一种双信号输出的病原微生物快速检测方法

摘要

本发明公开了一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，该方法利用病原微生物与核酸适配体之间的特异性结合，以及双链DNA特异性核酸酶对两者结合后形成的结构的破坏作用，使得介孔硅纳米材料内的邻苯二胺分子得以释放，释放后的邻苯二胺分子进一步与Ag+溶液混合，生成黄色的氧化产物，该产物同时具有荧光信号，且该产物浓度与待测样品中的病原微生物浓度成正比。基于此，通过比色和荧光双信号输出，借助肉眼或便携式荧光分析仪可实现病原微生物的间接定性、定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体涉及一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，尤其涉及一种基于介孔氧化硅纳米材料、核酸酶循环信号放大以及比色和荧光双信号输出的病原微生物快速检测方法。

背景技术

病原微生物包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等，是引起食源性疾病的首要原因，其不仅严重影响人们的生命健康，而且影响全球经济的发展。因此，为保障国计民生，在食品或农产品进入市场流通前，非常有必要对微生物种类和含量进行快速筛查与检测。

目前，常见的病原微生物检测方法主要有培养法、PCR法以及ELISA法三大类。其中培养法作为微生物检测的金标方法，尽管结果准确，但通常需要经过分离、鉴定、培养以及计数等环节，操作复杂耗时，一般需要3-5天。而PCR法和ELISA法尽管检测时间大大缩短，但需依赖昂贵的专用仪器以及专业的技术人员，并且对复杂样品难以适用。综上，以上方法均难以满足当前病原微生物现场快速检测的迫切需求。因此，发展一种简单、快速、廉价、准确、高灵敏的病原微生物检测方法，对有效预防和控制食源性疾病的暴发，减轻病原微生物对人类造成的危害意义重大。

近年来，病原微生物的快速检测发展迅速，目前已发展了多种基于电化学、荧光、表面增强拉曼光谱等技术的快速检测方法。然而，上述方法通常是基于单一信号的变化对目标物进行检测。这种单信号输出的方式易受操作人员、实验环境等的影响致使结果不够准确。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，该方法不需要昂贵的仪器和试剂，且可通过比色法和荧光法进行检测，准确性高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将介孔硅与邻苯二胺混合，得到介孔中负载有邻苯二胺分子的介孔硅，记为产物A；

S2、采用待测病原微生物的核酸适配体封闭步骤S1所述产物A，得到产物B；

S3、将待测样品、核酸酶以及步骤S2所述产物B置于同一反应体系中，反应后离心取上清液；

S4、将步骤S3所述上清液与Ag

其中，所述介孔硅为表面修饰了氨基的介孔氧化硅纳米球，其粒径为50-200nm，孔径为2-4nm；所述核酸酶为双链DNA特异性核酸酶。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1所述产物A的制备方法为：将介孔氧化硅纳米球超声分散在Tris-HCl缓冲液中，搅拌条件下，逐滴加入邻苯二胺溶液后，室温振荡反应4-6h，使得邻苯二胺分子充分扩散到介孔氧化硅纳米球的孔中，得到含有产物A的悬浮液；所述邻苯二胺溶液的溶剂为无水乙醇和Tris-HCl缓冲液的混合液；更进一步地，所述无水乙醇与Tris-HCl缓冲液的体积比为1:1，所述邻苯二胺溶液的浓度为10-20mg/mL。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2所述产物B的制备方法为：将待测病原微生物的核酸适配体溶液加入到步骤S1所述悬浮液中，4℃温和振荡6-8h后，用Tris-HCl缓冲液多次离心和洗涤，以除去介孔硅纳米材料表面物理吸附的邻苯二胺分子，得到产物B。核酸适配体对病原微生物具有良好的特异性，核酸适配体的筛选为现有技术，且已产品化。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S3所述过程具体为：将产物B重悬到Tris-HCl缓冲液中，再加入含有待测样品和双链DNA特异性核酸酶的混合液，室温反应20-30min后，离心得到上清液；更进一步地，混合液由待测样品与双链DNA特异性核酸酶储备液按特定比例混合而成，具体比例可根据实际需要进行调整，所述双链DNA特异性核酸酶储备液的浓度为100-1000U/mL。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S4所述Ag

进一步地，在上述技术方案中，所述病原微生物为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌中的任意一种。

上述方法中所用到的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01-0.05M，pH为8.0。

本发明利用病原微生物与核酸适配体之间的特异性结合，以及双链DNA特异性核酸酶对两者结合后形成的结构的破坏作用，使得介孔内的邻苯二胺分子得以释放，释放后的邻苯二胺分子进一步与Ag

本发明的有益效果：1)采用介孔硅材料做载体，介孔硅具有良好的生物相容性、结构可重复性、高负载效率、尺寸可调和易功能化的特点，起到一级信号放大的效果；2)基于双链DNA特异性核酸酶的循环信号放大策略，样品中的病原微生物被反复使用，邻苯二胺分子被不断释放，检测灵敏度得到进一步提高；3)引入Ag

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，所举实例只用于解释本发明，并非同于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的病原微生物为金黄色葡萄球菌。其检测方法的过程如下：

(1)将10mg氨基化的介孔二氧化硅纳米球(粒径约100nm)超声分散到1mL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)中，室温搅拌条件下，接着将1mL 10mg/mL邻苯二胺的乙醇-Tris-HCl溶液(体积比1:1)逐滴加入其中。混合均匀后，将其室温温和振荡4-6h。

(2)将5mL金黄色葡萄球菌的适配体溶液(100μM，序列为5’-GCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA-3’)加入到步骤(1)所得悬浮液中，4℃温和搅拌6h后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)离心和洗涤5-10次，最后将材料分散到2mL Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH8.0)；

(3)取200μL步骤(2)所制得的悬浮液，将200μL含有金黄色葡萄球菌的待测样品和双链DNA特异性核酸酶的混合液加入其中，室温下轻微振荡孵育30min后，将产物在5000rpm下离心5min，等体积重悬至Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH 8.0)。样品中的金黄色葡萄球菌浓度为从0到10

(4)取100μL步骤(3)所得上清液与100μL含有0.05M AgNO

根据金黄色葡萄球菌的浓度与邻苯二胺氧化产物在562nm处荧光发射峰峰强的变化情况，绘制出相应的定量标准工作曲线，根据标准工作曲线可以得知可检测到的金黄色葡萄球菌浓度低至25CFU/mL。

实施例2

本实施例为采用实施例1的标准曲线对金黄色葡萄球菌模拟样本的浓度检测。

首先，将超市采购回来的常温牛奶(3000rpm，5min)离心处理，除去不纯物。然后将其用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)稀释10倍处理。往其中分别加入1000和10000CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准溶液，充分混匀后采用与实施例1相同的方法进行检测。首先通过肉眼观察邻苯二胺氧化产物颜色，可初步得知前者颜色浅、后者颜色加深；接着，通过测量其在562nm处荧光发射峰峰强的变化值，根据实施例1获得的工作曲线，推算得知模拟样本中金黄色葡萄球菌的浓度分别为951.4和10323CFU/mL，进而得知两份样本的回收率分别为95.14％和103.23％。由此可以验证本方法在实际样本中检测中具有很好的可行性和准确性。

上述实施例只是对本发明的解释，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉市农业科学院

<120> 一种双信号输出的病原微生物快速检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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