂或ROS、RNS或自由基清除剂[例如褪黑激素]或其任何组合)。在某些实施例中，一种或多种抗纤维化剂包括或为吡非尼酮(其在本文所述的各种抗纤维化和抗炎特性中也降低成纤维细胞增殖)或/和尼达尼布(nintedanib)(其阻断在成纤维细胞增殖、迁移和转化中参与的FGFR、PDGFR和VEGFR的信号传导)。

在其它实施例中，一种或多种抗纤维化剂包括或为具有抗高血糖或/和胰岛素敏化活性的一种或多种试剂，用于治疗其中高血糖、糖尿病或胰岛素抵抗导致纤维化发展的纤维化疾病。此类疾病的示例包括但不限于以肾纤维化为特征的糖尿病性肾病，以及以肝纤维化为特征的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。抗高血糖剂和/或胰岛素敏化剂的使用可以抑制或预防例如肾炎症和纤维化或肝炎症和纤维化。在某些实施例中，一种或多种抗纤维化剂包括或为PPAR-γ激动剂(例如噻唑烷二酮[supra]，例如吡格列酮或罗格列酮)。激活PPARγ的噻唑烷二酮具有抗高血糖和胰岛素敏感的特性。

抗纤维化剂包括但不限于：MBG抑制剂，胶原蛋白积聚的抑制剂，促纤维化生长因子(例如TGF-β[包括TGF-β1]，CTGF和源自血小板的生长因子[包括PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D]或它们的产生、激活或信号传导的抑制剂，受体酪氨酸激酶(TK)抑制剂，抗EGFR抗体，抗炎剂(包括上面列出的那些)，抗氧化剂(包括上面列出的那些)，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的拮抗剂(包括上面列出的那些)，晚期糖化终产物(AGE，其尤其增加动脉僵硬和刺激肾小球系膜基质扩张)的积累或作用的抑制剂，其它类型的抗纤维化剂，包括但不限于RGD模拟物和类似物(抑制成纤维细胞和免疫细胞对ECM糖蛋白的粘附)(例如NS-11、SF-6,5和GRGDS)，半乳凝素3抑制剂(例如GM-CT-01和GR-MD-02)，曲古抑菌素A(抑制TGFβ1诱导的EMT)和PPAR-γ激动剂(例如，噻唑烷二酮[同上])；及其类似物、衍生物、片段和盐。

可选的另外的治疗剂可以以任何合适的方式独立地施用。潜在的施用方式包括但不限于口服、肠胃外(包括皮内、皮下、肌内、血管内、静脉内、动脉内、腹膜内、髓内、鞘内和局部)、腔内和局部(包括皮肤/表皮、经皮、粘膜、经粘膜、鼻内)[例如，通过鼻喷雾剂或滴剂]、眼内[例如，通过滴眼剂]、肺部[例如，通过口服或鼻腔吸入]、颊、舌下、直肠[例如，通过栓剂]和阴道[例如，通过栓剂])。在一些实施例中，可选的另外的治疗剂独立地口服或胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌内)施用。

可选的另外的治疗剂可以以任何合适的频率独立地施用，包括但不限于每天(每天1、2或多次)、每两天或三天、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月、每两个月或每三个月，或者以不定期的方式或根据需要。给药频率可以取决于例如所选择的施用方式。可选的另外的治疗剂的治疗时间可以由治疗医师确定，并且可以独立地为例如至少约1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、4周(1个月)、6周、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长时间。

VII.

本文公开的嵌合的、人源化的和人的抗MBG抗体及其片段也可用于MBG相关疾病的诊断和预后评估，包括与MBG水平升高相关的疾病(例如高血压疾病)。此外，此类抗体及其片段可用于促进治疗决策。

可以使用抗MBG抗体或其片段来检测从受试者获得的原始或处理样本中MBG的存在。生物样本可以包括例如血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液(CSF)、细胞或组织。可以直接分析样本、在分析之前提取样本或通过添加合适的溶剂扩大体积。

在一些实施例中，使生物样本与抗MBG抗体或其片段接触，并筛选样本以检测抗体或其片段与MBG的结合。检测到这种结合表明样本中存在MBG。在某些实施例中，抗MBG抗体或其片段用可检测试剂(例如荧光染料)标记，使得抗体或其片段与MBG的结合引起信号。在其它实施例中，在引入标记的抗MBG抗体或其片段之前，将生物样本中的MBG固定在表面上(直接测定)，并且与结合到MBG上的标记的抗体或其片段的量相对应的信号的量与样本中MBG的量相关联。在其它实施例中，生物样本中的MBG由固定在表面的未标记的第一抗体捕获，然后由与捕获的MBG结合并产生与捕获的MBG的量成比例的信号的标记的第二抗体检测(夹心测定)，其中未标记的第一抗体和标记的第二抗体结合MBG的不同表位，并且未标记的第一抗体或/和标记的第二抗体独立地可以是本文公开的抗MBG抗体或其片段。

在另外的实施例中，在竞争性测定中检测生物样本中的MBG。在一些实施例中，将样本(可选地悬浮在缓冲液中)与标记的抗MBG抗体或其片段混合。然后将所得混合物与MBG涂覆的基质接触。为了促进基质(例如，微量滴定板的孔)的MBG涂覆，可以将MBG与例如吸附在基质上的载体蛋白(例如，牛血清白蛋白[BSA]、匙孔血蓝蛋白[KLH]或卵清蛋白)缀合。样本中MBG的量越大，形成的抗体/MBG复合物越多，与基质上的MBG结合的未结合(游离)抗体越少(“竞争”)，因此产生的信号越低。

在上述直接、夹心和竞争性测定中，一级抗MBG抗体或其片段可用可检测试剂标记。可替换地，在直接、夹心和竞争性测定中，一级抗MBG抗体或其片段可以是未标记的，并且在一级抗体与MBG结合后可以被标记的二级抗体(一种与例如一级抗体的Fc区结合的抗体)结合。如果二级抗体与酶缀合，则酶底物的添加导致酶/底物反应，该反应产生信号(例如显色、荧光或电化学信号)。测量固体支持物(例如板孔或珠子)的吸光度、荧光或电化学信号(例如电流)，以确定样本中MBG的存在和数量。辣根过氧化物酶(HRP)的底物的非限制性示例包括3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、碱性磷酸酶中的那些包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)，而β-葡萄糖醛酸酶中的那些包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X-Gluc)。这种测定称为酶联免疫吸附测定(ELISA)。

可检测的试剂包括但不限于发色团{例如染料、染色剂、色素和发色团(例如3-氨基-9-乙基咔唑[AEC]、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐[BCIP]、3,3'-二氨基联苯胺[DAB]和3,3',5,5'-四甲基联苯胺[TMB])}、荧光团/荧光色素(例如荧光染料，例如荧光素、异硫氰酸荧光素和若丹明)、化学发光化合物(例如荧光素和鲁米诺)、放射性同位素(例如

本文所述的抗MBG抗体及其片段可以用于多种免疫测定中。这样的测定包括但不限于显色、荧光、化学发光、光散射、放射性标记、电化学、酶、沉淀、凝集、凝结、蛋白质印迹、网格印迹、组织印迹、斑点印迹、量尺和生物传感器测定。参见，例如，Principles andPractice of Immunoassays,C.Price and D.Newman(Eds.),Stockton Press(1997)；以及The Immunoassay Handbook,2nd Ed.,D.Wild(Ed.),Nature Publishing Group(2001)。此外，抗MBG抗体及其片段可用于成像中，例如通过MRI。

检测和测量生物样本中MBG的量可以促进MBG相关疾病的诊断、预后和治疗。在一些实施例中，病症与MBG水平升高相关，并且与没有病症的其它受试者的相应样本中的MBG水平相比，受试者的样本中MBG水平升高表示受试者的疾病诊断。用于诊断病症的参考MBG水平可以基于例如统计学上或流行病学上数量众多的无疾病的受试者的相应样本中的MBG水平与统计学上或流行病学上数量众多的患有疾病的受试者的相应样本中的MBG水平的比较来确定。类似地，出于治疗和预后目的，可以将来自受试者的样本中的MBG水平与例如与MBG相关疾病的严重性相关的MBG水平的规模进行比较，以确定疾病的当前严重性并预测疾病的可能病程或结果(例如，进展或消退)。

另外，检测和测量生物样本中MBG的量可以促进治疗决策。在一些实施例中，基于受试者的样本中MBG的存在、不存在、量或水平，来维持或调节(增加或减少)向受试者施用的抗MBG抗体或其片段的量或/和向受试者施用的抗体或其片段的频率，或停止向受试者施用抗体或其片段。

在一些实施例中，试剂盒包含可以可选地用可检测试剂标记的抗MBG抗体或其片段，以及可选地将抗MBG抗体或其片段用于诊断应用(例如，在免疫测定中)的说明书。

在高血压和高血压相关疾病中，血液MBG水平升高。例如，先兆子痫(PE)患者的血浆MBG水平比血压正常的孕妇高5倍，并且血浆MBG水平与PE严重程度相关(Lopatin 1999和Agunanne 2011)。此外，患有原发性高血压或充血性心力衰竭(CHF)的患者血浆MBG水平增加7倍，而患有慢性肾功能衰竭的患者血浆MBG水平增加70倍以上(Puschett,AJKD 2010)。CHF的严重程度与血浆MBG水平相关(Fridman 2002)。此外，心肌缺血/梗死患者的血浆MBG水平升高(Bagrov 1998)，阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)患者的血浆MBG水平升高，并且与OSA的严重程度相关(Zvartau 2006)。

其它强心性类固醇，包括其它蟾蜍二烯内酯，例如远华蟾蜍精(TCB)和脂蟾毒配基(RBG)，也可以诊断疾病。例如，患有慢性肾功能衰竭的患者血浆TCB水平升高(Komiyama2005)。RBG会阻止MBG的影响，或者具有与MBG相反的效果(Puschett 2012和Uddin,HP2012)。

MBG诱导的血管生成失衡可导致PE(Uddin,TR 2012)。血管生成平衡涉及抗血管生成因子(例如，可溶性fms样酪氨酸激酶1[sFlt1或sVEGFR1]和可溶性内皮糖蛋白[sEng])和促血管生成因子(例如，血管内皮生长因子[VEGF]和胎盘生长因子[PlGF])。在PE患者中，sFlt1和sEng水平先于临床症状而升高，并且还与PE严重程度相关，而PlGF水平则显著降低(Verlohren 2012和Hagmann 2012)。例如，过多的胎盘来源的sFlt1会导致PE中的内皮功能障碍、高血压和蛋白尿(Maynard 2003)，而胎盘来源的sEng(一种可溶性TGF-β共受体)水平升高会诱发PE中的血管渗透性、高血压和IUGR(Venkatesha 2006)。MBG浓度在0.1nM和1nM之间会增加sFlt1和sEng的表达，并降低绒毛外CTB细胞系中VEGF和PlGF的表达(Ehrig2014)。sFLt1：PlGF比率对于确定PE的特征性胎盘发育异常和血管生成失衡特别有用(Hertig 2010和von Dadelszen 2014)，并且怀孕期间的血压与sFlt1：PlGF比率呈正相关。

VIII.

本公开内容提供了包括编码本文所述的嵌合的、人源化的和人的抗MBG抗体及其片段的核酸序列的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包括编码抗MBG mAb或其片段的V

本公开内容还提供了包括编码本文所述的嵌合的、人源化的和人的抗MBG抗体及其片段的核酸序列的载体(也可以称为表达或克隆载体)。合适的载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、λ噬菌体(例如，删除了溶原基因的那些)和病毒。在某些实施例中，载体是质粒。

可以采用各种载体系统。一类载体利用衍生自动物病毒例如腺病毒、杆状病毒、牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、SV40病毒、牛痘病毒和逆转录病毒(例如MMTV、MOMLV和劳斯肉瘤病毒)的DNA元件。另一类载体利用衍生自RNA病毒例如东部马脑炎病毒、黄病毒和赛姆利基森林(Semliki Forest)病毒的RNA元件。

载体除包括编码例如抗MBG mAb或其片段的V

本公开内容还提供了包括或表达编码本文所述的嵌合的、人源化的和人的抗MBG抗体及其片段的载体的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于真核细胞、哺乳动物细胞(例如，BHK、CHO、COS、HEK293、HeLa、MDCKII和Vero细胞)、昆虫细胞(例如Sf9细胞)、酵母细胞和细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)。在某些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)。

在一些实施例中，宿主细胞包括或表达编码抗MBG mAb或其片段的V

可以通过本领域已知的任何方法将载体转染或引入宿主细胞。转染剂和方法包括但不限于磷酸钙、阳离子聚合物(例如DEAE-葡聚糖和聚乙二胺)、树状聚合物、fugene、阳离子脂质体、电穿孔、声穿孔、细胞挤压、基因枪、病毒转染和逆转录病毒转导。

培养转染的宿主细胞并回收重组产生的抗MBG抗体或其片段的方法和条件是本领域已知的，并且可以根据例如特定的表达载体或/和所使用的宿主细胞进行改变或优化。在一些实施例中，重组产生抗MBG mAb或其片段的V

IX.

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在本说明书中引用的所有出版物和专利均被援引加入本文，就好像每篇单独的出版物或专利均被具体地和单独地表示为被援引加入本文，并且被援引加入本文以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。

以下示例仅旨在说明本公开内容。其它测定、研究、过程、方案、规程、方法、试剂和条件可以可替换地酌情使用。

示例

示例1.嵌合抗MBG抗体的产生

由小鼠抗体产生嵌合抗体，该小鼠抗体以高特异性和高亲和力结合MBG。将小鼠抗体的V

示例2人源化抗MBG抗体的产生

结合MBG的小鼠抗体也被人源化。将3E9(SEQ ID NO：3-8)的重链(IgG1)和轻链(κ)的CDR嫁接到受体人框架序列上。

通过将小鼠构架序列与人构架序列的数据库比对来选择人构架序列，以找到每条链最接近的人同源物(一般约65-70％的序列同一性)。人VH4-31和VH4-59与重链的小鼠框架序列最同源，人VK2-29和VK2-30与轻链的小鼠框架序列最同源。分别选择VH4-59和VK2-30作为V

使用1T4K、1ORS和1DQD的V

示例3.建立噬菌体衍生的人抗MBG抗体

针对结合至牛血清白蛋白(BSA)的MBG淘选具有1.2×10

在酶联免疫吸附测定(ELISA)中测试了代表六个不同泛富集馏分的约660个单独克隆与MBG的结合，鉴定了数十个MBG特异性克隆。通过BstN1指纹图谱/DNA测序或/和MBG竞争性ELISA进一步表征了约110种推定的MBG结合抗体(在噬菌体上表达的Fab片段)，从而产生了14种独特的抗体，其在ELISA中与MBG结合并竞争。14种人抗体的相对CTS特异性显示在下面的示例8中。通过将每个噬菌体克隆中包含的重链可变结构域和完整的轻链亚克隆到哺乳动物表达载体中，将14个独特的抗MBG Fab片段中的七个(201/202、203/204、205/207、206/208、236/237、238/239和240/241)转化为完整的人IgG1，以在HEK293细胞中表达。一些噬菌体衍生的人抗MBG Fab片段和完整的IgG1抗体具有κC

示例4.嵌合抗MBG抗体的重组产生

为了产生嵌合的3E9 IgG mAb，使用RACE-PCR cDNA方法克隆了编码小鼠抗体的V

示例5.人源化抗MBG抗体的重组产生

制备编码与人IgG2或IgG4 C

CHO细胞与编码人源化抗MBG mAb的重链(例如H1、H2或H3)和轻链(例如L1或L2)的单独质粒共转染(例如H1L1、H2L1、H3L1，H1L2、H2L2、H3L2)，在无血清培养基中生长，并用10μg/ml的嘌呤霉素和500μg/ml的G418选择2周。通过FACS将稳定库的单细胞分选到96孔板中。2-3周后，菌落长大。通过Elisa筛选培养基中的抗体水平。高抗体表达的克隆扩展到24孔板、6孔板和30ml摇动培养物中。在分批培养中表征抗体生产水平。顶部克隆的抗体生产水平>300mg/L。

示例6.人抗MBG抗体的重组产生

用编码人抗MBG mAb的重链和轻链的单独质粒(例如201/202、206/208、236/237或2A-F8)共转染的HEK293F细胞在无血清培养基中在200mL培养物中生长4天。收获培养物上清液并过滤灭菌。通过蛋白A亲和层析纯化抗体。

CHO细胞与编码人抗MBG mAb的重链和轻链的单独质粒(例如201/202、206/208、236/237或2A-F8)共转染，并在无血清培养基中生长，并用10μg/ml的嘌呤霉素和500μg/ml的G418选择2周。通过FACS将稳定库的单细胞分选到96孔板中。克隆生长2-3周。通过Elisa筛选培养基中的抗体水平。高抗体表达的克隆扩展到24孔板、6孔板和30ml摇动培养物。在分批培养中表征抗体生产水平。顶部克隆的抗体生产水平>300mg/L。

示例7.人源化抗MBG的抗原结合

在直接Elisa分析中测定人源化抗MGB的抗原结合。在Elisa平板中涂覆2μg/ml的MBG缀合的BSA。用1％BSA封闭后，将2倍稀释的系列人源化抗MBG加入平板中。洗涤后，通过添加抗人Fc HRP缀合物来检测结合的抗体，并通过添加TMB底物进行定量。在酶标仪中测量450nm处的OD吸收。在6种人源化抗体中，H3L2表现出最高的结合亲和力(图1a)，类似于亲本3E9抗体(图1b)。

示例8.抗MBG抗体的亲和力和相对CTS特异性

在ELISA中评估抗MBG抗体对MBG的亲和力。用2μg/ml的MBG-牛血清白蛋白(BSA)或MBG-匙孔血蓝蛋白(KLH)涂覆微量滴定板的孔。然后用1％BSA封闭孔。将不同浓度(通常从约0.0001nM至约25nM)的测试IgG抗体添加至孔中。用抗人Fc辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体(Jackson ImmunoResearch)来检测结合至固定化MBG的测试IgG。洗涤孔后，将适当的HRP试剂(例如TMB ultra,Thermo Fisher)加入孔中。用酶标仪测定450nm处的光密度(OD)。结合曲线中点处的测试抗体浓度是MBG亲和力的估计值。

表1.抗MBG抗体的估计亲和力(K

在竞争性ELISA中确定抗MBG抗体对MBG相对于各种强心类固醇(CTS)的特异性(相对亲和力)。在存在游离MBG、脂蟾毒配基(Resibufogenin)(RBG)、华蟾毒配基(cinobufagin)(CINO)、哇巴因(OUB)或地高辛(DIG)作为竞争剂的情况下，测试每种抗MBG抗体与固定化MBG的结合。恒定量的抗MBG抗体(通常1-5μg/mL)和不同浓度的每种CTS(从10

表2.抗MBG抗体对游离CTS与固定化MBG竞争的相对特异性(标准化为MBG＝100％)，其中确定了抗体与MBG-BSA的最大结合为50％的游离CTS浓度(μM)

*10μM的游离CTS不足以看到抗体与MBG-BSA的最大结合为50％的游离CTS浓度。当测试236/237与100μM的游离MBG或RBG的竞争性时，生成了完整的结合曲线。238/239和240/241未在100μM的游离CTS下进行测试。

nc＝无法由竞争性分析/图表计算

nt＝未测试

三种抗体236/237、2A-F8和H3L2不与任何CTS竞争剂分子反应。两种抗体201/202和R4CE-1E与CTS竞争剂RBG和CINO反应。两种抗体203/204和206/208与CTS竞争剂RBG反应。一种抗体2A-5A与CTS竞争剂RBG、CINO和DIG反应。两种抗体238/239和1B-6E与CTS竞争剂OUB反应(但未针对其它CTS竞争剂进行测试)。

示例9.抗MBG Abs抑制MBG诱导的PKC-δ核易位

MBG诱导纤维化，包括肾纤维化、心脏纤维化和血管纤维化(Federova2009，Elkareh 2007和Nikitina 2011)。MBG与NKA的结合诱导PKC-δ从胞质溶胶转移至细胞核，在这里它使转录因子Fli-1磷酸化，从而使Fli-1易于蛋白水解。Fli-1的蛋白水解释放其对前胶原I和III的表达的抑制(Elkareh 2009)。胶原蛋白合成的增加促进纤维化。

在添加到培养的原代大鼠心脏成纤维细胞中之前，将MBG与抗MBG抗体孵育。30分钟后分离核并分析PKC-δ的量。小鼠抗MBG mAb 3E9用作阳性对照，非MBG结合人IgG mAb用作阴性和同型对照。

图2是免疫(Western)印迹，示出与单独的MBG或与MBG加抗体一起孵育的原代心脏成纤维细胞的细胞核中PKC-δ(78kDa)的相对量。与“对照”(仅用媒介物处理，印迹中的道1)相比，2nM的MBG诱导了细胞核中PKC-δ量的增加，其通过抗MBG mAb 3E9、H3L1、201/202、206/208和236/237的处理而降低，并且通过H2L1、H2L2、238/239和240/241的处理处于更小的程度(图2a)。图2b中的免疫(Western)印迹显示，人源化的3E9 mAb H3L2和所有六个噬菌体衍生的人mAb(两个带斜线的数字)在10nM MBG时降低了PKC-δ易位进入细胞核。

示例10.抗MBG Abs逆转MBG抑制HUVEC细胞增殖

内皮功能障碍引起先兆子痫的病理特征，包括增加的血管渗透性/渗漏(Puschett,BBA 2010)。MBG部分通过抑制内皮细胞增殖来促进内皮功能障碍(Uddin,Placenta 2008)。

在添加到培养的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)之前，MBG(2nM)与抗体(图3a中20μg/mL，与人抗MBG mAb，或图3b中不同浓度(2.5-10μg/mL)，与人源化抗MBG mAb)进行孵育。48小时后，通过掺入

将内皮细胞生长培养基中的HUVEC细胞接种到96孔板上。第二天，细胞用各种抗体(2.5-20μg/mL)预处理，然后与2nM MBG孵育48小时。将[

在噬菌体衍生的人mAb中，MBG对HUVEC细胞增殖的抑制作用被201/202、236/237和238/239显著降低(图3a)，而在人源化3E9 mAb中被H2L2和H3L2显著降低(图3b)。

示例11.抗MBG抗体对CTB细胞中MBG诱导的抗增殖和抗血管生成信号传导的逆转

MBG抑制细胞滋养层(CTB)细胞的增殖、迁移和侵袭(Uddin,JBC和Placenta2008)。此外，MBG诱导的血管生成失衡促进先兆子痫中的内皮功能障碍(Puschett,BBA2010和Uddin,TR 2012)。在PE患者中，sFlt1和sEng水平先于临床症状而升高，并且还与PE严重程度相关，而PlGF水平则显著降低(Verlohren 2012和Hagmann 2012)。MBG诱导CTB细胞中的抗血管生成信号传导(Ehrig 2014)。

将CTB细胞在培养基中置于血清饥饿状态，然后洗涤两次，然后用含有DMSO(媒介物)或0.1、1、10或100nM的MBG的培养基(刺激细胞增殖)处理平行测定48小时。在添加MBG之前，一些细胞用30％摩尔过量的抗体206/208、H1L2或3E9进行预处理。收集培养基用于分析促血管生成和抗血管生成因子。使用CellTiter测定法(Promega；Uddin,JBC 2008和Placenta 2008)测量细胞活性。

在其它系列实验中，将人CTB细胞用DMSO(媒介物)或0.1、1、10或100nM的MBG处理48小时。一些细胞用30％摩尔过量的抗体201/202、206/208、236/237、H1L2或3E9进行预处理，而其它细胞则用抗体和MBG共同处理。小鼠抗MBG mAb用作阳性对照，非MBG结合人IgGmAb用作阴性和同型对照。收集培养基用于分析促血管生成和抗血管生成因子的分泌。使用ELISA试剂盒(Boster Biotech,Pleasanton,California)测量培养基中可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFlt1或sVEGFR1)、可溶性内皮糖蛋白(sEng)、血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(P1GF)的水平。通过Western印迹分析细胞裂解物的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达和p38 MAPK的磷酸化。使用CellTiter测定法(Promega)测量细胞活性。使用方差分析和Duncan’s事后分析检验进行统计分析。p值<0.05被认为具有统计学意义。

与用媒介物(DMSO)处理相比，用≥1nM的MBG处理CTB细胞可显著下调PCNA表达并增加p38 MAPK的磷酸化，显著增加抗血管生成因子sFltl和sEng的分泌，并显著降低促血管生成因子VEGF和PlGF的分泌(对于每个p<0.05)。用四种测试抗MBG mAb和小鼠抗体中的每一个预处理和共处理CTB细胞均显著上调PCNA表达并降低p38 MAPK的磷酸化，显著降低sFltl和sEng的分泌，并显著增加VEGF和PlGF的分泌(对于每个p<0.05)。所有四个测试抗MBG mAb都减弱了培养的CTB细胞中MBG诱导的抗增殖和抗血管生成信号传导，其程度与鼠抗MBG mAb 3E9相似。

示例12.先兆子痫(PE)的DOCA/盐水大鼠模型

在怀孕期间，人类的细胞外液体(ECF)体积增加了约40-50％，并且体积的增加会促进MBG分泌并最终促成PE的发展(Maynard 2001)。在妊娠大鼠的PE的体积扩张模型中(Vu2005和Puschett,BBA 2010)，用生理盐水代替正常饮用水以及注射醛固酮前体脱氧皮质酮乙酸酯(DOCA)会引起体积扩张、尿液MBG水平升高并引起病症，所述病症具有人类PE的许多表型特征：高血压、蛋白尿、IUGR、减少的幼崽数量和减少的总幼崽重量(Vu 2005,Ianosi-Irimie 2005和Horvat 2010)。

使雌性Sprague-Dawley大鼠(200-250g，Charles River实验室)适应1周，并与雄性Sprague-Dawley大鼠(275-300g)交配。通过阴道塞的存在或阴道涂片检查可以确认妊娠。每只大鼠分开饲养。

研究了五组大鼠(每组n＝10)：第1组(NP)：正常妊娠大鼠；第2组(PDS)：妊娠大鼠，最初以depot形式腹膜内(i.p.)注射12.5mg的DOCA，然后每周一次腹膜内(i.p.)注射6.5mg的DOCA，并用0.9％盐水代替饮用水；第3组(NPM)：正常妊娠大鼠，在实验的第4天确定妊娠后，每天注射MBG(每天每千克体重7.65μg)；第4组(PDS-3E9)：与第2组一样，给大鼠施用DOCA和盐水，并在妊娠的第16、17和18天给予鼠抗MBG抗体3E9(每天每千克体重2.2mg)；和第5组(PDS-H3L2)：与第2组一样给大鼠施用DOCA和盐水，并在妊娠的第16、17和18天还给予人源化抗MBG抗体H3L2(每天每千克体重2.2mg)。

在第17-19天通过尾套法测量收缩压(BP)。BP稳定后取至少3个读数，并计算这些值的平均值。报告的BP值是每日测量值的平均值。在妊娠的18-20天时，在没有食物的情况下收集24小时尿液，以避免任何下落的食物颗粒污染尿液中蛋白质含量的测量结果。在研究的这一部分中，将每只大鼠分别置于代谢笼中。测量24小时蛋白质排泄并将其标准化为肌酸酐。在第18-20天最后一次测量后牺牲大鼠，并采集血样。计数并检查胎崽的数量。评估幼崽的平均数量以及幼崽的任何发育或组织学异常。使用方差分析和Tukey’s事后检验分析进行统计分析。p值<0.05被认为具有统计学意义。

DOCA和盐水治疗增加妊娠大鼠的血压、蛋白尿、产仔数总体减少和胚胎畸形。单独施用MBG具有类似的效果。抗MBG和人源化抗MBG抗体可防止血压、蛋白尿和胚胎畸形的这种增加。

示例13.先兆子痫的Dahl盐敏感性大鼠模型

Dahl盐敏感性(Dahl-S)大鼠在妊娠期间自发表现出人类PE的许多表型特征，包括高血压、蛋白尿严重加重、肾脏改变(例如肾小球肥大)、胚胎死亡增加和初生仔畜数减少(Gillis 2015)。妊娠的Dahl-S大鼠也具有升高的MBG水平。

使雌性Dahl-S大鼠(SS/jr,200-250g,Charles River)适应1周，并与雄性Dahl-S大鼠(275-300g)交配。通过阴道塞的存在或阴道涂片检查可以确认怀孕。每只大鼠分开饲养。

研究了六组大鼠(每组n＝10)：第1组：未妊娠的雌性Dahl-S大鼠；第2组：妊娠的Dahl-S大鼠；第3组：妊娠的Dahl-S大鼠，从妊娠的第10天到第20天每周两次腹膜内(i.p.)给予非MBG结合人mAb(IgG)作为同型和阴性对照；第4组：妊娠的Dahl-S大鼠，从妊娠的第10天到第20天，每周两次腹膜内(i.p.)给予抗MBG抗体(例如H3L2、236/237或2A-F8)；第5组：与第4组相同，但从妊娠的第10天到第20天，每周两次腹膜内(i.p.)给予2mg/kg的抗MBG抗体；和第6组：与第4组相同，但从妊娠的第10天到第20天，每周两次腹膜内(i.p.)给予0.5mg/kg的抗MBG抗体。

测量和计算收缩压，测量在妊娠18-20天的24小时内尿液中蛋白质的含量，并与上述DOCA/盐水鼠类似地进行其它测量和评估。使用方差分析和Tukey’s事后检验分析进行统计分析，p值≤0.05表示具有统计学意义。

在第0天(基线，T0)、第8-10天(T1)和第18-20天(T2)测量收缩压(BP)。每天在BP稳定后取至少3个读数，并计算这些值的平均值。报告的T0、T1和T2的BP值是每日测量值的平均值。

在妊娠18-20天时，在没有食物的情况下收集24小时尿液，以避免任何下落的食物颗粒污染尿液中蛋白质含量的测量结果。在该部分研究过程中，将每只大鼠分别置于代谢笼中。在竞争性ELISA中测量尿液中MBG、RBG和TCB的水平，并测量24小时蛋白质排泄量。在第18-20天牺牲大鼠，并采集血样。对幼崽进行计数和检查。评估幼崽的平均数量和幼崽的任何发育或组织学异常。

使用方差分析和Tukey’s事后检验进行统计分析。p值≤0.05被认为具有统计学意义。

示例14.晚期糖尿病性肾病的STZ-CD1小鼠模型

单次将链脲佐菌素(STZ)(200mg/kg)腹腔内注射进CD1小鼠体内会导致1型糖尿病(T1D)，这是因为STZ对产生胰岛素的胰腺β细胞具有毒性。STZ-CD1T1D小鼠在注射STZ后的6个月内发展为与肾小管间质纤维化相关的慢性肾脏疾病并且肾功能下降(Sugimoto2007)。STZ-CD1小鼠表现出严重的肾小管间质纤维化、中度肾小球系膜基质扩张和中度蛋白尿(Kitada 2016)。

CD1小鼠(7周大，Charles River)在8周龄被腹膜内注射媒介物或STZ(在10mM柠檬酸钠中，pH 4.5，200mg/kg)，以诱导T1D。注射STZ后3天，通过尿液试纸测试确认T1D。每只小鼠被单独安置在代谢笼中。小鼠随机分为6组(每组n＝12)并从STZ注射后1个月开始接受治疗，腹腔注射每周两次达2个月如下：第1组：仅CD1小鼠+媒介物；第2组：STZ-CD1 T1D小鼠+正常人IgG(10mg/kg)作为阴性和同型对照；第3组：STZ-CD1 T1D小鼠+鼠抗MBG mAb3E9作为阳性对照；第4组：STZ-CD1 T1D小鼠+测试的抗MBG抗体(例如H3L2、236/237或2A-F8)(1mg/kg)；第5组：STZ-CD1 T1D小鼠+测试的抗MBG抗体；和第6组：STZ-CD1 T1D小鼠+测试的抗MBG抗体。注射STZ 3个月后牺牲小鼠。

关于临床参数的评估，每周通过尾部容积描记法监测收缩压。在治疗的最后一周收集24小时尿液样本。尿白蛋白通过ELISA(Exocell,Philadelphia,Pennsylvania)进行测量。血清或尿肌酐通过高压液相色谱(HPLC)进行测量。通过与纯肌酐(10-50ng)的标准曲线比较来定量肌酐。

为了进行组织病理学分析，取出灌注的肾脏并在福尔马林中固定过夜，并用高碘酸-Schiff对切片进行染色。分析载玻片以评估肾小球扩张和硬化的程度。在单个切片上的每个肾小球的等级为0到4，其中0表示无病变，而1、2、3和4分别表示肾小球系膜基质扩张或硬化涉及<25、25-50、50-75或>75％的肾丝球丛区域。使用苦味酸-天狼星红(picrosirius)染色来评估肾小管间质纤维化，如Zhang等人(2012)所述。

对于免疫组织学，在通过如Kato等人(1999)所述的间接免疫荧光并半定量染色的低温恒温器切片上检测到肾脏中的促纤维化介质(例如TGF-β和CTGF)和促炎性细胞因子(例如TNF-α、IL-6和MCP-1)。

使用Student’s t检验进行统计分析。p值≤0.05被认为具有统计学意义。

示例15.晚期糖尿病性肾病的ZDF大鼠模型

Zucker糖尿病性脂肪(ZDF,Lepr

将雄性ZDF大鼠(10周龄，Charles River)和雄性瘦的(ZL)对照大鼠(10周龄，Charles River)分别置于代谢笼中。从15周开始，在禁食条件下监测大鼠的血糖水平升高。糖尿病定义为血糖水平>250mg/dL。蛋白尿通过ELISA(Exocell)测量。仅将具有明显白蛋白尿的高血糖大鼠放入治疗组并进行治疗。预计到22周龄时，ZDF大鼠的肾脏病理会很明显(Chander 2004)。

将大鼠随机分为6组(每组n＝5)，并在糖尿病发作后每周两次腹膜内注射，如下：第1组：仅ZL大鼠+媒介物；第2组：ZDF糖尿病大鼠+正常人IgG作为阴性和同型对照；第3组：ZDF糖尿病小鼠+鼠抗MBG mAb 3E9(10mg/kg)作为阳性对照；第4组：ZDF糖尿病小鼠+测试的抗MBG抗体(例如H3L2、236/237或2A-F8)(1mg/kg)；第5组：ZDF糖尿病小鼠+测试的抗MBG抗体；第6组：ZDF糖尿病小鼠+测试的抗MBG抗体。当大鼠显示出发病迹象或39周龄时将其处死。

与以上针对DN的STZ-CD1小鼠模型所述类似，进行临床参数、组织病理学分析、免疫组织学和统计分析的评估。

示例16.抗MBG抗体防止MBG对Na

Na

Na

使用孔雀绿磷酸盐测定法测定磷酸盐。将磷酸盐标准品或样本添加到96孔板的每个孔中，然后加入试剂A。加入试剂B，混合并孵育。然后在微板分光光度计中于630nm读取OD。哇巴因或MBG能够显著抑制NKA活性。发现抗MGB小鼠抗体3E9和人源化抗体H3L2降低了MBG对NKA的抑制作用(图4)。

示例17：生物样本中MBG的测量

尿液中的MBG水平通过竞争性ELISA(改动自Abi-Ghanem等人，J ImmunoassayImmunochem.32:31-46(2011))进行测量。用抗MBG抗体涂覆孔。然后将包含MBG(已知或未知)和MBG-BSA的样本添加到孔中。将HRP抗BSA抗体添加到每个孔中，然后与TMB(K&P Labs)反应。停止反应，并在450nm读取孔。使用已知量的MBG的样本制备标准曲线(图5)。测定尿液样本并与标准曲线比较。从标准曲线的线性范围计算尿液样本中MBG的浓度。尿液样本中发现的MBG的量与文献报道的值相似。例如，一式两份地分析了人类尿液样本#3，得到的OD值为0.140和0.149。从标准曲线来看，这些值对应于224.6+/-23.7pg/mL MBG。尽管本示例利用尿液样本来测量MBG，但任何生物液体/样本都可以用于测定。

应当理解，尽管已经图示和描述了特定实施例，但是可以对其进行各种改动并且在本文中进行了构想。还应理解，本公开内容不受本文提供的具体示例的限制。本文中对本公开内容的实施例和示例的描述和图示不旨在以限制性的意义来解释。还应理解，本公开内容的所有方面不限于本文阐述的具体描述、构造或相对比例，其可以取决于多种条件和变量。本公开内容的实施例和示例的形式和细节上的各种改动和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，可以预期的是，本公开内容还涵盖任何和所有这样的改动、变化和等同形式。

序列表

<110> Panorama研究机构

<120> 抗海蟾蜍毒素抗体及其应用

<130> PRI.0002

<160> 103

<170> PatentIn版本3.5（PatentIn version 3.5）

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人源化VH序列（Humanized VH sequence）

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人源化VH序列（Humanized VH sequence）

<400> 10

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人源化VH序列（Humanized VH sequence）

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人源化VL序列（Humanized VL sequence）

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

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Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人源化VL序列（Humanized VL sequence）

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Val Leu Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 111

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 15

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Arg Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Arg Asn

20 25 30

Gly Val Ser Trp Tyr His Gln Val Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Leu Ser His Asp Gly Leu Val Thr Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser

50 55 60

Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu His

65 70 75 80

Ser Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser

100 105 110

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 16

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 17

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 18

Ala Arg Ala Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Val Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 19

Ala Ser Asn Ile Gly Arg Asn Gly

1 5

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<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 20

His Asp Gly

1

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 21

Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Val Val

1 5 10

<210> 22

<211> 120

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 22

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ala Ser Ile Ala Ala Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 23

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 24

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 25

Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 26

Ala Arg Ala Ser Ile Ala Ala Arg Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 27

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr

1 5

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 28

Asp Asn Asn

1

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 29

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 30

<211> 118

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 30

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Gln Leu Lys Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Arg Pro Pro Ala Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 31

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Arg Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 32

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 33

Ala Arg Val Arg Pro Pro Ala Ala Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 34

Glu Asn Asn

1

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 35

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Arg Ala Val Val

1 5 10

<210> 36

<211> 119

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Asn Leu Arg Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 37

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 38

Ala Arg Val Asn Leu Arg Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 39

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 40

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val

1 5 10

<210> 41

<211> 125

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 41

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Val Val Ala Arg Thr Gly Thr Thr Ile Ser Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 42

<211> 115

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 42

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Asp Thr

20 25 30

Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr

35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile

65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 43

Ala Arg Val Val Val Ala Arg Thr Gly Thr Thr Ile Ser Trp Phe Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 44

Ser Gly Ile Asn Val Asp Thr Tyr Arg

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 45

Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 46

Val Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val

1 5

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<211> 121

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 47

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

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Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Ala Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 110

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 48

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ala Trp Asp Gly Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 49

<211> 13

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 49

Ala Arg Leu Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Ala Asp Pro

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<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 50

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile

1 5

<210> 51

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 51

Asn Asn Asn

1

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 52

Val Ala Trp Asp Gly Ser Leu Ser Gly Val Val

1 5 10

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 53

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

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100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 109

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 54

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Glu Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 55

<211> 13

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 55

Ala Arg Phe His Thr Trp Ala Pro Arg Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 56

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Leu

1 5 10

<210> 57

<211> 120

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 57

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Gln Leu Trp Gln Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 112

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 58

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 59

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 60

Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 61

Ala Arg Val Gln Leu Trp Gln Arg Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 62

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 63

Leu Gly Ser

1

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 64

Met Gln Ala Leu Gln Ala Pro Leu Thr

1 5

<210> 65

<211> 115

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Thr Trp Ser Asp Tyr Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 215

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 66

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Arg

20 25 30

Arg Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 67

Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 68

Ile Asn His Ser Gly Ser Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 69

Val Thr Trp Ser Asp Tyr Arg Asp Tyr

1 5

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 70

Gln Ser Val Thr Ser Arg Arg

1 5

<210> 71

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 71

Gly Ala Ser

1

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 72

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 73

<211> 126

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 73

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Thr Thr Tyr Ser Tyr Gly Pro Gly Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

<210> 74

<211> 216

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 74

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Tyr

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Val Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Thr Gln Arg Pro Ser Glu Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Thr Leu Asp Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Asn Leu

85 90 95

Lys Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Ala Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 75

Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 76

<211> 13

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 76

Ala Arg Thr Thr Tyr Ser Tyr Gly Pro Gly Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 77

Ser Ser Asn Ile Gly Thr Tyr Tyr

1 5

<210> 78

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 78

Asp Asn Thr

1

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 79

Ala Thr Trp Asp Ser Asn Leu Lys Ser Val Val

1 5 10

<210> 80

<211> 126

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 80

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Met Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Trp Tyr

100 105 110

Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 81

<211> 181

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 81

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Phe Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr

180

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 82

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr

1 5 10

<210> 83

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 83

Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 84

<211> 18

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 84

Ala Arg Val Met Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Trp Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Leu

<210> 85

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 85

Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Phe

1 5

<210> 86

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 86

Glu Asn Ser

1

<210> 87

<211> 122

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 87

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Pro Ala Ile Arg Ser Ser Ala Ile Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 217

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 88

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Phe Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Thr Gly Val Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

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210 215

<210> 89

<211> 14

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 89

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<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 90

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1 5

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 91

Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Gly Ala Val

1 5 10

<210> 92

<211> 121

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 92

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Pro Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 93

<211> 216

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 93

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn

20 25 30

Thr Gly Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 94

Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 95

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 95

Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 96

<211> 14

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 96

Ala Arg Val Ala Pro Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 97

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 97

Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn Thr

1 5

<210> 98

<211> 3

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 98

Ser Asn Asn

1

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 99

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val

1 5 10

<210> 100

<211> 118

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 100

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Phe Ser Arg Gly Gly Pro Phe Leu Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 101

<211> 216

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 101

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr

20 25 30

Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

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50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 102

<211> 10

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 102

Ala Arg Phe Ser Arg Gly Gly Pro Phe Leu

1 5 10

<210> 103

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 103

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Ser

1 5