fkbp39突变体果蝇模型的构建及其鉴定方法

摘要

本发明涉及一种fkbp39突变体果蝇模型的构建及鉴定方法，通过显微注射到的方式获得了fkbp39的突变体果蝇品系，并通过与doublebalance果蝇进行杂交与回交得到带有平衡基因且可以稳定遗传的fkbp39突变体果蝇；最后利用PCR和westernblot的方法，鉴定了fkbp39突变体果蝇。本发明利用Crispr/cas9和显微注射技术，构建了fkbp39突变体果蝇模型，为FK506免疫抑制来治疗与TOR失调而引起的疾病提供了材料。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种关于fkbp39突变体果蝇模型的构建方法及其鉴定方法和用于抗体制备的Fkbp39蛋白的表达方法，属于生物技术领域。

技术背景

黑腹果蝇作为一种十分常见的模式生物，具有个体小，生命周期短，易于大规模培养和进行突变体筛选等优点(万永奇，2006)，现在越来越多的被用来筛选特效药和作用靶点。

FK506结合蛋白(FKBPs)属于免疫亲合蛋白家族，以其对FK506和雷帕霉素的免疫抑制作用而闻名。最近的研究还表明，在没有雷帕霉素的情况下，FK506结合蛋白可以调节Akt-mTOR信号传导(Felix Hausch et al.,2013)。且Fkbp39作为FKBPs家族蛋白中的一员，过表达Fkbp39具有抑制自噬的作用，他克莫司(FK506)公认的作用通路是通过与FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)结合，抑制活化T细胞核因子(nuclear factor ofactivated T cells，NFAT)的活性来降低白介素(interleukin，IL)-2的合成，从而减少T淋巴细胞的增殖和分化。NFAT不仅在T细胞中表达，在全身各组织细胞也分布广泛(Shou Jetal.,2015)。此外，他克莫司还可通过与FKBPs结合，将FKBPs从其原先结合的蛋白上移除，从而终止其原有功能，影响细胞中的其它与增殖、分化相关的信号通路。

发明内容

本发明利用Crispr/cas9的方法构建了fkbp39突变体果蝇，并利用PCR和westernblot的方法进行了突变体筛选的验证。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

Fkbp39蛋白表达纯化的方法，其具体步骤为：首先构建了一段fkbp39的基因片段，再利用基因重组技术将fkbp39重组进pET-28a质粒中，得到目的质粒：pET-28a-fkbp39。接下来利用不同浓度的IPTG诱导Fkbp39蛋白表达。

fkbp39突变体果蝇模型的构建方法，其具体步骤为：首先构建两对位于fkbp39基因两端的gRNA，再利用基因重组技术将两对gRNA重组进pBFv-6.2B质粒中，得到目的质粒：pBFv-6.2B-fkbp39-gRNA。

本发明通过显微注射到的方式获得了fkbp39的突变体果蝇品系，并通过与doublebalance果蝇进行杂交与回交得到带有平衡基因且可以稳定遗传的fkbp39突变体果蝇；最后利用PCR和westernblot的方法，鉴定了fkbp39突变体果蝇。

本发明利用Crispr/cas9和显微注射基因技术和果蝇杂交技术，构建了fkbp39突变体果蝇模型，为FK506免疫抑制来治疗与TOR失调而引起的疾病提供了材料。

附图说明

图1为pET-28a-fkbp39的电泳图；

图2为IPTG诱导的Fkbp39的SDS-PAGE图；

图3为纯化过的Fkbp39的SDS-PAGE图。

图4为pBFv-6.2B-fkbp39-gRNA的电泳图，图中，1-3泳道分别为：pBFv-6.2-fkbp39-63双酶切产物、pBFv-6.2B-fkbp39-1018双酶切产物、pBFv-6.2B-fkbp39-gRNA；

图5为显微注射得到带有平衡基因的fkbp39突变体果蝇和doublebalance果蝇杂交，得到可以稳定遗传的sp/SM6；fkbp39-/MKRS果蝇，使用鼠尾直接PCR试剂盒(bimake公司)进行的PCR鉴定的电泳图；

图6为westernblot鉴定fkbp39突变体；

图7为实施例一中，果蝇杂交的流程示意图。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种fkbp39突变体果蝇的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术路线：

实施例一：gRNA的设计本实验在fkbp39基因前63碱基与距离末端1018碱基处各设计一对gRNA。在两对gRNA 5’端加上BbsⅠ酶切位点，靶点正反向引物进行退火：10μL正向引物(10μM)、10μL反向引物(10μM)、80μL、80μL去离子水，80℃反应5min然后以-0.1℃/sec的速度降到20℃，使正反向引物复性形成双链。

引物序列如下：

fkbp39 crispr site 63-F：5’——CTTCGTCGTTCCACATCTCGGGCG——3’

fkbp39 crispr site 63-R：5’——AAACCGCCCGAGATGTGGAACGAC——3’

fkbp39 crispr site 1018-F：5’——CTTCGTGGAGTTCGGTCCGATCTT——3’

fkbp39 crispr site 1018-R：5’——AAACAAGATCGGACCGAACTCCAC——3’

用BbsⅠ内切酶消化pBFv-6.2、pBFv-6.2B载体：1μg载体用BbsⅠ内切酶(NEB公司)酶切，内切酶方案参考NEB公司产品说明书，酶切产物进行胶回收纯化。

连接复性双链与酶切过的pBFv-6.2、pBFv-6.2B载体：4μL酶切过的pBFv-6.2、pBFv-6.2B载体、4μL复性双链、1μL T4 DNA连接酶、1μL buffer，16℃过夜连接后转化至DH5α中，挑单克隆后经测序证明了目的片段的准确性，说明正确的目的片段已经插入到载体中，pBFv-6.2-fkbp39-63、pBFv-6.2B-fkbp39-1018质粒构建成功。

EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切pBFv-6.2-fkbp39-63、pBFv-6.2B-fkbp39-1018，酶切产物进行胶回收纯化。

最后将双酶切的pBFv-6.2-fkbp39-63、pBFv-6.2B-fkbp39-1018，T4连接酶16℃，转化DH5α，得到pBFv-6.2B-fkbp39-gRNA，测序正确，如图4。

最后进行显微注射，将pBFv-6.2B-fkbp39-gRNA质粒注射入nos-Cas9果蝇胚胎中，将注射得到的果蝇成虫与MKRS/TM6B进行单只杂交，然后PCR鉴定子代果蝇，将鉴定有fkbp39突变体果蝇的果蝇管中的所有子代果蝇再次与MKRS/TM6B进行单只杂交，最终得到fkbp39突变体果蝇，如图7。

实施例二：下面是一种IPTG诱导的用于制备Fkbp39抗体的蛋白片段的表达方法，具体步骤如下。

为得到pET-28a-fkbp39原核表达载体，首先以果蝇S2细胞的cDNA为模板进行PCR扩增得到目的片段，将得到的目的片段克隆到pET-28a中，如图1。

引物如下：

fkbp39clonetopET-28a F:

5’——ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCatgtcgatgttttggggt——3’

fkbp39clonetopET-28a R:

5’——CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCctaatgcacagctttcagt——3’

将pET-28a-fkbp39原核表达载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液提取质粒；

将提取的质粒，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经过选择性培养、单克隆液体培养、PCR检测，选择带有目的条带的菌液，转接培养；

在转接培养的LB培养基中加入IPTG，使IPTG终浓度为1mmol/L，20℃诱导Fkbp39蛋白表达12h，如图2；

取上述步骤制得的菌液，离心弃上清。在沉淀中加入菌体5倍体积量的loadingbuffer混匀，进行超声裂解，离心，得到含有Fkbp39蛋白的上清液，

将得到含有Fkbp39蛋白的上清装到含有Ni-Agarose Resin填料的层析柱中，弃去流传液，使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白，再使用适量ElutionBuffer洗脱，收集洗脱液；

最后用超滤的方式进行提纯，最终得到Fkbp39蛋白，如图3。

最后将得到的Fkbp39蛋白送公司进行抗体的制备，得到Fkbp39抗体。

实施例三：fkbp39突变体果蝇的验证

1.使用鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)，取sp/SM6；fkbp39-/MKRS和sp/SM6；fkbp39-果蝇一只分别加入100μlproteasemixture中碾碎，55℃水浴15min，再将混合液95℃水浴5min，离心取上清为模板，进行PCR鉴定，见图5。

引物序列如下：

fkbp39seq F:5’——CTCCGACCGCGCTTTTATTG t——3’

fkbp39seq R:5’——TGAACAGCCGGAAAACAGAGT t——3’

2.使用anti-Fkbp39抗体用westernblot方法检测，取sp/SM6；fkbp39-/MKRS和sp/SM6；fkbp39-果蝇一只分别加入100μllysisbuffer碾碎，加入25μl的5×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min，做westernblot，转膜。一抗：Fkbp391：1000，二抗HRP mouse1：4000，进行ECL显影见图6。