基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法

摘要

本发明提供了一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法，包括：激光光源；根据导入的等间隔切换的叠加相位图对激光光束进行相位调制，产生多焦点阵列的空间光调制器；叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；将多焦点阵列投射至样品面，产生多焦点荧光信号的物镜；采集多焦点荧光信号，得到若干副图像的探测器；对若干副图像进行处理，得到超分辨率图像的控制终端。本发明通过在空间光调制器上同时加载多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图，实现多焦点阵列的产生以及对样品面进行高精度并行数字随机寻址扫描和激发成像，解决了双光子多焦点显微成像系统的机械惯性问题，降低了系统的复杂性，提高了灵活性。

说明书

技术领域

本发明属于光学成像技术领域，尤其涉及的是基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法。

背景技术

光学显微成像系统是生物学家研究生物现象和生命活动的重要工具之一，传统的光学显微成像系统采用宽场照明方式，限制了其成像深度和成像分辨率。激光共聚焦显微镜虽然能实现超分辨成像，但其分辨率受针孔大小的影响。图像扫描显微镜虽然能够提高图像的信噪比，但成像速度慢。多焦点扫描显微镜采用并行的扫描方式，提高成像深度的同时可提高成像速度。

现有多焦点扫描显微镜分为单光子多焦点扫描显微镜和双光子多焦点扫描显微镜，单光子多焦点扫描显微镜的激发波长一般位于可见光波段，相比于红外光穿透深度更弱。双光子多焦点扫描显微镜由于采用红外光激发具有较厚的成像深度，同时受到荧光染料自身吸收截面的影响具有较好的层析能力。但现有的双光子多焦点扫描显微成像系统基本采用扫描振镜实现扫描，系统结构较复杂，且受机械惯性的影响灵活性较差。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法，克服现有双光子多焦点扫描显微成像系统结构复杂，受机械惯性的影响灵活性较差的缺陷。

本发明所公开的第一实施例为一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，其中，包括：激光光源；

空间光调制器，用于接收所述激光光源产生的激光光束，并根据导入的等间隔切换的叠加相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的多焦点阵列；其中，所述叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；

物镜，用于接收所述多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至样品面上，产生多焦点荧光信号；

探测器，用于采集所述多焦点荧光信号，得到若干副图像；

控制终端，用于接收所述若干副图像，并对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，其中，所述激光光源与所述空间光调制器之间设置有第一半波片、偏振分光棱镜、第二半波片以及扩束准直模块；

所述第一半波片和所述偏振分光棱镜用于接收所述激光光源产生的激光光束，并对所述激光光束的出射功率进行调节；

所述第二半波片用于接收调节出射功率后的激光光束，并改变所述激光光束的偏振方向；

所述扩束准直模块用于接收改变偏振方向后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度扩束准直至所述空间光调制器。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，其中，所述空间光调制器与所述物镜之间设置有4f系统、第一反射镜、第二反射镜以及二向色镜；

所述4f系统用于接收所述多焦点阵列，并对所述多焦点阵列中的杂散光进行过滤；

所述第一反射镜和所述第二反射镜用于接收滤除杂散光后的多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至所述二向色镜；

所述二向色镜和所述物镜用于接收所述第一反射镜和所述第二反射镜反射多焦点阵列，并将所述多焦点阵列以平行光的形式投射至样品面上，产生多焦点荧光信号。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，其中，所述控制终端同时与所述探测器和所述空间光调制器连接，所述控制终端用于生成叠加相位图并将所述叠加相位图导入所述空间光调制器，以及控制所述探测器采集所述多焦点荧光信号。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，其中，所述4f系统包括沿光路依次设置的第一透镜、光阑以及第二透镜，所述空间光调制器设置于所述第一透镜的前焦面，所述光阑设置于所述第一透镜的后焦面，所述第一透镜的后焦面与所述第二透镜的前焦面重合。

本发明所公开的第二实施例为一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，其中，包括：

根据导入的等间隔切换的叠加相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，产生随时间移动的多焦点阵列；其中，所述叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；

接收所述多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至样品面上，产生多焦点荧光信号；

采集所述多焦点荧光信号，得到若干副图像；

对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，其中，所述多焦点阵列相位图的生成方法包括：

采用加权相位恢复算法对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新；

当迭代次数达到预设次数时，保持迭代更新过程中的傅里叶面相位不变，并继续执行对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新的步骤，直至所述加权相位恢复算法收敛，得到多焦点阵列相位图。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，其中，所述采用加权相位恢复算法对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新的步骤包括：

对预先设置的输入面振幅和输入面相位进行二维傅里叶变换，得到傅里叶面振幅和傅里叶面相位；

将所述傅里叶面振幅替换为矫正振幅，并对所述矫正振幅和所述傅里叶面相位进行二维逆傅里叶变换，得到更新后的输入面振幅和输入面相位；其中，所述矫正振幅为预设目标振幅与预设矫正系数的乘积；

将更新后的输入面振幅和输入面相位作为输入面振幅和输入面相位，并继续执行对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新的步骤，直至达到预设的迭代次数。

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，其中，所述线性相位光栅相位图中线性相位光栅的表达式为：

所述的基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，其中，所述对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像的步骤包括：

对所述若干副图像中各幅图像的扫描点位置进行高斯数字针孔滤波，得到若干副降噪图像；

对所述若干副降噪图像进行像素重定位处理，并对像素重定位处理后的若干副降噪图像进行图像叠加，得到样品的超分辨率图像。

有益效果，本发明通过在空间光调制器上同时加载多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图，实现多焦点阵列的产生以及对样品面进行高精度并行数字随机寻址扫描和激发成像，解决了双光子多焦点扫描显微成像系统的机械惯性问题，降低了系统的复杂性，提高了灵活性。

附图说明

图1是本发明实施例中提供的一种基于空间光调制器2的双光子多焦点显微成像系统的结构示意图；

图2是本发明实施例中提供的激发均匀染料样品产生的多焦点荧光信号经探测器采集得到的图像；

图3是本发明实施例中提供的多焦点阵列相位图；

图4是本发明实施例中提供的线性相位光栅图；

图5是本发明实施例提供的一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法的实施例流程图。

图6是本发明实施例中提供的改进的加权相位恢复算法原理流程图；

图7是本发明实施例中提供的小鼠肾切片降噪成像图；

图8是图7的小鼠肾切片降噪成像图对应的超分辨重构图；

图9是本发明实施例中提供的铃兰根茎降噪成像图；

图10是图9的铃兰根茎降噪成像图对应的超分辨重构图；

附图中各标记：1、激光光源；2、空间光调制器；3、物镜；4、样品面；5、探测器；6、控制终端；7、第一半波片；8、偏振分光棱镜；9、第二半波片；10、扩束准直模块；11、4f系统；12、第一反射镜；13、第二反射镜；14、二向色镜；15、管镜；101、第三透镜；102、第四透镜；111、第一透镜；112、光阑；113、第二透镜。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在实施方式和申请专利范围中，除非文中对于冠词有特别限定，否则“一”与“所述”可泛指单一个或复数个。

另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

传统的光学显微成像系统采用宽场照明方式，限制了其成像深度和成像分辨率。激光共聚焦显微镜通过点扫描的方式提高了光学显微成像系统的成像深度，同时高精度的共轭针孔的添加将横向分辨率提高至

现有多焦点扫描显微镜分为单光子多焦点扫描显微镜和双光子多焦点扫描显微镜，单光子多焦点扫描显微镜的激发波长一般位于可见光波段，相比于红外光穿透深度更弱。双光子多焦点扫描显微镜由于采用红外光激发具有较厚的成像深度，同时受到荧光染料自身吸收截面的影响具有较好的层析能力。但现有的双光子多焦点扫描显微成像系统基本采用扫描振镜实现扫描，系统结构较复杂，且受机械惯性的影响灵活性较差。

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统，如图1所示，所述系统包括：激光光源1；用于接收所述激光光源1产生的激光光束，并根据导入的等间隔切换的叠加相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的多焦点阵列；其中，所述叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；用于接收所述多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至样品面4上，产生多焦点荧光信号的物镜3；用于采集所述多焦点荧光信号，得到若干副图像的探测器5；用于接收所述若干副图像，并对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像的控制终端6。具体成像过程中，空间光调制器2接收激光光源1产生的激光光束，并根据预先导入的叠加相位图对激光光束进行相位调制，通过不断切换空间光调制器2上的叠加相位图产生随时间移动的多焦点阵列，多焦点阵列经物镜3接收后，由物镜3透射至样品面4上，在样品面4上高精度随机寻址扫描，直至样品面4上被选择的区域全部被激发产生多焦点荧光信号为止，所述多焦点荧光信号经探测器5采集，得到若干副图像并将其传输至控制终端6，控制终端6对接收到的若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像。本实施例通过高速的空间光调制器2对激光光束进行相位调制，生成的多焦点阵列随机寻址激发样品面4上被选区域，等间隔切换空间光调制器2上的相位图，多焦点阵列在样品面4上高精度扫描移动，直至样品面4上被选区域的荧光全部被激发为止，解决了现有多焦点扫描成像中的机械惯性问题，降低了系统的复杂性，提升了灵活性。

在一具体实施方式中，所述激光光源1与所述空间光调制器2之间设置有第一半波片7、偏振分光棱镜8、第二半波片9以及扩束准直模块10。所述第一半波片7和所述第二半波片9用于接收所述激光光源1产生的激光光束，并对所述激光光束的出射功率进行调节；所述第二半波片9用于接收调节出射功率后的激光光束，并改变所述激光光束的偏振方向；所述扩束准直模块10用于接收改变偏振方向后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度扩束准直至所述空间光调制器2。所述准直扩束模块包括第三透镜101和第四透镜102，所述第三透镜101的后焦面与所述第四透镜102的前焦面重合，所述第三透镜101用于接收改变偏振方向后的激光光束，并对所述激光光束进行扩束；所述第四透镜102用于接收扩束后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度准直至所述空间光调制器2。具体成像过程中，激光光源1产生特定波长的脉冲激光，经第一半波片7和偏振分光棱镜8进行出射功率的调节后，从偏振分光棱镜8出射的P偏振光再次经过第二半波片9进行偏振方向的调节，通过转动第二半波片9使空间光调制器2对激光光束的调制效果达到最佳，由第二半波片9出射的激光光束被扩束准直模块10以预设角度扩束准直至空间光调制器2进行相位调制。

在一具体实施例中，所述空间光调制器2与所述物镜3之间设置有4f系统11、第一反射镜12、第二反射镜13以及二向色镜14；所述4f系统11用于接收所述多焦点阵列，并对所述多焦点阵列中的杂散光进行过滤；所述第一反射镜12和所述第二反射镜13用于接收滤除杂散光后的多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至所述二向色镜14；所述二向色镜14和所述物镜3用于接收所述第一反射镜12和所述第二反射镜13反射的多焦点阵列，并将所述多焦点阵列以平行光的形式投射至样品面4上，产生多焦点荧光信号。其中，激光光束在空间光调制器2上的波前相位与在物镜3后孔径面上的波前相位具有一致性。具体成像过程中，空间光调制器2产生的多焦点阵列经过4f系统11滤除杂散光后，由第一反射镜12和第二反射镜13投射至二向色镜14，并由二向色镜14和物镜3以平行光的形式投射至样品面4上，激发样品面4产生多焦点荧光信号。

进一步地，所述4f系统11包括沿光路依次设置的第一透镜111、光阑112以及第二透镜113，所述空间光调制器2设置于所述第一透镜111的前焦面，所述光阑112设置于所述第一透镜111的后焦面，所述光阑112用于滤除除1级衍射光外的其它衍射级光，所述第一透镜111的后焦面与所述第二透镜113的前焦面重合。

在一具体实施方式中，所述物镜3与所述探测器5之间设置有管镜15，在多焦点荧光信号采集过程中，所述物镜3和所述管镜15构成4f系统11，样品面4产生的多焦点荧光信号经物镜3和管镜15构成的4f系统11后，被探测器5采集，得到若干副图像。如图2所示，为激发均匀染料样品产生的多焦点荧光信号经探测器采集得到的图像。

在一具体实施方式中，所述控制终端6同时与所述探测器5和所述空间光调制器2连接，所述控制终端6用于生成叠加相位图并将所述叠加相位图导入所述空间光调制器2，以及控制所述探测器5采集所述多焦点荧光信号。具体成像过程中，控制终端6通过LABVIEW软件同时生成两个同步触发信号，其中一个触发信号用于控制空间光调制器2等间隔切换叠加相位图，即从一张叠加相位图切换到下一张叠加相位图，使得生成的周期性排列的多焦点阵列整体性的移动到下一个扫描位置。在空间光调制器2切换叠加相位图的同时，另一个触发信号用于控制探测器5采集多焦点荧光信号，即空间光调制器2每切换一张叠加相位图，探测器5就采集一次多焦点荧光信号，最终获得与每个扫描位置一一对应的若干副图像。

控制终端6在生成叠加相位图时，首先利用MATLAB软件分别生成多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图，其中，控制终端生成的多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图如图2和图3所示。然后将多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图进行叠加，得到叠加相位图。控制终端6生成多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图的方法将在后续基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法中介绍，本实施例中在此不作赘述。

此外，本发明还提供了一种上述基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像方法，如图5所示，其包括以下步骤：

S1、根据导入的等间隔切换的叠加相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，产生随时间移动的多焦点阵列；其中，所述叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；

S2、接收所述多焦点阵列，并将所述多焦点阵列投射至样品面上，产生多焦点荧光信号；

S3、采集所述多焦点荧光信号，得到若干副图像；

S4、对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像。

具体实施时，空间光调制器根据导入的叠加相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，通过不断切换空间光调制器上的叠加相位图产生随时间移动的多焦点阵列，多焦点阵列经物镜接收后，由物镜透射至样品面上，在样品面上高精度随机寻址扫描，直至样品面上被选择的区域全部被激发产生多焦点荧光信号为止，所述多焦点荧光信号经探测器采集，得到若干副图像并将其传输至控制终端，控制终端对接收到的若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像。本实施例通过高速的空间光调制器对激光光束进行相位调制，生成的多焦点阵列随机寻址激发被选样品的区域，等间隔切换空间光调制器上的相位图，多焦点阵列在样品面上高精度扫描移动，直至样品面上被选区域的荧光全部被激发为止，解决了现有多焦点扫描成像中的机械惯性问题，降低了系统的复杂性，提升了灵活性。

在一具体实施方式中，步骤S1中多焦点阵列相位图的生成方法包括步骤：

S11、采用加权相位恢复算法对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新；

S12、当迭代次数达到预设次数时，保持迭代更新过程中的傅里叶面相位不变，并继续执行对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新的步骤，直至所述加权相位恢复算法收敛，得到多焦点阵列相位图。

本实施例中生成多焦点阵列相位图时，采用加权相位恢复(weighted GS，WGS)算法对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新，得到多焦点阵列相位图。具体地，本实施例中预先设置输入面相位为-π到π的随机矩阵，并对预设的输入面相位和已知的输入面振幅进行二维傅里叶变换，得到傅里叶面振幅和傅里叶面相位。保持傅里叶面相位不变，傅里叶面振幅用目标振幅乘以一个不均匀性矫正的矫正系数来替换，其中，矫正系数g

对于传统加权相位恢复(weighted GS，WGS)算法，当算法执行第i次迭代时，傅里叶面振幅和傅里叶面相位可以根据输入面振幅

为了保证生成的多焦点阵列相位图的均匀性和效率，本实施例中多焦点阵列相位图的生成方法采用一种改进的加权相位恢复(weighted GS，WGS)算法，本实施例中改进的加权相位恢复算法与传统加权相位恢复算法的唯一区别是执行N次迭代到目标调制效率后，保持后续迭代中傅里叶平面相位不变，即Ψ

如图6所示，为本实施例中提供的改进的加权相位恢复算法的原理流程图。具体地，在迭代次数未达到预设次数N时，采用上述传统的WGS算法对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新；当迭代次数达到预设次数N时，则保持迭代更新过程中的傅里叶面相位不变，并继续执行对输入面振幅和输入面相位进行迭代更新的步骤，直至所述加权相位恢复算法收敛，得到多焦点阵列相位图。

进一步地，本实施例中所述线性相位光栅相位图中线性相位光栅的表达式为：

由于空间光调制器由一个个像素单元构成，在空间光调制器面上的线性相位光栅的相位值被离散化，所以实际的线性相位光栅不可能实现点阵的连续移动。相位光栅能实现的扫描精度为δ

在一具体实施方式中，步骤S4具体包括:

S41、对所述若干副图像中各幅图像的扫描点位置进行高斯数字针孔滤波，得到若干副降噪图像；

S42、对所述若干副降噪图像进行像素重定位处理，并对像素重定位处理后的若干副降噪图像进行图像叠加，得到样品的超分辨率图像。

为了实现样品的超分辨成像，本实施例中得到若干副图像后，首先对若干副图像中各幅图像中的扫描点位置进行高斯数字针孔滤波，得到若干副降噪图像，其中，高斯数字针孔滤波的表达式为：

综上所述，本发明提供了一种基于空间光调制器的双光子多焦点显微成像系统及方法，所述系统包括：激光光源；根据导入的等间隔切换的叠加相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的多焦点阵列的空间光调制器；其中，叠加相位图由多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图叠加而成；将所述多焦点阵列投射至样品面上，产生多焦点荧光信号的物镜；采集所述多焦点荧光信号，得到若干副图像的探测器；对所述若干副图像进行滤波降噪以及超分辨处理，得到样品的超分辨率图像的控制终端。本发明通过在空间光调制器上同时加载多焦点阵列相位图和线性相位光栅相位图，实现多焦点阵列的产生以及对样品面进行高精度并行数字随机寻址扫描和激发成像，解决了双光子多焦点扫描显微成像系统的机械惯性问题，降低了系统的复杂性，提高了灵活性。

应当理解的是，本发明的系统应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。