一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒，并提供了一种基于该引物及探针的鉴别呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法。所述方法包括如下步骤：(1)提取呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA并稀释；(2) 对步骤(1)获得的DNA进行taqman SNP荧光探针qPCR；（3）产物检测。通过taqman SNP荧光探针qPCR，能够快速分辨出呼伦贝尔短尾羊纯合子与杂合子。本发明作为呼伦贝尔短尾羊基因分型的手段之一，鉴定方法操作简便，重复性好，反应时间短，具有极高的灵敏性和特异性。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于taqman SNP荧光探针的呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

呼伦贝尔短尾羊是生长在我国呼伦贝尔地区的肉用绵羊品种之一，短而肥厚的尾部是该品系独特的标志。我们利用基因组重测序技术筛选到与脊椎发育相关的T/Brachyury基因作为候选基因，并确定在呼伦贝尔短尾羊群体中存在稳定T/Brachyury基因c.G334T突变，并证明“短尾”这一具有经济价值的性状相关。在绵羊分子育种中，纯合子个体相对于杂合子后代性状表现稳定，因而近年来，人们更倾向于筛选种群中纯合个体作为主要的繁育对象。

传统测序主要以sanger测序法为基础，与具有商业价值相关性状的SNP位点关联作为依据，Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。

传统测序技术存在着用时长、成本高、通量低、DNA模板的组成或二级结构有时引起DNA聚合酶不正常终止的缺点。

发明内容

本发明目的在于提供一种呼伦贝尔短尾羊的鉴定引物、探针、试剂盒及方法，克服传统sanger测序法由于技术限制的原因，一次鉴定的样品数量较少，操作较为繁琐，用时长。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物及探针，其特征在于，序列如下：

正向引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

反向引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’

taqman探针1：5’HEX- TGGCTTGCCCCCCGGCA-BHQ1 3

taqman探针2：5’FAM- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-BHQ1 3，

所述taqman探针1和2为荧光标记探针；

一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括上述鉴定引物及探针，还包括如下成分：PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA，呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒。

优选地，所述PCR反应混合液包括SNP Probe Master Mix（2X）10 ul及RNase-FreeddH

优选地，所述呼伦贝尔短尾羊基因组DNA的浓度为10 ng/ ul，用量为1 ul。

一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法，包括如下步骤：

(a) 提取呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA并稀释；

(b) 荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点，如SEQ IDNO：5的DNA序列所示，所述PCR反应体系包括上述鉴定引物及探针；

(c) PCR反应产物检测。

优选地，所述步骤（b）中PCR反应体系总体积为20 ul，包括SNP Probe Master Mix(2X) 10 ul，正向引物 1.8 ul，反向引物 1.8 ul，正向、反向引物浓度比例为1：10，10 uMtaqman探针1 0.4 ul，10 uM taqman探针2 0.4 ul，10 ng/ul DNA模板1 ul，RNase-FreeddH

优选地，所述PCR反应按照如下反应程序进行：95 ℃预变性：30 s，95 ℃变性：10s，60 ℃退火-延伸：30 s，扩增45个循环，PCR反应结束后在荧光读板仪上进行荧光扫描拍照60 ℃，30 s。

优选地，所述正向引物的浓度为1 uM，反向引物的浓度为10 uM。

优选地，所述SNP Probe Master Mix含有内参荧光染料。

本发明的有益效果：

（1）该分型方法可以取代传统测序，作为呼伦贝尔短尾羊基因分型的手段之一，成本低；

（2）操作简单，定性鉴定速度快，taqman探针基因分型操作只需“获取样品DNA模板-配置体系-机器反应读取结果”三步，耗时2 h，而传统测序办法由于运输和样本质量测定的原因约需三天。

（3）以“taqman探针基因分型”为基础的呼伦贝尔短尾羊鉴定试剂盒一次最多可以鉴定96个样品，相较于原来的技术，通量大大提高。

附图说明

图1是本发明1 %琼脂糖凝胶电泳呼伦贝尔短尾羊基因组DNA；

图2 是本发明的分型结果图。

具体实施方式

实施例1

呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子鉴定引物和探针的设计

呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子鉴定引物和探针的序列如下：

正向引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

反向引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’

taqman探针1：5’HEX- TGGCTTGCCCCCCGGCA-BHQ1 3

taqman探针2：5’FAM- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-BHQ1 3，

所述taqman探针1和2为荧光标记探针。

鉴定引物和探针设计思路为：

将SNP位点所在的序列区间（SNP位点前后各500 bp）片段输入进Primer 5软件中，寻找GC值在55 %左右，TM值在60 ℃左右，引物二聚体、引物自身互补序列不大于4的引物作为正向引物、反向引物。再将SNP位点周围的序列进行分析，找出长度在19到32 bp以内，TM值大于正向、反向引物5到10 ℃、且与正向、反向游引物产生互补数量小于4的序列作为探针序列，将探针和引物序列输入NCBI中的Primer Blast 进行序列比对，找出特异性最佳的引物、探针序列作为正、反向引物以及探针。

设计好的探针和引物输入进Primer 5进行验证：

实施例2

一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括实施例1鉴定正向引物，反向引物，荧光标记taqman探针1、2，PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA及呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒，其中，PCR反应混合液包括SNP Probe Master Mix（2X）（诺唯赞）及RNase-Free ddH

实施例3

一种以实施例1中引物和taqman SNP荧光标记探针为基础的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法，包括如下步骤：

1、呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA样品的提取及稀释：

按照市面上所售柱式血液基因组DNA抽提试剂盒及其说明书进行，所提取得到的基因组DNA的1%琼脂糖凝胶电泳显示条带单一、明亮、无拖尾现象，如图1所示，用Nanodrop等微量紫外分光光度计测量基因组DNA浓度。在使用DNA模板时，用提取基因组DNA试剂盒中的洗脱液进行DNA浓度的稀释，稀释时进行梯度稀释，并将稀释好的样品进行浓度的测量，选择DNA浓度在5-20 ng/ul，优选10 ng/ul进行实验。

2、PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点；

PCR反应体系配置步骤：

按照“先加大体积，后加小体积”的原则添加，首先加入SNP Probe Master Mix(2X)，再向体系中添加RNase-Free ddH

PCR反应体系按照如下配置，总体积为20 ul，组成为SNP Probe Master Mix (2X)（诺唯赞）10 ul，正向引物1.8 ul，反向引物1.8 ul，正向引物的浓度为1 uM，反向引物的浓度为10 uM，10 uM taqman探针1 0.4 ul，10 uM taqman探针2 0.4 ul，10 ng/ul DNA模板1ul，RNase-Free ddH

将PCR管放入ABI 7900HT荧光定量PCR反应仪中，按照如下设定反应程序：

95 ℃预变性：30 s；

95 ℃变性：10 s；

60 ℃退火-延伸：30 s；

扩增45个循环；

PCR反应结束后在荧光读板仪上进行荧光扫描拍照60 ℃，30 s。

所述呼伦贝尔短尾羊标记SNP位点所在其扩增片段中心位置，当PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因，5’端为报告荧光基团，3’端为淬灭荧光基团，PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合，当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异性探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的作用，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光（FAM或HAX）3’端标有BHQ1淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断累积，荧光强度与扩增产物的数量成正比。本发明设计的探针及引物结合荧光定量PCR能够快速、准确的对呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子进行定性鉴定。

本发明提供了一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法，结合实施例加以具体说明，相关领域的人员完全可以根据本发明提供的方法进行适当改动或变更与组合，来实现该技术。需要特别说明的是，所有这些通过对本发明提供的系统进行相类似的改动或变更与重新组合，都被视为在本发明的保护范围和内容中。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgcgcccctt ccttttcag 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcttgcccca gggcaccca 19

<210> 5

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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