一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测引物、探针及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测试引物、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，本发明还提供基于该引物和探针制备的一种免提取的镰刀形红细胞贫血症的基因检测试剂盒。本发明的检测试剂盒采用直接扩增的反应体系，该反应体系具有较高的耐抑制物干扰的高特异性扩增系统，能够很好抵抗检测的样本中包括内源性或外源性的干扰物质，同时扩增体系中引入了高效的内标系统，大大提高了检测结果的准确度和可信度；而且试剂盒能直接对血液样本进行检测，而无须提取样本的核酸，方便快捷，节省时间。本发明的免提取的镰刀形红细胞贫血症基因检测试剂盒灵敏度高、成本低，且能快速检测镰刀形红细胞贫血症的基因型，值得临床推广。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学临床诊断领域，更具体地，涉及一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测试引物、探针及其试剂盒。

背景技术

镰刀形红细胞贫血症是一种常染色体隐性基因遗传病，患病者的血红蛋白分子结构表现异常，主要症状是贫血。病人衰弱、头晕、气短、心脏有杂音和脉搏增高；血液血红蛋白(Hb)含量仅及正常人(每100毫升血15～16克)的一半；红细胞不仅数量少而且异常；出现许多长而薄，看起来像镰刀的新月形红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。

镰刀形红细胞贫血症是一种“分子病”，即分子结构、特别是蛋白质分子结构发生遗传性变化而造成的病变。异常血红蛋白β链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子β链EF角上的“口袋”，这使两条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。当血液脱氧合(不携氧)时，镰刀形细胞大大增多。这种细胞极脆，易破损造成血液血红蛋白低水平。更严重的后果是某些器官的毛细血管被这些长形异常细胞堵塞，这是许多镰刀形红细胞贫血症病人早死的主要原因。镰刀形红细胞贫血病是从双亲处接受Hb突变基因的一种遗传病。如只从父母一方得到此异常基因，则仅有约1％的红细胞镰刀形化，这种人只有轻微的镰刀形红细胞贫血症症状，如避免强烈的运动或其他使循环系统紧张的状态，可过完全正常的生活。

镰刀形细胞性贫血症由β链基因点突变引起，该病的主要原因是因为珠蛋白的β基因发生单一碱基突变，正常β基因的第6位密码子为GAG，编码谷氨酸，突变后为GTG，编码缬氨酸，使成为HbS。在纯合子状态，当形成HbS后，Hb S在脱氧状态下聚集成多聚体，因形成的多聚体排列方向与膜平行，与细胞膜的接触又非常紧密，所以当多聚体达到一定量时，细胞膜便由正常的双凹形盘状变成镰刀形。该细胞僵硬，变形性差，易破而溶血，造成血管阻塞、组织缺氧，损伤、坏死。在杂纯合子状态，镰刀状细胞则是由HbS、HbA杂合而成。患者从父母继承了一个正常的β基因和一个异常的β基因，与α组成HbS。这种患者H bS占20％～45％，其余为HbA，患者平时往往无症状，因HbS浓度低在一般情况下细胞并不变形。然而在特殊缺氧条件下，红细胞可能发生镰变，此类型往往不需要治疗，但应避免高山等缺氧环境。

迄今为止，该病目前没有特效治疗手段或能真正治愈的药物，主要靠输血维持，患者多在成年前死亡。此外就是应用基因诊断做出产前诊断，降低发病率。目前镰刀形细胞性贫血症的基因诊断可采用PCR-限制性内切酶谱分析法，先用 PCR从患者基因组DNA扩增含突变位点的珠蛋白基因片段，再选择适当的限制性内切酶水解PCR产物，根据酶切产物在电泳图谱上的片段数量和大小做出判断。也可与特意的寡核苷酸探针进行Southern印记杂交分析，根据杂交图谱做出判断。但上述的检测方法存在步骤多，人工操作繁琐，时间比较长，检测灵敏度低，特异差。目前亟需开发一种灵敏度高、成本低且能快速检测镰刀形红细胞贫血症的基因检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服上述目前现有技术中镰刀形细胞性贫血症的基因诊断技术的不足和缺陷，提供一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测引物、探针及其试剂盒，该发明从根本解决现有技术所存在问题和困难，只通过采用实时荧光P CR的检测技术，操作简便快捷，所使用的仪器容易普及，易于推广使用，大大节省人力物力，提高检测效率。

本发明的第一个目的是提供一种镰刀形红细胞性贫血症的基因检测引物。

本发明的第二个目的是提供一种镰刀形红细胞性贫血症的基因检测探针。

本发明的第三个目的是提供以上所述引物和/或所述探针在制备镰刀形红细胞性贫血症的基因检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种免提取的镰刀形红细胞贫血症检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明提供一种镰刀形红细胞性贫血症的基因检测引物，包括用于扩增镰刀形红细胞贫血症靶基因的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。

所述镰刀形红细胞贫血症靶基因为HBB基因SNP位点rs334(c.20)。

一种镰刀形红细胞性贫血症的基因检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。

优选地，所述探针的核苷酸序列中5’端起第1～4个碱基和第26～29个碱基采用硫代修饰，5’端起第16～18个碱基采用锁核酸修饰。

优选地，所述探针的5’端标记FAM荧光发生基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。

本发明要求保护以上所述引物和/或所述探针在制备镰刀形红细胞性贫血症的基因检测试剂盒中的应用。

本发明还要求保护一种免提取的镰刀形红细胞贫血症检测试剂盒，包含以上所述引物和所述探针。

优选地，所述引物的上游引物的使用浓度为0.1～3pmol，所述下游引物的使用浓度为5～30pmol；所述探针的使用浓度为1～20pmol。

更优选地，所述引物的上游引物的使用浓度为1pmol，所述下游引物的使用浓度为10pmol；所述探针的使用浓度为5pmol。

优选地，所述试剂盒还包括用于扩增内标的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示，以及用于检测内标的探针，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示。

更优选地，所述内标为人基因组G6PDH基因的区域。

更优选地，所述用于检测内标的探针的5’端标记HEX荧光发生基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。

更优选地，所述用于扩增内标的上游引物和下游引物的使用浓度为5～30pmol，所述用于检测内标的探针的使用浓度为1～20pmol。

进一步更优选地，所述用于扩增内标的上游引物和下游引物的使用浓度为5pmol，所述探针的使用浓度为5pmol。

优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品或ddH

更优选地，所述PCR缓冲液包括pH为8.5～9.0的180～200mmol/L Tris HCl， 180～200mmol/L(NH4)

进一步更优选地，所述PCR缓冲液包括pH为9.0的200mmol/L Tris HCl， 200mmol/L(NH4)

更优选地，所述阴性质控品包括含HBB基因SNP位点rs334(c.20)的野生型质粒、含HBB基因SNP位点rs334(c.20A>C)的质粒和含HBB基因SNP位点 rs334(c.20A>G)的质粒，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～9所示；所述阳性质控品为含HBB基因SNP位点rs334(c.20A>T)的质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述试剂盒的PCR扩增和熔解程序为：预变性，95℃10min，1 个循环；变性，95℃15s；退火，58℃20s，采集荧光；延伸，72℃20s，45个循环；变性，95℃1min，1个循环；保温，30℃1min，1个循环；熔解，30～ 90℃；0.5℃/s的升温速率，采集荧光。

优选地，所述试剂盒的检测样本类型为血液或血斑卡。

更优选地，如果检测样本是液体状则无需处理直接作为检测样本；如果样本是固状样本时，则将新鲜采集的固状样本放置于生理盐水中使其混悬，以得到的混悬液作为检测样本。

优选地，所述试剂盒根据有无扩增曲线和熔解峰的TM值来判断基因型，判断方法如下：

(1)当在靶基因通道中只有单个TM值的熔解峰，TM值在68±2之间，表示待测靶序列SNP位点与设计探针完全匹配，并且有扩增曲线，其基因型为突变纯合子；

(2)当在靶基因通道中只有单个Tm值熔解峰，TM值在60±2之间表示待测靶序列SNP位点与设计探针不匹配，并且没有扩增曲线，其基因型为野生纯合子；

(3)当在靶基因通道中同时有两个Tm值熔解峰，一个TM值在68±2之间，一个TM值在60±2之间，表示待测靶序列SNP位点与设计探针部分匹配，并且有扩增曲线，其基因型为突变杂合子。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供了一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测引物、探针，以及基于该引物和探针制备的一种免提取的镰刀形红细胞贫血症的基因检测试剂盒，其基本原理是：利用Taqman探针对PCR产物的温度熔解特点，进行实时分析的突变检测方法，其扩增步骤与real-time PCR一致，只是在扩增结束后增加熔解曲线分析。在熔解曲线分析阶段，扩增后的靶序列与Taqman探针杂交，在熔解过程中错配碱基的结合牢固程度不如野生序列，因此会在较低的温度下(低野生序列5～20℃)解链，从而形成不同Tm值的荧光信号峰。与现有技术中的SYBR Green熔解曲线分析相比，探针熔解曲线的杂交序列仅20～30bp，故对突变位点的检测更加灵敏和特异。

2、本试剂盒还采用直接扩增的反应体系，该反应体系具有较高的耐抑制物干扰的高特异性扩增系统，能够很好抵抗检测的样本中包括内源性或外源性的干扰物质，同时扩增体系中引入了高效的内标系统，该内标系统与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样、运输、核酸提取和扩增的全部过程是否正常，大大提高了检测结果的准确度和可信度；而且试剂盒能直接对血液样本进行检测，而无须提取样本的核酸，方便快捷，节省时间。本发明的免提取的镰刀形红细胞贫血症基因检测试剂盒灵敏度高、成本低，且能快速检测镰刀形红细胞贫血症的基因型，值得临床推广。

附图说明

图1是样本检测中突变纯合子的熔解曲线图。

图2是样本检测中突变纯合子的扩增曲线图。

图3是样本检测中野生纯合子的熔解曲线图。

图4是样本检测中野生纯合子的扩增曲线图。

图5是样本检测中突变杂合子的熔解曲线图。

图6是样本检测中突变杂合子的扩增曲线图。

图7是样本检测中内标基因的扩增曲线图。

图8-11是样本检测中试剂盒的准确性和特异性的检测结果。

图12-14是样本检测中核酸提取后的和免提取的对比检测结果。

图15-17是样本检测中试剂盒的灵敏度测试结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1镰刀形红细胞贫血症的免提取基因检测试剂盒

一、检测试剂盒的组成

1、镰刀形红细胞贫血症的基因检测引物和探针

针对镰刀形红细胞贫血症的HBB基因SNP位点rs334(c.20)设计用于扩增靶基因和内标的引物，以及用于检测靶基因和内标的探针，其序列如表1所示：

表1镰刀形红细胞贫血症的基因检测引物和探针

2、反应试剂

检测试剂盒的反应试剂主要由以下成分组成：PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品。

PCR反应液包括以上用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、用于检测靶基因和内标的探针、PCR缓冲液、ddH

PCR缓冲液的组成为：pH为9.0的200mmol/L Tris HCl，200mmol/L (NH

具体成分和浓度如表2所示：

表2试剂盒各组分终浓度及含量

其中，阴性质控品包括含HBB基因SNP位点rs334(c.20)的野生型质粒、含 HBB基因SNP位点rs334(c.20A>C)的质粒和含HBB基因SNP位点 rs334(c.20A>G)的质粒，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～9所示；

阳性质控品为含HBB基因SNP位点rs334(c.20A>T)的突变型质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

二、镰刀形红细胞贫血症血液免提取样本的检测方法

1、试剂配制

(1)PCR混合液：将上述PCR缓冲液、引物和探针按表2的浓度和含量进行混合，ddH

根据待检测血液样本、阴性质控品、阳性质控品、阴性质控(TE buffer)的量，按比例(PCR混合液17μL/人份+Taq DNA聚合酶1μL/人份)进行配制，充分混匀成PCR反应液，瞬时离心后按照18μL/人份进行分装至反应管中。

(2)加样和检测

向含有PCR反应液的反应管中，分别加入待检测血液样本、阴性质控品、阳性质控品和阴性质控各2μL，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行扩增检测。以宏石SLAN-96S仪器为例，扩增程序如表3所示：

表3PCR扩增程序

检测通道选择：荧光信号收集设定为FAM和HEX通道，然后编制待检测血液样本、阳性质控品、阴性质控品、阴性质控的样品类型和样本名称。

(3)结果判定

第一：在FAM通道(靶基因通道)只有单个TM值的熔解峰，TM值在68 ±2之间，表示待测靶序列SNP位点与设计探针完全匹配，并且有扩增曲线，其基因型为突变纯合子，如图1和2所示；

第二：在FAM通道(靶基因通道)只有单个Tm值熔解峰，TM值在60±2 之间表示待测靶序列SNP位点与设计探针不匹配，并且没有扩增曲线其基因型为野生纯合子，如图3和4所示；

第三：在FAM通道(靶基因通道)同时有两个Tm值熔解峰，一个TM值在68±2之间，一个TM值在60±2之间，表示待测靶序列SNP位点与设计探针部分匹配，并且有扩增曲线，其基因型为突变杂合子，如图5和6所示。

(4)质量控制

在FAM通道(靶基因通道)，阳性质控品TM值在68±2之间出现单个熔解峰并有扩增曲线，阴性质控品在TM值60±2之间出现单个熔解峰没有扩增曲线，同时在HEX通道(内标通道)出现扩增曲线(如图7)，则试验视为有效。

实施例2试剂盒的准确性和特异性测试

采用上述实施例1中的检测试剂盒和检测方法，以50例临床血液或血斑卡样本作为本次验证准确性和特异性的参考品，其检测的结果与金标准测序进行对比，判断其结果的准确性和特异性。实验结果如表4和图8～11所示。

表4试剂盒的准确性和特异性的检测结果

由以上检测结果可知，本发明试剂盒检测50例临床样本，其检测结果与金标准测序结果对比，阳性符合率为100％，准确性为100％；阴性符合率为100％，特异性为100％。本发明试剂盒的检测结果与已知型别的检测结果完全一致，说明本发明的试剂盒可以稳定用于免提取的临床血液样本检测镰刀细胞贫血症基因型，准确性和特异性高。

实施例3核酸提取后的检测结果和免提取试剂盒的检测结果的对比

采用上述实施例1中的检测试剂盒的检测方法，以验证实施例2的50例临床血液或血斑卡样本中的1例HBS样本和随机抽取19例野生样本作为本次试验的验证。将上述的20例样本按照凯普《核酸提取或纯化试剂(离心柱法BSPC-D-M 型)》进行核酸提取，提取纯化后的核酸DNA与上述20例未提取的样本进行对比试验，检测结果如表5和图12～14所示。

表5核酸提取后的检测和免提取的检测的对比结果

由以上检测结果可知，核酸提取后检测结果与本发明检测试剂盒免提取的检测结果一致，且与已知型别完全相同，即免提取核酸并不影响检测结果，说明本发明的试剂盒可以稳定用于免提取核酸的样本检测镰刀细胞贫血症的基因型。

实施例4试剂盒的灵敏度测试

采用上述实施例1的检测试剂盒和检测方法，以验证实施例3的20例已提取纯化好的DNA样本中的1例HBS样本和随机抽取2例野生样本作为本次试验的验证，DNA样本浓度设置为0.2ng/μL、0.5ng/μL、1ng/μL，并进行10次实验的重复，检测结果如表6和图15～17所示。

表6试剂盒的灵敏度测试结果

由以上检测结果可知，本发明的免提取试剂盒在0.2ng/μL的时候还能检测出来且与已知型别完全相同，因此本发明的试剂盒的最低检出限定为0.2ng/μl，检测灵敏度高。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广州凯普医药科技有限公司

重庆凯普医学检验所有限公司

潮州凯普生物化学有限公司

广东凯普生物科技股份有限公司

<120> 一种镰刀形红细胞贫血症的基因检测试引物、探针及其试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

caggagcagg gagggcagga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ctcttgggtt tctgataggc 20

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

atggtgcatc tgactcctgt ggagaagtc 29

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ttgtggccca gtagtgatcc t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

cgccagggac aggcctggtc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

ctgttccctc tgccacaggg tgacc 25

<210> 7

<211> 337

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 60

ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 120

tgcatctgac tcctgaggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg 180

atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 240

agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 300

gactctctct gcctattggt ctattttccc accctta 337

<210> 8

<211> 337

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 60

ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 120

tgcatctgac tcctgcggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg 180

atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 240

agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 300

gactctctct gcctattggt ctattttccc accctta 337

<210> 9

<211> 337

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 60

ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 120

tgcatctgac tcctggggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg 180

atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 240

agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 300

gactctctct gcctattggt ctattttccc accctta 337

<210> 10

<211> 337

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 60

ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 120

tgcatctgac tcctgtggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg 180

atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 240

agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 300

gactctctct gcctattggt ctattttccc accctta 337