树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法

摘要

本发明公开了树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法。采用一锅法在水相中制备新颖的金纳米笼(AuNC)和尿酸氧化酶(UOx)双负载的金属有机骨架化合物(MOF)，将其作为树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物UOx@MOF(AuNC)用于催化尿酸产生过氧化氢，过氧化氢与亚铁离子反应产生·OH羟自由基，·OH羟自由基引起罗丹明B荧光淬灭。拟合混合体系中罗丹明B的荧光发射峰强度与尿酸浓度之间的线性关系，构建基于该杂化物及其串联催化反应的新型荧光探针，用于尿酸的高灵敏和特异性定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于纳米人工酶杂化物和串联催化型荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物构建的串联催化型荧光探针的制备方法，该制备的探针可用于生物流体中尿酸的高灵敏和特异性定量检测。

背景技术

尿酸(Uric acid,UA)化学结构为三氧基嘌呤，是嘌呤代谢的终产物，各种嘌呤氧化后生成尿酸随尿排出。当体内产生过多的尿酸而不能及时排出时，会导致人体的体液变酸，影响人体细胞正常功能，甚至引发痛风。血中尿酸全部从肾小球滤过，大部分尿酸在近曲小管和肾小球腔内被重吸收，仅少部分尿酸排出。健康人体内尿酸的生成与排泄速率基本恒定，体液中尿酸含量的变化反映出人体内代谢、免疫等机能的状态。对尿酸的检测对于人体内代谢和免疫机能，以及尿酸相关疾病的早期筛查、精准诊断和治疗都具有重要意义。

文献研究表明，尿酸常用的检测技术主要包括高效液相色谱法、比色法、毛细管电泳法、化学发光法、电化学法、表面等离子共振法、荧光法等。例如， Xiaohui Gao等发展了一种金银双金属纳米粒/氧化石墨烯/硫堇复合物修饰的玻璃碳电极用于比率电化学检测尿酸(Xiaohui Gao,Rijun Gui,Kendrick Qizhou Xu, Huijun Guo,Hui Jin,ZonghuaWang.A bimetallic nanoparticle/graphene oxide/thionine composite-modifiedglassy carbon electrode used as a facile ratiometric electrochemical sensorfor sensitive uric acid determination.New Journal ofChemistry,2018,42,14796-14804)。肖玉秀等公开了一种镧系MOF纺丝纤维膜作为检测尿酸传感器及其制备方法(肖玉秀；郑曲通.中国发明授权公布号: CN1092831648)。

本发明公开了一种高效检测尿酸的新方法，设计制备了一种新颖的金纳米笼(Gold nanocage,AuNC)和尿酸氧化酶(Urate oxidase,UOx)双负载的金属有机骨架化合物(Metal-organic frameworks,MOF)，将其作为树叶状金属有机骨架纳米人工酶UOx@MOF(AuNC)杂化物，构建基于该杂化物和串联催化反应的新型荧光探针用于高灵敏和特异性定量检测尿酸。目前，尚未有UOx@MOF(AuNC) 杂化物及其串联催化型尿酸荧光探针的国内外文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于发展了一种设计新颖和简单高效的基于树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物构建的串联催化型荧光探针的制备方法，该制备的探针可用于生物流体中尿酸的高灵敏和特异性定量检测。

为实现上述目的，本发明涉及的树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针，其制备方法包括以下步骤：

(1)称取一定量硝酸锌和2-甲基咪唑分别配制成水溶液，在室温磁力搅拌下将硝酸锌和2-甲基咪唑的水溶液充分混合成均质溶液；加入一定量商品化金纳米笼分散液，搅拌反应一段时间；然后加入一定量尿酸氧化酶，继续搅拌反应一段时间；反应结束后，产物溶液在低温静置，再进行离心分离、反复洗涤和冷冻干燥的处理，最后制得金纳米笼和尿酸氧化酶双负载的金属有机骨架化合物UOx@MOF(AuNC)杂化物；

(2)配制UOx@MOF(AuNC)杂化物的水分散液，在室温磁力搅拌下，向其中依次加入一定量的尿酸、硫酸亚铁和罗丹明B，充分混合形成均质混合液；

(3)固定硫酸亚铁和罗丹明B在均质混合液中的浓度不变，逐渐增大尿酸的浓度，分别测量不同尿酸浓度所对应均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度相对值(F

步骤(1)中所述的硝酸锌用量为0.1～0.3毫摩尔，2-甲基咪唑用量为1～3 毫摩尔，纳米笼分散液用量为1-2毫升，尿酸氧化酶用量为5～25毫克，均质溶液体积为10～50毫升，反应时间为5～30分钟，静置温度为0～5摄氏度，静置的时间为6～24小时，离心转速为3000～8000转/分钟，离心时间5～30分钟；

步骤(2)中所述的尿酸在均质混合液中的浓度调节为0～300微摩尔/升；

步骤(3)中所述的尿酸浓度的线性检测范围为0.01～300微摩尔/升，检测限为0.01～10微摩尔/升。

本发明的效果是公开了基于树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物构建的串联催化型荧光探针的制备方法。采用一锅法在水相中制备新颖的金纳米笼 (AuNC)和尿酸氧化酶(UOx)双负载的金属有机骨架化合物(MOF)，将其作为树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物UOx@MOF(AuNC)。尿酸被该杂化物催化产生过氧化氢，过氧化氢与亚铁离子反应产生·OH羟自由基，·OH羟自由基与罗丹明B反应引起罗丹明B脱色和荧光淬灭。基于在UOx@MOF(AuNC)存在下，尿酸引发的串联催化反应和罗丹明B荧光淬灭，通过构建混合体系中罗丹明B 的荧光发射峰强度与尿酸浓度之间的线性关系，获得基于UOx@MOF(AuNC) 杂化物及其串联催化反应的新型荧光探针，用于尿酸的高灵敏和特异性定量检测。

附图说明

图1.树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法与原理示意图；

图2.制备的树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物的透射电子显微镜图像；

图3.逐渐增大尿酸的浓度，分别测量不同尿酸浓度所对应均质混合液的荧光发射光谱；

图4.拟合荧光发射峰强度相对值(F

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例涉及的树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法与原理示意图如图1所示，具体制备步骤如下：

称取0.15毫摩尔硝酸锌和1毫摩尔2-甲基咪唑分别配制成水溶液，在室温磁力搅拌下将硝酸锌和2-甲基咪唑的水溶液充分混合成均质溶液10毫升；加入 1毫升商品化金纳米笼分散液，搅拌反应10分钟；然后加入10毫克尿酸氧化酶，继续搅拌反应10分钟；反应结束后，产物溶液在4摄氏度静置12小时，再进行5000转/分钟下离心15分钟、反复洗涤和冷冻干燥的处理，最后制得树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物UOx@MOF(AuNC)，如图2。配制UOx@MOF(AuNC)杂化物的水分散液10毫升，在室温磁力搅拌下，向其中依次加入尿酸、硫酸亚铁和罗丹明B，充分混合形成均质混合液，其中尿酸浓度为 0～300微摩尔/升，硫酸亚铁浓度为0.01摩尔/升，罗丹明B浓度为0.1毫克/毫升。逐渐增大尿酸浓度，分别测量不同尿酸浓度所对应均质混合液的荧光发射光谱，如图3。拟合荧光发射峰强度相对值(F

实施例2

本实施例涉及的树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法与原理示意图如图1所示，具体制备步骤如下：

称取0.2毫摩尔硝酸锌和1.5毫摩尔2-甲基咪唑分别配制成水溶液，在室温磁力搅拌下将硝酸锌和2-甲基咪唑的水溶液充分混合成均质溶液15毫升；加入 1.5毫升商品化金纳米笼分散液，搅拌反应15分钟；然后加入15毫克尿酸氧化酶，继续搅拌反应15分钟；反应结束后，产物溶液在4摄氏度静置12小时，再进行5000转/分钟下离心20分钟、反复洗涤和冷冻干燥的处理，最后制得树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物UOx@MOF(AuNC)。配制UOx@MOF(AuNC)杂化物的水分散液10毫升，在室温磁力搅拌下，向其中依次加入尿酸、硫酸亚铁和罗丹明B，充分混合形成均质混合液，其中尿酸浓度为 0～300微摩尔/升，硫酸亚铁浓度为0.01摩尔/升，罗丹明B浓度为0.1毫克/毫升。逐渐增大尿酸浓度，分别测量不同尿酸浓度所对应均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度相对值F

实施例3

本实施例涉及的树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物及其串联催化型荧光探针的制备方法与原理示意图如图1所示，具体制备步骤如下：

称取0.25毫摩尔硝酸锌和2毫摩尔2-甲基咪唑分别配制成水溶液，在室温磁力搅拌下将硝酸锌和2-甲基咪唑的水溶液充分混合成均质溶液20毫升；加入 2毫升商品化金纳米笼分散液，搅拌反应20分钟；然后加入20毫克尿酸氧化酶，继续搅拌反应20分钟；反应结束后，产物溶液在4摄氏度静置18小时，再进行5000转/分钟下离心20分钟、反复洗涤和冷冻干燥的处理，最后制得树叶状金属有机骨架纳米人工酶杂化物UOx@MOF(AuNC)。配制UOx@MOF(AuNC) 杂化物的水分散液10毫升，在室温磁力搅拌下，向其中依次加入尿酸、硫酸亚铁和罗丹明B，充分混合形成均质混合液，其中尿酸浓度为0～300微摩尔/升，硫酸亚铁浓度为0.01摩尔/升，罗丹明B浓度为0.1毫克/毫升。逐渐增大尿酸浓度，分别测量不同尿酸浓度所对应均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度相对值F

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。