一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明属于多肽化学和免疫学技术领域，具体涉及一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒，所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人MBP蛋白，所述试剂盒内包含MBP包被抗原和MBP结合抗原，所述MBP包被抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者，并且MBP结合抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。克服了现有技术的不足，通过合成特异性的人MBP抗原表位肽，使用该检测试剂盒可以有效地检测血液样本中的MBP抗体的水平，操作简便、快速，并且检测准确度和精密度高，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

说明书

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学技术领域，具体涉及一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

目前关于MBP-Ab病的确切致病机制尚不清楚，大部分研究认为，识别MBP抗原的特异性B细胞可能存在于外周血，但由于骨髓中MBP抗原表达，使MBP特异性未成熟B细胞处于无反应状态，同时由于缺乏相应的辅助T细胞(Th细胞)辅助作用，识别MBP的特异性B细胞不能活化，而仅在外周血中增殖。当嗜神经病毒感染机体时，血-脑屏障被破坏，MBP抗原漏入外周，激活CD4+T细胞，对MBP特异性B细胞募集和激活增加，产生大量MBP-IgG；同时促炎T细胞进入中枢，募集MBP特异性B细胞流入中枢，产生相应抗体。在一些体外实验中已证实MBP-IgG可以通过补体和抗体途径介导细胞杀伤作用。而CD4+T细胞在一些细胞因子诱导下分化为Th1、Th17、Th9细胞，分泌TFN-γ、白细胞介素(IL)-12、IL-23、IL-17A等因子，通过趋化因子吸引不同种类免疫细胞，如髓样细胞、巨噬细胞等，诱发炎性级联反应，介导中枢髓鞘脱失。还有研究者在表达识别MBP的特异性T细胞受体的转基因老鼠中可以观察到自发的视神经炎，支持T细胞在MBP-Ab病中起重要作用。

MBP-Ab病患者的血液中MBP-Ab(抗MBP抗体)的量会有所升高，如何能够定量、高效的检测出MBP抗体的含量成为业内亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒，克服了现有技术的不足，采用双抗原夹心法定量检测人MBP抗体的含量，操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒，所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人MBP蛋白，所述试剂盒内包含MBP包被抗原和MBP结合抗原，所述MBP包被抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者，并且MBP结合抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Gly-Lys-Gly-Arg-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-Arg-Phe-Ser-Trp；

(2)Lys-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys-Asp-Ser-His-His-Phe-Ala。

进一步，所述MBP包被抗原和MBP结合抗原通过人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别与牛血清白蛋白偶联制备而成。

进一步，所述MBP包被抗原和MBP结合抗原与牛血清白蛋白的用量比为(2ng～5ng):(1mg～4mg)，且优选为4ng:3mg。

进一步，所述MBP包被抗原的浓度为8ng/ml～12ng/ml，且优选为10ng/ml。

进一步，所述MBP结合抗原的浓度为7ng/ml～9ng/ml，且优选为8ng/ml。

进一步，所述试剂盒内还包括检测缓冲液、终止液、清洗液和底物溶液。

进一步，所述试剂盒内还包含有酶结合物，所述酶结合物的工作浓度为1.0－2.0μg/ml，且优选为1.5μg/ml。

本发明还保护了一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、MBP抗原表位肽(1)和(2)的合成；

S2、缓冲液及试剂的配制

S3、MBP包被抗原和MBP结合抗原的制备；

S4、检测试剂盒的组装。

本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：

本发明所述一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒，通过合成特异性的人MBP抗原表位肽，使用该检测试剂盒可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的MBP抗体的水平，操作简便、快速，并且检测准确度和精密度高，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

附图说明

图1为一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒的检测方法中标准曲线图。

图2为一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒的检测方法中线性曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

MBP-Ab体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

一、人MBP抗原表位肽(1)和(2)的合成

人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Gly-Lys-Gly-Arg-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-Arg-Phe-Ser-Trp；

(2)Lys-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys-Asp-Ser-His-His-Phe-Ala

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复的多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。

由于Fmoc法比tBoc法有很多优势，现在大多采用Fmoc法合成固相肽。

本发明的人MBP抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

称取HMP树脂120mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％反应如下：

氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

连接氨基酸到树脂上

脱去氨基酸的Fmoc保护基

另一氨基酸的活化

偶联

重复步骤(3)至(5)直至合成结束

分别得到人MBP肽段(1)的肽树脂156mg和人MBP肽段(2)的肽树脂148mg

(7)裂解肽树脂

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5％指体积分数)、硫代苯甲醚(2.5％指体积分数)作清除剂，在室温下反应4.0h，去除切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到人MBP肽段(1)和(2)的粗品

(8)用已有的技术将表位肽(1)和(2)进行纯化，并用已有技术对其进行鉴定。

将所得到的肽(1)和(2)进行相应步骤的纯化后再进行鉴定，鉴定合成肽即为目的产物。

二、各种缓冲液及试剂的配制：

包被缓冲液(PBS磷酸缓冲液)

KH2PO4：0.24g，

Na2HPO4：1.44g，

NaCl：8g，

KCl：0.2g，

加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，

样品洗涤冲洗液(PBS-Tween 20)

Na2HPO4·12H2O：58g，

KH2PO4·12H2O：4g，NaCl：100g，KCl：4g。

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

显色剂A

柠檬酸：20g

过氧化脲：6g

蒸馏水溶至500ml，Tween 20：5ml

显色剂B

柠檬酸：60g

EDTA-2Na：0.5g

TMB·2HCL：1g

蒸馏水溶至500ml。

e、2mol/L硫酸溶液

三、抗原的制备

将抗原表位肽(1)与BSA偶联得到MBP抗原(1)，将MBP抗原(1)溶于PBS磷酸缓冲液，制成预包液，(包被抗原浓度为10ng/ml)，在酶标板上每孔加入100ul，置于2--8℃冰箱放置18--24h，取出，甩掉包被液，用样品洗涤液进行洗涤，并用2.5％，PH＝7.4的BSA溶液进行封闭2h，干燥1h后，将其装入密封袋中，并置于2--8℃冰箱进行保存。

四、试剂盒的组成

预包被板：48/96孔

MBP-Ab校准品：5个，5×1ml(浓度分别为15ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml，1ng/ml)

MBP结合抗原：1×5ml。

酶结合物：HRP标记的羊抗兔IgG，2×5ml，12ng/ml

洗涤冲洗液(PBS-Tween 20)：1×20ml。

显色剂A：1×5ml

显色剂B：1×5ml

终止液：1×5ml

优选地，在本发明的检测试剂盒中，所述捕获抗原的浓度为8ng/ml～12ng/ml，更优选为9ng/ml～11ng/ml，最优选的为10ng/ml。

优选地，所获捕获抗原和结合抗原与BSA的用量比为(2ng～5ng):(1mg～4mg)，更优选为(2.5ng～4.5ng):(2mg～4mg)，最优选的为4ng:3mg。

优选地，在本发明的诊断试剂盒中，所述结合抗原的浓度为7ng/ml～9ng/ml，更优选为7.5ng/ml～8.5ng/ml，最优选的为8ng/ml。

优选地，在本发明的诊断试剂盒中，所述酶结合物的工作浓度为1.0μg/ml－2.0μg/ml，更优选为1.2μg/ml-1.8μg/ml，最优选的为1.5μg/ml。

优选地，在本发明的诊断试剂盒中，显色剂A的主要成分为柠檬酸20g，过氧化脲6g，Tween 205ml，蒸馏水溶至500ml。

优选地，在本发明的诊断试剂盒中，显色剂B的主要成分为柠檬酸60g，EDTA-2Na0.5g，TMB·2HCL 1g，蒸馏水溶至500ml。

优选地，在本发明的诊断试剂盒中，终止液为2mol/l的硫酸溶液。

优选地，本发明的诊断试剂盒中还包含校准品，校准品的浓度梯度优选为15ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml，0.25ng/ml、0ng/ml，校准品来源于纯化的MBP-Ab。

校准曲线测试

校准曲线测试方法如下：在预包被的各孔中分别加入校准品50ul/孔，均为双孔，再在相应孔中加入结合抗原(2)，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min，用洗涤液洗涤5次，并拍干。在各孔内加入100ul的酶结合物，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min。取出反应板，甩出板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡。再在每孔加入显色剂A、B各50ul，轻拍混匀，置于37℃温育15min，之后每孔加入终止液50ul。用酶标仪(450nm/630nm双波长测定)测定各孔OD值。

结果如下表1和图1所示；

表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)

以校准品浓度和吸光度绘制标准曲线，标准曲线如下图，标准曲线的R＝0.9969。

五、产品性能指标

5.1外观

试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；标签应清晰，准确、牢固。

5.2准确度

将已知浓度的髓鞘碱性蛋白抗体加入到血液基质中，回收率应在(85％～115％)范围内。具体操作方法如下将浓度为12ng/mL的人髓鞘碱性蛋白(MBP)样品A0加入到低浓度样品B0中，所加入样品A0与样品B0之间的体积比例为1：10，根据公式(1)计算结果，其结果如下表2所示。

式中：R—回收率；V—加入样品A0体积；V0－样品B0的体积；C－样品B0加入样品A0后的检测浓度；C0—样品B0的检测浓度；CS—样品A0的浓度。

表2准确度表格

根据表中的数值可知，所测得回收率在85％～115％之间，满足要求。

5.3线性

将浓度为15ng/mL的高值样本按倍比稀释为5个浓度，将每一浓度样本重复检测3次，计算其浓度的平均值，将结果平均值和稀释比例进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应不低于0.9950，其检测结果如表3所示，线性曲线如图2所示。

表3线性表格

理论值与测得值的相关性：r＝0.9995

根据上述表格数据，可知产品改项性能符合要求。

5.4重复性

对2个浓度水平的参考品：6ng/ml，12ng/ml各重复检测10次，再利用校准曲线计算10次测量浓度结果的平均值

式中：CV－变异系数；SD—10次测量结果的标准差；

表4重复性测定ss

根据上述表格数据，可知产品改项性能符合要求。

5.5稳定性检测

取三批试剂盒各20盒，其批号分别为20190809、20190911、20191012，在2℃～8℃避光贮存，在有效期一年内，每隔一个季度对产品的外观、准确度、线性、重复性进行检测。

5.5.1外观检测

在保质期一年内，每隔一个季度对三批样品进行外观检测，试剂盒各组分齐全、完整、液体无渗漏，标签清晰、准确、牢固。

5.5.2准确度检测

按照准确度的测定方法，测定每批样品的平均回收率，测定数值如表5所示：其中R1指代每批样品的第一季度的平均回收率，R2指代每批样品的第二季度的平均回收率，R3指代每批样品的第三季度的平均回收率，R4指代每批样品的第四季度的平均回收率。

表5准确度表格

根据表中的数值可知，在保质期一年内，所测得样品回收率在85％～115％之间，样品合格。

5.5.3线性检测

按照线性的测定方法，测定每批样品每个季度的各个样本的浓度平均值，并计算其线性R值，所出数值如表6所示：

表6线性表格

根据上述的表格数值，产品在保质期内，线性系数R值均大于0.9980，符合标准。

5.5.4重复性

根据上述重复性的测定方法，测定每批样品每个季度的平均浓度值，其中测定值后的序号的意义如下：“1”指在保质期内第一季度的样品平均浓度值，“2”指在保质期内第二季度的样品平均浓度值，“3”指在保质期内第三季度的样品平均浓度值，“4”指在保质期内第四季度的样品平均浓度值，所出数值如表7、表8、表9所示：

表7 20190809批样品重复性表格

表8 20190911批样品重复性表格

表9 20191012批样品重复性表格

根据上述重复性测定数值可知，产品在一定保质期内其性能依然符合要求，产品符合要求。

通过对产品的外观、准确度、线性、重复性及稳定性进行的检测，可知产品的各项性能均符合要求，因此该试剂盒的质量合格。

六、试剂盒的操作步骤

在预包被的各孔中分别加入待检血清50ul/孔，均为双孔，再在相应孔中加入结合抗原(2)，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min，用洗涤液洗涤5次，并拍干。在各孔内加入100ul的MBP-Ab酶结合物，用封口膜将条板封好，在37℃孵育30min。取出反应板，甩出板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡。再在每孔加入显色剂A、B各50ul，轻拍混匀，置于37℃温育15min，之后每孔加入终止液50ul。用酶标仪(450nm/630nm双波长测定)测定各孔OD值。

七、结果判定

选取1000例病人，其中男性及女性病患者各500例，选取1000例健康者，其中男性及女性病健康者各500例，按上述方式进行血清MBP-Ab检测，并利用统计学分析方法对所检测结果进行处理。

结果表明，男性及女性病患者血清中MBP-Ab的浓度并无明显统计学差异(P＞0.05)，男性及女性健康者血清中MBP-Ab的浓度并无明显统计学差异(P＞0.05)，由此可以说明试剂盒对于男性和女性患者的检测具有同样的效果。

1000例病患和1000例健康者血清中MBP-Ab的浓度有显著统计学差异(P＜0.001)，由此可知该试剂盒能用于检测人血清中的MBP-Ab的含量来辅助诊断病人是否患有断中枢神经系统免疫性脱髓鞘疾病。

以下附表10记录了部分男性病人和部分女性病人血清中MBP-Ab的含量。

附表11记录了部分男性健康者和部分女性健康者血清中MBP-Ab的含量。

表10 100例病人血清中MBP-Ab浓度的记录

表11 100例健康者血清中MBP-Ab浓度的记录

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。