生物分子的缀合方法及金供体用于生物分子复合物形成的新用途

摘要

本发明的主题是用于缀合含游离巯基的生物分子，导致生物分子复合物形成的方法，所述方法包括使用金供体试剂连接生物分子的反应，其中形成了‑S‑Au‑S‑键，其特征在于金供体试剂是卤素(三芳基膦)金(I)。本发明的主题还在于卤素(三芳基膦)金(I)分子作为金供体试剂在生物分子复合物形成的方法中的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域。本发明涉及用于缀合包含生物分子的游离巯基的方法，所述方法包括使生物分子与金供体试剂反应，其中形成-S-Au-S-键。具体地，所述方法导致作为蛋白质笼的复合物形成。

背景技术

自然界中的蛋白质复合物表现为重要且高度复杂的生物纳米机器和纳米结构。自然界中的大蛋白质复合物通常由通过非共价相互作用(即，氢键，疏水填充)保持在一起的许多单独蛋白质构成。这在蛋白质笼(例如衣壳)中是特别显著的，其中以这种方式将多个拷贝的相同蛋白质亚单元保持在一起。在合成结构生物学中，设计和构建人工蛋白质组装体的能力可能是有用的，潜在地允许引入自然界中不存在的能力的特性。为此，需要以确定的方式将各个蛋白质连接在一起的新方法。

近来，本发明人已经研究了使用来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的TRAP(trp RNA-结合减毒蛋白质)作为纳米构件的可能性。该TRAP采用天然状态

考虑到已知方法的缺点，本发明人已经尝试找到用于连接蛋白质亚单元的其它方法。尽管存在关于经由其半胱氨酸SH基团结合两个或其它数量的蛋白质的一些公开内容，但本发明人聚焦该领域，考虑将金作为“缝合”试剂的用途。

具有-SH基团的金化合物的反应是众所周知的并且在文献(例如，StephanieA.Koening的硕士论文MA，The gold(I)mediated thoil/disulfide exchange reaction:akinetic and mechanistic investigation,August 2007,Los Angeles,USA,

金化合物用于将金颗粒掺入纳米结构或提供纳米颗粒作为纳米簇，用于多种应用的蛋白质笼以及作为递送系统中的靶向分子的用途也在文献以及专利文献中有充分描述，并且这些是本发明的现有技术。例如，第PCT/KR2013/004454号国际申请描述了用于制备透明质酸-金纳米颗粒/蛋白质复合物的方法，该复合物可用作肝靶向药物递送系统，该方法通过用具有生物相容性、生物降解性和肝组织特异性递送性质的透明质酸对在体内具有优异稳定性的金纳米颗粒进行表面修饰，以及将用于治疗肝病的蛋白质药物结合至金纳米颗粒的未修饰表面上。

第US10/142,838号美国专利申请公开了通过修饰笼状蛋白质的内部结构将贵金属原子(例如金)引入笼状蛋白质(例如脱铁铁蛋白)，因此形成适用于各种微结构的贵金属-重组笼状蛋白质复合物。

第PCT/US2011/034190号国际申请公开了抗体-纳米颗粒缀合物，其包含通过金属-巯基键直接连接至抗体或其片段的两个或更多个纳米颗粒(例如金、钯、铂、银、铜、镍、钴、铱或者其两种或更多种的合金)。

另一个实例是第US 14/849,379号美国专利申请，其公开了重组自组装蛋白质，其包含融合至自组装蛋白质的靶标导向肽和自组装的金离子还原肽。

使用金化合物构建用于不同目的的生物分子的新方法也显示在A.D.Malay等人的出版物(Nanoletters，“Gold Nanoparticles-Induced Formation of ArtificialProtein Capsid”)中，其中金纳米颗粒(GNP)被用作将环状TRAP单体连接在一起的催化剂，这可能是由于S-Au-S键的形成，但这一点在上述著作中不确定。在反应中使用GNP是不希望的，因为已知1.4nm的纳米颗粒是有毒的

在本领域中存在关于Au-S键形成以及生物结构形成的机制的许多公开内容。还有表明使用三-R-膦氯化金作为用于反应的Au供体/催化剂的数据。本领域还已知，将天然存在于多肽链中的半胱氨酸SH基团用作Au(I)原子的靶标。然而，在本领域中主要描述了使用带Au的化合物进行的SH封闭反应或者在生物分子表面上掺入带Au的标记物来进行检测技术的方法。

在本发明中，实现了新的方法-代替金纳米颗粒-(三芳基膦)金(I)卤化物被用作用于在自组装成蛋白质复合物的蛋白质单元之间成键的催化剂，其中SH基团在部分内，优选在天然存在或人工并入蛋白质结构中的半胱氨酸部分内。在一个实施方案中，该方法允许对衣壳样蛋白质复合物的组装和拆装进行控制，这相对于现有技术是创新的。

发明内容

本发明的主题是用于缀合生物分子的游离巯基部分，导致生物分子复合物形成的方法，所述方法包括其中形成了-S-Au-S-键的生物分子与金供体试剂之间的反应，其中金供体试剂是卤素(三芳基膦)金(I)。

优选地，所述方法中使用的生物分子选自肽、多肽、蛋白质。

优选地，缀合导致复合物形成，其中复合物由相同生物分子的多个单元组成。更优选地，复合物是对称的或不对称的。

优选地，在上述方法中，所述部分是半胱氨酸。优选地，所述半胱氨酸部分是生物分子中天然存在的部分。还优选地，所述半胱氨酸部分被人工引入生物分子中。

优选地，在所述方法的金供体中，其为卤素(三芳基膦)金(I)：卤素选自包括氯、溴、碘、氟的组；芳基选自未取代的苯基-或邻-，间-或对-单或多取代的苯基。

更优选金供体剂是[二苯基(3-磺酸根合苯基)膦]氯化金(I)。

更优选金供体剂是(三苯基膦)氯化金(I)。

优选地，上述方法包括以下步骤：

a.生物分子制备，

b.通过生物分子与金供体的反应缀合生物分子，

c.缀合产物的纯化。

优选地，通过在合适的表达系统中生物分子的表达和表达产物的纯化进行所述生物分子制备。

优选地，在上述方法的所述步骤a将至少一个半胱氨酸引入所述生物分子中。

优选地，缀合在水溶液中在室温下进行至多3天，并且生物分子：金供体的摩尔比通常是3:1至1:4。

优选地，通过选自过滤、结晶、离心、柱色谱法中的至少一种方法进行所述缀合产物的所述纯化。

优选地，所述生物分子复合物是蛋白质笼。更优选地，所述生物分子是TRAP蛋白质。所述TRAP蛋白质复合物优选由24个生物分子单元组成。

本发明的主题还在于卤素(三芳基膦)金(I)分子作为金供体试剂在用于根据上述方法的生物分子复合物形成的方法中的用途。

优选地，所述用途由通过其中形成-S-Au-S-键的反应缀合生物分子的游离巯基部分组成。优选地，复合物是蛋白质笼。更优选地，蛋白质是TRAP。

出于本说明书的目的，经由-S-Au-S-键连接生物分子的反应是其中金连接衍生自两个半胱氨酸的两个-SH基团的反应，所述两个半胱氨酸是连接至复合物的两个生物分子的氨基酸。优选地，在两个生物分子之间形成至少一个-S-Au-S-键。在另一个实施方案中，形成两个或更多个-S-Au-S-键。键的量取决于生物分子中半胱氨酸的量及其可利用性-对金供体的展示。

如果生物分子中不存在半胱氨酸，或者存在半胱氨酸但不可用于反应，则可以将-SH基团，优选作为半胱氨酸的基团引入生物分子中。

半胱氨酸的引入可以通过本领域已知的任何方法进行。例如，但不限于，通过本领域已知的方法(例如商业基因合成或使用修饰的DNA引物的基于PCR的定点诱变)进行半胱氨酸的引入。上述方法是本领域技术人员已知的，并且即用型试剂盒可商购获得。

-SH部分也可以通过修饰生物分子中的其它氨基酸(即通过定点诱变或通过固相肽合成)被引入生物分子中。

“单元”、“亚单元”、“分子”、“生物分子”、“单体”在说明书中可替代地使用，并且意指为了复合物形成而连接至另一个分子的一个分子。

“复合物”、“组装”、“聚集体”在说明书中可替代地使用，并且意指通过生物分子之间的反应构建的超结构。它由用-S-Au-S-键连接的单元形成。复合物中包含的单元的量取决于生物分子的性质。更具体地，它取决于生物分子的量和生物分子中存在的-SH基团的量。

为了进行连接反应，即使用Au(I)源经由S-Au-S键的形成将两个半胱氨酸连接在一起，我们首先必须制备和纯化单体，并且引入(如果相关)可反应的半胱氨酸(图2A)，然后与金供体(例如[二苯基(3-磺酸根合苯基)膦]氯化金(I)，钠盐水合物(Au-TPPMS,MDL号MFCD19443491))进行反应。由于形成-S-Au-S-键，组装复合物。使用Cryo-EM确认包含S-Au-S键的结构形成，通过质谱测量进一步确认S-Au-S键的存在，并且通过热稳定性测试等确认稳定性。

通过根据本发明的方法获得的其中形成有配位共价键S-Au-S的复合物的稳定性通常比其中单体非共价连接的相关复合物更稳定。

与本领域中已知的存在于蛋白质-蛋白质复合物中的非共价氢键，范德华型键相比，认为-S-Au-S键主要具有配位共价特征。这可能是为什么通过根据本发明的方法获得的复合物的稳定性高的因素。

TRAP蛋白质是用于本发明方法的合适的生物分子模型。这可能是由于其高固有稳定性、环形、缺乏天然半胱氨酸残基(更容易控制缀合过程)和可利用的可被改变为半胱氨酸并且所得半胱氨酸在合适化学和空间环境中适合于S-Au-S键形成的残基。

然而，本领域技术人员应容易调整关于其它生物分子单体的反应条件。具有游离巯基和/或其结构允许通过引入巯基进行修饰的任何生物分子单体可适用于根据本发明的生物分子的缀合方法。

附图说明

图1：例示出用于金缝合反应的含金(I)化合物的实例。

图1A。单磺化三苯基膦氯化金(I)。

图1B。三苯基膦氯化金(I)。

图2。例示出金缝合反应和形成的所得复合物的实例。

图2A。在两个相互正交的视图中示出的单个TRAP环(pdb 4v4f)的结构。

图2B。中空笼结构的伪原子模型。

图2C。获得TRAP笼的低温电磁密度。

图2D。产生的蛋白质笼中的两个相邻TRAP环的近视图，示出了桥接金原子的存在。

图2E。通过单磺化三苯基膦氯化金(I)的作用，在相对的半胱氨酸侧链之间形成化学键，“R”是指TRAP蛋白质的剩余部分。

图3A：说明例示出三种形式的TRAP单体的LC-MS数据：(从左边)无配体的蛋白质(深灰色)、结合至单个金原子的单体(灰色)，以及与结合至金原子和TPPMS配体的单体(浅灰色)。

图3B：例示出在高碰撞活化下进行的完整TRAP笼的非变性MS。

图3C：图3B中低m/z区的扩展。

图4示出通过金缝合反应保持在一起的蛋白质复合物的稳定性。

图4A例示出非变性PAGE凝胶，其示出了形成的TRAP笼的高热稳定性。

图4B例示出在没有热处理的情况下形成的TRAP笼的TEM图像(比例尺200nm)。

图4C：示出在95℃下孵育3小时之后形成的TRAP笼的TEM图像，其示出笼结构没有显著降解(比例尺100nm)。

实施例

用于实现本发明的技术

透射电子显微镜(TEM)

通常将样品稀释至0.025mg/ml的最终蛋白质浓度，在台式离心机中短暂地离心，并且将上清液施加到亲水化的碳包覆铜格栅(STEM Co.)上，用4％磷钨酸(pH8)负染色，并使用JEOL JEM-1230 80kV仪器观察。

非变性PAGE

将样品在3-12％非变性Bis-Tris凝胶上按照制造商的建议(Life Technologies)运行。将样品与4x非变性PAGE样品缓冲液(200mM BisTris，pH7.2，40％w/v甘油，0.015％w/v溴酚蓝)混合。作为迁移带的分子量的定性指导，使用NativeMark未染色的蛋白质标准物(Life Technologies)。当进行蓝色非变性PAGE时，根据制造商的方案(LifeTechnologies)观察蛋白质带，否则使用InstantBlue

电热原子吸收光谱法(ETAAS)

将约2mg质量的样品溶解在25ml的0.2％HCl中。然后将溶液稀释25倍，然后用ETAAS光谱仪(PinAAcle 900Z，Perkin Elmer，Waltham,MA)在242.80nm的波长下(狭缝宽度为0.7nm)用塞曼背景校正测定总金。样品溶液的测量体积为10μl，并且向每个样品中添加基质改性剂的混合物：5μg的Pd(NO

蛋白质表达和纯化

在典型的纯化中，用含有TRAP-CS基因的pET21b质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)在37℃下在具有100μg/ml氨苄青霉素的3L的LB培养基中摇动生长，直至OD

液相色谱质谱

使TRAP笼样品在56℃下在具有8M脲的50mM Tris·HCl缓冲液(pH8.0)中变性30分钟，然后使用离心过滤装置(Amicon 3kDa MWCO，Millipore)将缓冲液交换至50mM Tris·HCl缓冲液(pH8.0)。为了变性LC-MS分析，通过经由动态纳米喷雾源连接至混合LTQOrbitrap XL质谱仪(Thermo Scientific)的Dionex UltiMate 3000RSLCnano系统将TRAP蛋白质在C18预柱(Acclaim PepMap100,C18,300μm×1cm；Thermo Scientific)上脱盐；然后在C18柱(Acclaim PepMap100,C18,75μm×15cm；Thermo Scientific)上分离。使用二元缓冲体系，其中缓冲液A为0.1％甲酸的H

非变性质谱

通过使用微型旋转柱(Micro Bio-Spin P-6,BioRad)将缓冲液交换成乙酸铵(pH6.9)来制备用于非变性MS的0.8mg/ml的TRAP笼样品。以两步进行：首先交换成2.5M乙酸铵，其次交换成200mM乙酸铵。使用先前描述的方法

实施例1

TRAP复合物制备-与Au-TPPMS反应

(参见图1)

金化合物：

[二苯基(3-磺酸根合苯基)膦]氯化金(I)，钠盐水合物(Au-TPPMS，MDL号MFCD19443491)购自STREM chemicals UK,limited，并且通过溶解在水中而达到所需浓度(通常为5mM)。所用的金纳米颗粒(GNP)是来自STREM Chemicals UK的具有1-3nm内径的二苯基(间-磺酸根合苯基)膦-金纳米簇(MDL号MFCD17018839)。

TRAP制备：

例示成功使用Au-TPPMS所用的蛋白质是具有引入的半胱氨酸的TRAP蛋白质。含有35号残基赖氨酸(K)至半胱氨酸的突变和64号残基精氨酸(R)至丝氨酸(S)的附加突变的TRAP的表达和纯化(称为“TRAP-CS”)与前述TRAP-CS

用Au(I)-TPPMS修饰TRAP蛋白质的反应。

纯化的TRAP蛋白质与Au-TPPMS(图1A)在水性缓冲液中在室温下反应。在反应中形成S-Au-S键，导致TRAP环组装成TRAP笼中，然后纯化并且进一步表征。

通过在水溶液中混合纯化的TRAP-CS和Au-TPPMS进行TRAP笼的形成。为每个反应定制反应物的准确浓度，但通常如下：在50mM Tris-HCl,pH7.9，0.15M NaCl中1mM TRAP-CS(8.3mg ml

实施例2

TRAP复合物制备-与Au(I)-三苯基膦反应

可以用三苯基膦氯化金(I)(Au-TPP，图1B)代替Au-TPPMS进行类似的反应。将Au-TPP溶解在DMSO中，在50mM Tris，150mM NaCl，pH7.9和Au-TPP中进行反应，DMSO不超过最终体积的10％，并且TRAP单体以约1mM的浓度存在。Au-TPP与TRAP的比率为4:2至4:3。这也导致具有与在与Au-TPPMS反应中获得的相同的结构的TRAP笼形成。分别调节试剂的量。TRAP单体/金供体的比率和反应条件与其中Au-TPPMS作为金供体的反应相同。

以上进行了具有不同的卤素(三芳基膦)金(I)金供体试剂的两个实施例。其显示具有不同的芳基部分的卤素(三芳基膦)金(I)适于根据本发明的复合物形成。

实施例3

使用Cryo-EM确认TRAP复合物结构

使用用于使用GNP形成的TRAP笼的cryo-EM单颗粒重构技术获得TRAP笼的初始(低分辨率)cryo-EM结构。

使用cryo-EM将TRAP笼的结构解析为3.9埃分辨率。这足以显示24个TRAP环的排列并且证明在相对的环的半胱氨酸侧链之间存在连接密度(指定为Au)(参见图2)。

图2例示了金缝合反应和形成的复合物的实例。图2A显示了单个TRAP环(pdb4v4f)的结构，其在两个相互正交的视图中显示。突变的残基35和64显示为每个TRAP单体上的球体，残基35在环的外周上。与含金(I)的化合物反应(箭头)得到图2B中显示的结构-中空笼结构的结构的伪原子模型。这里，以卡通形式显示24个环中的每一个，其中桥接环的半胱氨酸显示为棒，其中球体表示它们之间的金原子。使用图2C中例示的结构建立该模型，其显示出获得的冷冻EM密度。图2D是产生的蛋白质笼中两个相邻TRAP环的近视图，显示了桥接金原子的存在。Cryo-EM图谱显示为灰网，以卡通形式显示蛋白质，其中半胱氨酸残基显示为棒。四个半胱氨酸残基用箭头突出显示，并且它们的桥接金原子显示为球体。在图2E中显示Au-S键之间的精确距离，其中示出了通过单磺化三苯基膦氯化金(I)的作用在相对的半胱氨酸侧链之间形成的化学键，“R”是指TRAP蛋白质的剩余部分。使用Au-TPPMS形成的TRAP笼的高分辨率cryo-EM单颗粒重构

将使用Au-TPPMS形成的纯化的样品(3μl的0.89mg ml

结构细化

初始原子坐标模型基于TRAP晶体结构(PDB登记号4V4F

质谱：

质谱进一步用于支持在TRAP笼结构内连接TRAP单体的金原子的存在。

质谱实验的结果显示在图3A中，其例示出三种形式的TRAP单体的LC-MS数据：(从左边)无配体的蛋白质(深灰色)，结合至单个金原子的单体(灰色)以及结合至金原子和TPPMS配体的单体(浅灰色)。为了清楚起见，仅示出10+电荷状态，并且不同峰的放大倍数允许准确确定质量以明确分配。其它小峰对应于盐加合物和/或其它电荷状态。插入表格显示TRAP质量的列表，以及由于不同的修饰而预期的质量增加量。考虑到负责10+电荷状态的10个质子，这些非常好地对应于所测量的质量。图3B例示出在高碰撞活化下进行的完整TRAP笼的非变性MS。在高碰撞活化下进行的完整TRAP笼的非变性MS揭示了在高m/z处的宽的未分辨的信号区域，以及在低m/z处的一系列峰。这些特征对应于完整笼的解离，导致笼碎片的释放。图3C示出了在图3B中表示的低m/z区的扩展，示出了各种电荷状态系列的分配。修饰和未修饰形式的单体TRAP(灰色，与A相同染色)是观察到的主要碎片。上述质谱值明显显示出，观察到可以明确分配给含有单个金原子的TRAP二聚体的峰，证实了TRAP-Au(I)-TRAP键假说。

电热原子吸收光谱法(ETAAS)显示每个笼组件112±8个金原子，与120的预测值(以下表1)吻合。

表1：使用ETAAS确定TRAP笼的Au含量

TRAP笼的5个ETAAS测量结果，每个进行三次，显示出金的测量质量以及翻译成每个TRAP笼的金原子的数量。测量3由于大的观察误差而在计算整体平均值时弃置。

以上实验证实了TRAP复合物的结构。在与卤素(三芳基膦)金(I)的反应中获得的TRAP-复合物的结构与在与GNP的反应中获得的相同，这在本发明人的论文中已有描述。

实施例4

TRAP复合物的稳定性测试

热稳定性测试如下进行。将在水性缓冲液中含有1μg TRAP笼蛋白质的样品(7.5μl)加热至95℃，持续不同的时间(0-180分钟)。加热之后，将样品在台式离心机中以10,000rpm离心5分钟。取上清液，并且与2.5μL的4X NativePAGE样品缓冲液混合，对样品进行非变性PAGE分析，通过TEM进一步分析相同的样品。典型的结果显示在图4A至图4C中。

通过金缝合反应保持在一起的蛋白质复合物的稳定性呈现在图4中，其中图4A例示出非变性PAGE凝胶，显示了形成的TRAP笼的高热稳定性。在施加到凝胶之前，在指定的温度下处理样品并持续指定的时间。对应于TRAP笼的带由箭头表示。C＝对照泳道(无热处理)。M＝蛋白质分子量标准参照物(凝胶左侧以kDa示出的重量)。图4B示出了在没有热处理的情况下形成的TRAP笼的TEM图像(比例尺200nm)。图4C例示出在95℃下孵育3小时之后形成的TRAP笼的TEM图像，显示笼结构(比例尺100nm)没有显著降解。

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