经硅取代的罗丹明染料和染料缀合物

摘要

本文公开了经硅取代的罗丹明化合物。本文还公开了SiR染料，所述SiR染料包括与所述SiR染料的Si原子(10位置)连接的至少一个乙烯基。还提供了SiR化合物的衍生物、官能化版本、缀合物、试剂盒、相关合成方法和用途。硅‑罗丹明(SiR)染料可以提供远红外波长下的明亮荧光并且展现出良好的光稳定性。本文描述的所述化合物可用于生物样品的荧光标记和检测。

说明书

本公开涉及荧光染料和其缀合物的领域。

发明内容

在许多领域中，使用荧光染料检测生物材料或对生物材料进行定量是有用的或必要的。生物材料，如核酸、多肽、细胞和膜可以在各种样品类型中检测，例如在生物医学、遗传学、发酵、水产养殖、农业、法医和环境应用中。为了提供针对特定应用的具有所期望性质的染料，通常有用或必要的是将染料官能化为将染料靶向到特定组分的部分或将所述染料与所述部分缀合，如给定细胞内位置、细胞内组分(例如，细胞骨架组分)或核酸)或表位。

硅罗丹明(SiR)染料可以提供远红外波长下的明亮荧光并且可以展现出良好的光稳定性，并且因此针对各种应用已经进行了对此类染料进行官能化或缀合此类染料的尝试。此类尝试通常集中于对染料的氧杂蒽部分进行改性，但是此类改性导致染料的光物理性质的显著变化，如吸收和发射波长、量子产率和光稳定性。因此，需要被改性或可以被改性以改善染料的一种或多种光物理性质，如吸收和发射波长、量子产率和光稳定性的SiR染料。

本文描述了SiR染料和其衍生物、官能化版本、缀合物以及用途，所述SiR染料包括与所述SiR染料的Si原子(10位)连接的至少一个乙烯基。还提供了相关合成方法。所述乙烯基可以使用例如硫基-烯反应衍生，以提供官能化的或缀合的SiR染料。含乙烯基的染料和乙烯基衍生的染料可以具有与游离SiR类似的光物理性质，和/或对于如上所述的那些生物学相关的靶标具有改进的性质或特性(例如，特异性结合亲和力)，提供其它益处，或至少为公众提供有用的选择。

因此，以下是本文提供的实施例。实施例1为一种式(I)化合物：

其中：

R

R

或者R

每个L

每个R

每个R

R

R

R

R

R

每个L

R

R

R

E为SO

R

R

R

R

R

每个R

每个R

R

R

R

R

进一步地，其中(i)如果R

或其螺内酯形式和/或盐。

实施例2为一种制备式(P2)化合物的方法：

所述方法包括使式(P1a)化合物

和式(P1b)化合物

与有机锂碱反应，并且然后与SiCl

R

R

或者R

每个L

每个R

每个R

R

R

R

R

每个R

每个R

R

R

R

R

由此产生所述式(P2)化合物。

实施例3为一种制备式(I)化合物的方法：

所述方法包括使式(P2)化合物

与式(P2a)化合物

在CuBr

R

R

或者R

每个L

每个R

每个R

R

R

R

R

R

每个L

R

R

R

E为SO

R

R

R

R

R

每个R

每个R

R

R

R

R

进一步地，其中(i)如果R

由此产生所述式(I)化合物。

实施例4为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例5为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例6为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例7为实施例1-3中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例8为实施例7的所述化合物或方法，其中所述环为饱和环。

实施例9为实施例7或8的所述化合物或方法，其中所述环为5元、6元或7元环。

实施例10为实施例7-9中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述环是未经取代的。

实施例11为实施例1-6中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例12为实施例11的所述化合物或方法，其中R

实施例13为实施例11的所述化合物或方法，其中R

实施例14为实施例11所述化合物或方法，其中R

实施例15为实施例14的所述化合物或方法，其中所述增溶官能团包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氧化乙烯单元。

实施例16为实施例11所述化合物或方法，其中R

实施例17为实施例1-6或11-16中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例18为实施例17的所述化合物或方法，其中R

实施例19为实施例17的所述化合物或方法，其中R

实施例20为实施例17的所述化合物或方法，其中R

实施例21为实施例17的所述化合物或方法，其中R

实施例22为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例23为实施例22的所述化合物或方法，其中s为2。

实施例24为实施例22或23的所述化合物或方法，其中X为S。

实施例25为实施例22或23的所述化合物或方法，其中X为S(O)。

实施例26为实施例22-25中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例27为实施例22-25中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例28为实施例22-25中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例29为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例30为实施例1-28中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例31为实施例1-28中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例32为实施例1-28中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例33为实施例32的所述化合物或方法，其中R

实施例34为实施例33的所述化合物或方法，其中R

实施例35为实施例33的所述化合物或方法，其中R

实施例36为实施例33或35的所述化合物或方法，其中R

实施例37为实施例33、35或36的所述化合物或方法，其中R

实施例38为实施例35-37中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例39为实施例33或35-38中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中A为经取代的芳基。

实施例40为实施例33-39中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例41为实施例33-39中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例42为实施例33-39中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例43为实施例33-39中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例44为实施例32的所述化合物或方法，其中R

实施例45为实施例44的所述化合物或方法，其中R

实施例46为实施例45的所述化合物或方法，其中R

实施例47为实施例45的所述化合物或方法，其中R

实施例48为实施例44-47中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例49为实施例32的所述化合物或方法，其中R

实施例50为实施例45-49中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例51为实施例45-49中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例52为实施例45-49中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中每个L

实施例53为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例56为实施例1-52中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例55为实施例1-52中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例56为实施例1-52中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例57为实施例1-52中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例58为实施例1-52中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例59为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例60为实施例1-58中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例61为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中E和R

实施例62为实施例1-60中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中E和R

实施例63为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例64为实施例1-62中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例65为实施例1-62中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例66为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例67为实施例1-65中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例68为实施例1-65中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例69为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例70为实施例1-68中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例71为实施例1-68中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例72为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例73为实施例1-71中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例74为实施例1-71中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例75为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例76为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例77为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例78为实施例1-62或65-67中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例79为实施例1-68或71-78中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例80为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例81为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例82为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例83为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中一个或每个R

实施例84为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例85为实施例1-65或68-84中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例86为实施例1-72或75-85中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例87为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例88为实施例1-86中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例89为实施例1-86或88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例90为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例91为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例92为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例93为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例94为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例95为实施例1-88中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例96为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例97为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例98为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例99为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例100为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例101为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例102为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中R

实施例103为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中以下中的一个、两个或三个为真：

实施例104为R

实施例105为R

实施例106为R

实施例107为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，每个R

实施例108为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中任选地除了R

实施例109为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，所述化合物具有以下结构：

或其开放形式、盐或游离酸。

实施例110为前述实施例中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述化合物为具有以下式的标记的核苷/核苷酸：

NUC-DYE

其中

NUC为核苷/核苷酸部分；

DYE为所述化合物的SiR部分，NUC和DYE通过连接子连接；

其中所述连接子在式(I)的位置R

实施例111为实施例110的所述化合物或方法，其中NUC包括核苷酸三磷酸盐、引物、引物延伸产物或探针。

实施例112为实施例110或111的所述化合物或方法，所述化合物进一步包括与所述化合物的SiR部分成能量转移关系的淬灭剂或荧光基团。

实施例113为实施例110-112中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中NUC包括碱基，所述碱基选自由尿嘧啶、胞嘧啶、脱氮杂腺嘌呤和脱氮杂鸟苷组成的组。

实施例114为实施例1-108中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述化合物为式(L1)的亚磷酰胺化合物：

其中：

X和Y一起形成连接子；

B

分别地，B

D为所述化合物的SiR部分；

其中Y在式(I)的位置R

实施例115为实施例1-108中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述化合物为式(L2)的亚磷酰胺化合物：

B

分别地，B

B

B为核苷/核苷酸碱基；

D为所述化合物的SiR部分；

B通过连接到式(I)的位置R

任选地其中如果B为嘌呤或7-脱氮杂嘌呤，则糖部分连接在所述嘌呤或所述7-脱氮杂嘌呤的N

任选地其中如果B为嘌呤，则所述连接子连接到所述嘌呤的8位置，如果B为7-脱氮杂嘌呤，则所述连接子连接到所述7-脱氮杂嘌呤的7位置，并且如果B为嘧啶，则所述连接子连接到所述嘧啶的5位置。

实施例116为实施例1-115中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述化合物为以下化合物中的任何一种化合物：1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59，或其开放形式或螺内酯形式和/或盐或游离酸。

实施例117为一种通过使第一化合物与靶标结合部分、核苷/核苷酸或多核苷酸反应形成的化合物，所述第一化合物为以下化合物中的任何一种化合物：1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59或其开放形式或螺内酯形式和/或盐或游离酸，任选地其中所述第一化合物通过将其部分转化为与所述靶标结合部分反应的反应性配体来首先进行活化。

实施例118为实施例117的化合物，其中所述靶标结合部分是抗体、核酸结合部分或细胞骨架结合部分。

实施例119为一种检测靶多核苷酸的方法，所述方法包括：使包括或疑似包括所述靶多核苷酸的样品与能够特异性地结合所述靶多核苷酸的实施例1或4-117中的任何一个实施例的化合物接触；以及确定包括所述靶多核苷酸和所述化合物的复合物是否形成。

实施例120为实施例119的所述化合物或方法，其中确定包括所述靶多核苷酸和所述化合物的复合物是否形成包括检测来自所述复合物的荧光或检测由于复合物形成而造成的荧光的变化，任选地其中由于复合物形成而造成的荧光的所述变化是由于切割或构象变化而引起的淬灭剂淬灭减少。

实施例121为一种对多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：在测序反应期间使所述多核苷酸与实施例1、4-108或110-117中的任何一个实施例的所述化合物接触；形成测序产物；以及检测来自所述测序产物的荧光，其中所述化合物包括引物或核苷酸三磷酸盐。

实施例122为实施例121的所述化合物或方法，其中所述化合物为终止所述测序产物的合成的标记的终止子核苷酸或二核苷酸，任选地其中所述标记的终止子核苷酸是标记的双脱氧核苷酸或可逆终止子核苷酸或二核苷酸。

实施例123为实施例121的所述化合物或方法，其中所述化合物为引物，并且所述测序产物通过引物延伸来形成。

实施例124为实施例121-123中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述方法包括在检测荧光之前将所述测序产物与其它测序产物分离，任选地其中所述分离是通过电泳，进一步任选地其中所述电泳是毛细管电泳。

实施例125为实施例121-123中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中所述方法包括原位检测所述测序产物。

实施例126为一种标记核苷酸或多核苷酸的方法，所述核苷酸或所述多核苷酸包括第一反应性配体，所述方法包括使所述核苷酸或所述多核苷酸与包括能够在与所述第一反应性配体反应时形成键的第二反应性配体的实施例1、4-108或110-117中的任何一个实施例的化合物反应。

实施例127为实施例126的所述化合物或方法，其中所述第二反应性配体为亚磷酰胺。

实施例128为实施例126的所述化合物或方法，其中所述第二反应性配体为活性酯，任选地其中所述活性酯为NHS酯。

实施例129为一种对多核苷酸进行染色的方法，所述方法包括使所述多核苷酸与包括多核苷酸结合部分的实施例1、4-108或110-117中的任何一个实施例的化合物接触。

实施例130为一种荧光复合物，所述荧光复合物包括包含与多核苷酸非共价缔合的多核苷酸结合部分的实施例1、4-108或110-117中的任何一个实施例的化合物。

实施例131为实施例129的所述方法或实施例130的所述荧光复合物，其中所述多核苷酸的长度为约8个到约15个核苷酸、约15个到约30个核苷酸、约30个到约50个核苷酸、约50个到约200个核苷酸、约200个到约1000个核苷酸、约1kb到约5kb、约5kb到约10kb、约10kb到约50kb、约50kb到约500kb、约500kb到约5Mb、约5Mb到约50Mb或约50Mb到约500Mb。

实施例132为实施例119-131中的任何一个实施例的所述方法或荧光复合物，其中核酸为质粒、粘粒、PCR产物、限制片段、cDNA、基因组DNA或天然或合成寡核苷酸。

实施例133为实施例119-132中的任何一个实施例的所述方法或荧光复合物，其中所述多核苷酸处于电泳凝胶、细胞、细胞器、病毒、类病毒或生物流体中，或处于水样品、土壤样品、食品、发酵过程或表面清洗中或从水样品、土壤样品、食品、发酵过程或表面清洗中获得。

实施例134为一种确定细胞膜完整性的方法，所述方法包括：

a)将含有一个或多个细胞的样品与实施例1、4-109或116-118中的任何一个实施例的化合物一起温育，持续足以使所述化合物进入具有受损细胞膜的细胞的时间；以及

b)基于来自所述一个或多个细胞的可检测荧光信号的存在来确定所述一个或多个细胞的细胞膜完整性，其中所述可检测荧光信号的所述存在指示所述细胞膜完整性受到损害，并且所述可检测荧光信号的不存在指示所述细胞膜完整性是完整的。

实施例135为一种检测靶标的方法，所述方法包括：使包括或疑似包括所述靶标的样品与包括特异性地结合所述靶标的靶标结合部分的实施例1、4-109或116-118中的任何一个实施例的化合物接触；以及检测来自包括所述靶标和所述化合物的复合物的荧光。

实施例136为实施例135的所述化合物或方法，其中所述样品包括细胞。

实施例137为实施例135的所述化合物或方法，其中所述样品包括生物提取物。

实施例138为实施例134-137中的任何一个实施例的所述化合物或方法，其中检测荧光使用荧光显微镜、读板仪、荧光扫描仪、荧光计或流式细胞仪执行。

实施例139为一种用于检测靶标的试剂盒，所述试剂盒包括包含被配置成特异性地结合所述靶标的靶标结合部分的实施例1或4-117中的任何一个实施例的化合物。

实施例140为实施例139的所述试剂盒，其中所述靶标为肌动蛋白或微管，并且所述靶标结合部分为肌动蛋白结合部分或微管结合部分。

实施例141为实施例139的所述试剂盒，其中所述靶标结合部分为对所述靶标具有特异性的抗体。

实施例142为实施例139的所述试剂盒，其中所述靶标为第一抗体，并且所述靶标结合部分为对所述第一抗体具有特异性的第二抗体。

实施例143为实施例139-141中的任何一个实施例的所述试剂盒，其中所述靶标为多肽、多糖、脂质或多核苷酸。

实施例144为一种用于对样品进行染色的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1或4-118中的任何一个实施例的化合物。

实施例145为一种用于将式(I)化合物与靶标结合部分、核苷酸或多核苷酸缀合的试剂盒，所述试剂盒包括包含至少一种反应性配体的实施例1或4-118中的任何一个实施例的化合物。

附图说明

图1A-1R示出了本文提供的示例性硅罗丹明(SiR)化合物。图1A示出了化合物1、1A、1B、1C、2和2A的结构。图1B示出了化合物3、4和4A的结构。图1C示出了化合物5和6的结构。图1D示出了化合物7、7A和7B的结构。图1E示出了化合物8、9和10A的结构。图1F示出了化合物10B、11和12的结构。图1G示出了化合物13、14和15的结构。图1H示出了化合物16、17、18、19、20和21的结构。图1I示出了化合物22、23、24、25、26和27的结构。图1J示出了化合物28、29、30、31、32和33的结构。图1K示出了化合物34、35、36、37、38和39的结构。图1L示出了化合物43的结构。图1M示出了化合物45和46的结构。图1N示出了化合物47、48、49和50的结构。图1O示出了化合物51和52的结构。图1P示出了化合物53、54、55和56的结构。图1Q示出了化合物57、58和59的结构。图1R在左侧展示了通用SiR化合物的荧光两性离子开放形式，而在右侧展示了相同通用SiR化合物的非荧光螺旋闭合形式。

图2A-2E展示了各种SiR化合物的制备。图2A示出了根据已知方法成为SiR化合物的合成途径。图2B示出了根据本文提供的实施例的化合物1-3的示例性合成方案，所述化合物可以用于根据本文提供的某些实施例的与各种配体的缀合反应中(化合物3可以通过使用已知方法对化合物2进行氧化来产生)。图2C示出了由化合物2进行的可以用于缀合反应中化合物2A的示例性制备，如根据本文提供的某些实施例指示的那些。图2D示出了根据本文提供的某些实施例的可以由化合物2(例如，通过化合物2A)制备的用于活细胞的核染料(化合物4)、微管蛋白探针(化合物5)和肌动蛋白探针(化合物6)的结构。图2E示出了根据本文提供的某些实施例的通过化合物7A进行的化合物7B的示例性合成方案。

图3A-3E示出了两种不同浓度下并且具有平均核信号强度的SiR-Hoechst(瑞士的Spirochrome公司(Spirochrome,Switzerland))或化合物4的活细胞染色的比较。阳性染色细胞在黑色背景上显示为灰色至白色对象。化合物4的染色明显更亮。图3A示出了用1μMSiR-Hoechst染色的细胞。图3B示出了用2μM SiR-Hoechst染色的细胞。图3C示出了用1μM化合物4染色的细胞。图3D示出了用2μM化合物4染色的细胞。图3E示出了条形图，其将用SiR-Hoechst和化合物4染色的细胞的观察到的核信号强度进行了比较。核信号强度是通过对每种染色剂的核的荧光强度和所测试的浓度求平均确定的。

图4A-4D示出了使用多西紫杉醇(紫杉醇(Taxol))作为靶向配体利用微管蛋白探针染色的细胞的比较。每种染料示出了两个字段。用0.5μM化合物5或SIR-紫杉醇(瑞士的Spirochrome公司)对细胞进行了染色，并且执行了成像。图4A-B示出了用化合物5染色的细胞。图4C-D示出了用SiR-紫杉醇染色的细胞。

图5A-5D示出了化合物7和TO-PRO-3的荧光强度和光稳定性的比较。用1μM化合物7或TO-PRO-3对固定的A459细胞进行了染色，并且使用荧光显微镜的Cy5通道收集了图像。染色阳性的细胞在黑色背景上显示为浅灰色对象。图5A示出了用1μM TO-PRO-3进行的染色。图5C示出了用1μM化合物7进行的染色。图5B示出了对来自Cy5通道的激发光的1分钟暴露之后的TO-PRO-3荧光(可观察到很少荧光或无荧光)。图5D示出了对来自Cy5通道的激发光的1分钟暴露之后的化合物7荧光。

图6A-6E示出了来自化合物7和7B的DAPI通道的荧光强度和渗漏的比较。图6A-6D示出了化合物7B当在Cy5通道中成像时，比化合物7更亮(分别在图6A和6C中)，并且示出了到DAPI通道的较少渗漏(分别在图6B和6D中)。图6E示出了条形图，其展示了当与化合物7比较时，化合物7B信号在Cy5通道中增加了12％(分别参见图6E，#3和#1)，并且当与化合物7比较时，在DAPI通道中令人惊讶地减少了50％(分别为图6E，#4和#2)。

图7A-7B将在用PROLONG

图8展示了根据本文提供的某些实施例使用化合物54-亚磷酰胺和FAM-亚磷酰胺以生成可以用于标记多核苷酸或寡核苷酸的化合物54-FAM引物标记物。引物将发射650nm以上。

图9展示了通过化合物的NHS酯与FAM和衍生自化合物59的SiR部分缀合的引物寡核苷酸的产生。根据本文提供的某些实施例，引物寡核苷酸由化合物59-FAM引物标记物标记。

图10A-10B示出了用于如染色固定细胞或标记抗体等实验室程序的示例性化合物的结构。图10A展示了根据本文提供的某些实施例的用作固定细胞染色剂(在本文中由与配体缀合的SiR染料表示)的化合物的制备。图10B展示了根据本文提供的某些实施例的水溶性SiR NHS酯的制备，之后是其与抗体的缀合。

图11A-11B将各种化合物的利用ALEXA FLUOR

图12A-12C示出了用抗微管蛋白抗体和ALEXA FLUOR

图13示出了化合物13、化合物14或AF647的抗体缀合物在其抵抗光学漂白的能力方面的比较。化合物13和14两者对光学漂白的基本耐性超过700秒曝光，而AF647则没有抗性。DOL指示标记程度(例如，每抗体的SiR染料部分)。

图14示出了用化合物4B(底部PDT)和化合物4C(顶部PDT)染色的细胞类型A549和Hela的细胞的核信号强度。

图15示出了示出了条形图，其将在Cy5和DAPI通道上用SiR-Hoechst和化合物4B以及4C染色的细胞的核信号强度进行了比较。

图16示出了条形图，其将化合物5的非对映异构体A和B相比于非对映异构体的混合物和商用SiR-紫杉醇化合物的信号强度进行了比较。

图17A示出了条形图，其将用不同类型的连接子制备的化合物6肌动蛋白探针的平均信号强度进行了比较。图17B示出了条形图，其将用不同类型的连接子制备的化合物6肌动蛋白探针的信号-背景(S/B)比进行了比较。

图18A示出了条形图，其将平均信号强度化合物6A、化合物6B、隔离的化合物6A和6B的混合物(异构体分离之前)、化合物6的两种分离的异构体(A/B)以及用SiR肌动蛋白标记的细胞(Spirochrome公司)进行了比较。图18B示出了条形图，其将图18A中的测试的化合物中的每种化合物的信号-背景比进行了比较。

具体实施方式

现将详细参考本公开的某些实施例，附图中展示了这些实施例的实例。应当理解，总体说明和详细说明两者均仅为示例性和解释性的并且不限制教导。尽管将结合所展示的实施例描述本公开，但是应当理解其不旨在限于这些实施例的公开。相反，本公开旨在涵盖所有替代方案、修改和等同物，所述替代方案、修改和等同物可以包含在如所附权利要求书所定义的本公开内。

在详细描述本教导之前，应当理解，本公开不限于特定组合物或处理步骤，因为其可以变化。必须指出的是，如在本说明书以及所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。因此，例如，对“染料”的提及包含多种染料，并且对“细胞”的提及包含多种细胞等。术语“或”以包含性含义使用，即等同于“和/或”，除非上下文另外明确指出。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则表示量、百分比或比例的所有数量和本说明书和权利要求书中使用的其它数值在所有情况下应被理解为被术语“约”修饰成其尚未如此修饰的程度。“约”指示基本上不会影响所描述主题的性质的变化程度，例如，在10％、5％、2％或1％内。因此，除非有相反指出，否则以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是可以根据寻求获得的期望的性质改变的近似值。至少并且并非尝试限制将等效物的原则应用于权利要求书的范围，每个数值参数应至少考虑报告的有效数字的数量并且通过应用普通的凑整技术进行解释。而且，“包括(包括)”、“包括(包括s)”、“包括(包括)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”的使用不旨在是限制性的。

除非在以上说明书中具体指出，否则在说明书中叙述“包括”各种组分的实施例也被设想为“由所叙述组分组成”或“基本上由所叙述组分组成”；在说明书中叙述“由各种组分组成”的实施例也被设想为“包括”所叙述组分或“基本上由所叙述组分组成”；并且在说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施例也被设想为“由所叙述组分组成”或“包括”所叙述组分(此互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。

本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制所期望的主题。在通过引用并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各个实施例对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于此类实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等效物，如本领域的技术人员将理解的。

定义

除非另外说明，否则如本文所使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：

如本文所使用的术语“或其组合”是指在所述术语之前列出的术语的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包含以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，则还包含BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续此实例，明确地包含的是含有一或多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解，否则通常不限制任何组合中的项目或术语的数量，除非另外从上下文显而易见。

如本文所用，术语“试剂盒”是指相关组分的包装组，如一种或多种化合物或组合物，以及一种或多种相关材料，如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。

如本文所用的“经取代的”是指其中一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能团或部分取代的分子。例如，未经取代的氮为—NH

除非另有说明，否则在本文中未明确定义的取代基的命名则通过将官能团的端部分命名，然后将朝连接点的相邻官能团命名而达成。例如，取代基“芳基烷基氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。

应当理解，在本文定义的所有经取代的基团中，通过将具有另外的取代基的取代基定义为自身(例如，具有经取代的芳基作为被经取代的芳基自身取代的取代基的经取代的芳基，所述经取代的芳基被经取代的芳基进一步取代等)达成的聚合物不旨在用于包含在本文中。在此类情况下，此类取代的最大数量为三。例如，两种其它经取代的芳基对经取代的芳基的系列取代限于-经取代的芳基-(经取代的芳基)-取代的芳基。

类似地，应当理解，本文提供的定义不旨在包含不允许的取代模式(例如，用5个氟基取代的甲基)。此类不允许的取代模式是技术人员众所周知的。

本文公开的化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式，包含水合形式存在。这些化合物可以以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本文描述的用途是等同的，并且旨在处于本公开的范围内。本文公开的化合物可以具有不对称碳原子(即，手性中心)或双键；本文描述的化合物的外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单独异构体均在本公开的范围内。本文描述的化合物可以制备为单个异构体或异构体的混合物。

在取代基通过其常规化学式指定并且从左到右书写时，其同等地涵盖将由从右到左书写结构产生的化学上相同的取代基，例如，–CH

将理解的是，用于定义本文公开的化合物的化学结构为可能共振结构之一的可以表示每种给定结构的每种表示。进一步地，将理解的是，通过定义，共振结构仅仅是本领域的技术人员用来表示电子离域的图形表示，并且本公开不通过示出任何给定结构的一个特定共振结构以任何方式进行限制。

当所公开化合物包含缀合的环体系时，共振稳定可以允许形式电子电荷分布在整个分子之上。虽然特定电荷可以描绘为定域在特定环体系或特定杂原子上，但是通常应当理解，可以绘制可比共振结构，其中电荷可以形式地定域在化合物的替代部分上。

“烷基”意指通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子中去除一个氢原子衍生的饱和或不饱和、支链、直链或环状烃自由基。典型烷基由1个到12个饱和和/或不饱和碳组成，包含但不限于甲基、乙基、丙基、丁基等。在一些实施例中，烷基为具有1个到10个碳原子，例如，1个到6个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。“烷基”包含例如直链和支链烃基，如甲基(CH

“经取代的烷基”是指具有1个到5个，例如，1个到3个或1个到2个取代基的烷基，所述取代基选自由以下组成的组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳基氧基、经取代的芳基氧基、芳基硫基、经取代的芳基硫基、羧基、羧基烷基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基氧基、经取代的环烷基氧基、环烷基硫基、经取代的环烷基硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯基氧基、经取代的环烯基氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟氧基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳基氧基、经取代的杂芳基氧基、杂芳基硫基、经取代的杂芳基硫基、杂环、经取代的杂环、杂环基氧基、经取代的杂环基氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、–SO

“烷基磺酸盐”为–(CH

“烷氧基”是指基团–O-烷基，其中烷基在本文中定义。烷氧基包含例如甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、异丙氧基、n-丁氧基、t-丁氧基、仲-丁氧基和n-戊氧基。在一些实施例中，烷氧基为-OR，其中R为C

“经取代的烷氧基”是指基团–O-(经取代的烷基)，其中经取代的烷基在本文中定义。

“烷基二基”意指1个到20个碳原子的并且具有通过从母体烷烃、烯烃或炔烃的相同或两个不同碳原子中去除两个氢原子衍生的两个单价自由基中心的饱和或不饱和支链、直链或环状烃自由基。典型烷基二基自由基包含但不限于1,2-乙基二基、1,3-丙基二基、1,4-丁基二基等。

“芳基”或“Ar”意指通过从母体芳环体系的单个碳原子中除去一个氢原子衍生的6个到20个碳原子的单价芳香族烃自由基。典型芳基包含但不限于衍生自苯、经取代的苯、萘、蒽、联苯等的自由基。在一些实施例中，芳基为6个到14个碳原子的具有单个环(例如，苯基)或多个稠环(例如，萘基或蒽基)的单价芳香族羧基，所述稠环可以是或可以不是芳香族的(例如，2-苯并恶唑啉酮、2H-1,4-苯并恶嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点处于芳香族碳原子处。优选的芳基包含苯基和萘基。

“经取代的芳基”是指被1个到5个，例如，1个到3个或1个到2个取代基的芳基，所述取代基选自由以下组成的组：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳基氧基、经取代的芳基氧基、芳基硫基、经取代的芳基硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基氧基、经取代的环烷基氧基、环烷基硫基、经取代的环烷基硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯基氧基、经取代的环烯基氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟氧基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳基氧基、经取代的杂芳基氧基、杂芳基硫基、经取代的杂芳基硫基、杂环、经取代的杂环、杂环基氧基、经取代的杂环基氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、–SO

“芳烯”是指在化合物的两个连续芳基碳处稠合的芳环，即具有两个相邻单价自由基中心的通过从母体芳环体系的两个相邻碳原子中的每一个中去除一个氢原子衍生的二价桥自由基。将芳烯桥自由基(例如亚苯基)连接到母体芳环体系产生了稠合的芳环体系，例如萘。典型芳烯基包含但不限于：[1,2]亚苯基、[1,2]萘和[2,3]萘。

“芳基二基”意指6个到20个碳原子的具有缀合的共振电子体系和通过从母体芳基化合物的两个不同碳原子中去除两个氢原子衍生的至少两个单价自由基中心的不饱和环状或多环烃自由基。

“杂芳基”是指环内的1个到10个碳原子以及1个到4个杂原子的芳香族基团，所述杂原子选自由氧、氮和硫组成的组。此类杂芳基可以具有单个环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，中氮茚基或苯并噻吩基)，其中所述稠环可以是或可以不是芳香族的和/或可以含有或可以不含有杂原子，条件是连接点通过芳香族杂芳基的原子。在一个实施例中，杂芳基的一个或多个氮和/或硫环原子被任选地氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包含吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。

“经取代的杂芳基”是指被1个到5个，例如1个到3个或1个到2个取代基取代的杂芳基，所述取代基选自由经取代的芳基定义的取代基的相同基团组成的组。

“杂芳基氧基”是指–O-杂芳基。

“经取代的杂芳基氧基”是指基团–O-(经取代的杂芳基)。

“烯基”是指具有2个到6个碳原子，例如2个到4个碳原子并且具有至少1个，例如1个到2个烯基不饱和位点的烯基。此类基团通过例如、乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1-基和丙烯基例示。

“经取代的烯基”是指具有1个到3个取代基，例如，1个到2个取代基的烯基，所述取代基选自由以下组成的组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳基氧基、经取代的芳基氧基、芳基硫基、经取代的芳基硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基氧基、经取代的环烷基氧基、环烷基硫基、经取代的环烷基硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯基氧基、经取代的环烯基氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟氧基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳基氧基、经取代的杂芳基氧基、杂芳基硫基、经取代的杂芳基硫基、杂环、经取代的杂环、杂环基氧基、经取代的杂环基氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、–SO

“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、经取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、经取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、经取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、经取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、经取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、经取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、经取代的杂芳基-C(O)-、杂环-C(O)-和经取代的杂环-C(O)-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文定义的。酰基包含“乙酰基”CH

“酰基氨基”是指基团-NRC(O)烷基、经-NRC(O)取代的烷基、-NRC(O)环烷基、经-NRC(O)取代的环烷基、-NRC(O)环烯基、经-NRC(O)取代的环烯基、-NRC(O)烯基、经-NRC(O)取代的烯基、-NRC(O)炔基、经-NRC(O)取代的炔基、-NRC(O)芳基、经-NRC(O)取代的芳基、-NRC(O)杂芳基、经-NRC(O)取代的杂芳基、-NRC(O)杂环和经-NRC(O)取代的杂环，其中R是氢或烷基、并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“酰基氧基”是指基团烷基-C(O)O-、经取代的烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、经取代的烯基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、经取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、经取代的芳基-C(O)O-、环烷基-C(O)O-、经取代的环烷基-C(O)O-、环烯基-C(O)O-、经取代的环烯基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、经取代的杂芳基-C(O)O-、杂环-C(O)O-和经取代的杂环-C(O)O-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基”是指基团–NH

“经取代的氨基”是指基团–NR'R”,其中R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环、经取代的杂环、-SO

“氨基羰基”是指基团-C(O)NR'R”，其中R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R'和R”与和其结合的氮一起任选地连接，以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基硫代羰基”是指基团-C(S)NR'R”，其中R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R'和R”与和其结合的氮一起任选地连接，以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基羰基氨基”是指基团-NRC(O)NR'R”，其中R为氢或烷基并且R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R'和R”与和其结合的氮一起任选地连接，以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基硫代羰基氨基”是指基团-NRC(S)NR'R”，其中R为氢或烷基并且R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R'和R”与和其结合的氮一起任选地连接，以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基羰基氧基”是指基团–O–C(O)NR'R”，其中R'和R”独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环，并且其中R'和R”与和其结合的氮一起任选地连接，以形成杂环或经取代的杂环基，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“氨基磺酰基”是指基团–SO

“氨基磺酰基氧基”是指基团–O-SO

“氨基磺酰基氨基”是指基团–NRSO

“脒基”是指基团–C(＝NR”')R'R”，其中R'、R”、

“芳基氧基”是指基团–O-芳基，其中芳基如本文所定义包含例如苯氧基和萘氧基。

“经取代的芳基氧基”是指基团–O-(经取代的芳基)，其中经取代的芳基如本文所定义的。

“芳硫基”是指基团–S-芳基，其中芳基如本文所定义的。

“经取代的芳硫基”是指基团–S-(经取代的芳基)，其中经取代的芳基如本文所定义的。

“炔基”是指具有2个到6个碳原子和例如2个到3个碳原子并且具有至少1个，例如1个到2个炔基不饱和位点的炔基。

“经取代的炔基”是指具有1个到3个取代基，例如，1个到2个取代基的炔基，所述取代基选自由以下组成的组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳基氧基、经取代的芳基氧基、芳基硫基、经取代的芳基硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基氧基、经取代的环烷基氧基、环烷基硫基、经取代的环烷基硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯基氧基、经取代的环烯基氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟氧基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳基氧基、经取代的杂芳基氧基、杂芳基硫基、经取代的杂芳基硫基、杂环、经取代的杂环、杂环基氧基、经取代的杂环基氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、–SO

“羰基”是指二价基团–C(O)–，其等效于–C(＝O)–。

“羧基(carboxyl)”或“羧基(carboxy)”是指–COOH或其盐。

“羧基烷基(carboxy alkyl)”或“羧基烷基(carboxyalkyl)”是指基团–(CH

“羧基酯(carboxyl ester)”或“羧基酯(carboxy ester)”是指基团-C(O)O-烷基、经-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-烯基、经-C(O)O-取代的烯基、-C(O)O-炔基、经-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳基、经-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-环烷基、经-C(O)O-取代的环烷基、-C(O)O-环烯基、经-C(O)O-取代的环烯基、-C(O)O-杂芳基、经-C(O)O-取代的杂芳基、-C(O)O-杂环和经-C(O)O-取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“(羧基酯)氨基”是指基团-NR-C(O)O-烷基、经-NR-C(O)O-取代的烷基、-NR-C(O)O-烯基、经-NR-C(O)O-取代的烯基、-NR-C(O)O-炔基、经-NR-C(O)O-取代的炔基、-NR-C(O)O-芳基、经-NR-C(O)O-取代的芳基、-NR-C(O)O-环烷基、经-NR-C(O)O-取代的环烷基、-NR-C(O)O-环烯基、经-NR-C(O)O-取代的环烯基、-NR-C(O)O-杂芳基、经-NR-C(O)O-取代的杂芳基、-NR-C(O)O-杂环和经-NR-C(O)O-取代的杂环，其中R为烷基或氢，并且其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“(羧基酯)氧基”是指基团-O-C(O)O-烷基、经-O-C(O)O-取代的烷基、-O-C(O)O-烯基、经-O-C(O)O-取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、经-O-C(O)O-取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、经-O-C(O)O-取代的芳基、-O-C(O)O-环烷基、经-O-C(O)O-取代的环烷基、-O-C(O)O-环烯基、经-O-C(O)O-取代的环烯基、-O-C(O)O-杂芳基、经-O-C(O)O-取代的杂芳基、-O-C(O)O-杂环和经-O-C(O)O-取代的杂环，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环、和经取代的杂环如本文所定义的。

“氰基”是指基团–CN。

“环烷基”是指3个到10个碳原子的具有单个或多个环的环烷基，所述环包含稠环、桥环和螺环体系。合适的环烷基的实例包含例如，金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基和环辛基。

“环烯基”是指3个到10个碳原子的具有单个或多个环并且具有至少一个>C＝C<环不饱和，例如1个到2个>C＝C<环不饱和位点的非芳香族环烷基。

“经取代的环烷基”和“经取代的环烯基”是指具有1个到5个，例如，1个到3个取代基的环烷基或环烯基，所述取代基选自由以下组成的组：氧基、硫酮、烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、芳基、经取代的芳基、芳基氧基、经取代的芳基氧基、芳基硫基、经取代的芳基硫基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、环烷基、经取代的环烷基、环烷基氧基、经取代的环烷基氧基、环烷基硫基、经取代的环烷基硫基、环烯基、经取代的环烯基、环烯基氧基、经取代的环烯基氧基、环烯基硫基、经取代的环烯基硫基、胍基、经取代的胍基、卤基、羟氧基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂芳基氧基、经取代的杂芳基氧基、杂芳基硫基、经取代的杂芳基硫基、杂环、经取代的杂环、杂环基氧基、经取代的杂环基氧基、杂环基硫基、经取代的杂环基硫基、硝基、–SO

“环烷基氧基”是指–O-环烷基。

“经取代的环烷基氧基”是指–O-(经取代的环烷基)。

“环烷基硫基”是指–S-环烷基。

“经取代的环烷基硫基”是指-S-(经取代的环烷基)。

“环烯基氧基”是指–O-环烯基。

“经取代的环烯基氧基”是指–O-(经取代的环烯基)。

“环烯基硫基”是指–S-环烯基。

“经取代的环烯基硫基”是指–S-(经取代的环烯基)。

“胍基”是指基团–NHC(＝NH)NH

“经取代的胍基”是指–NRC(＝NR)N(R)

“H”表示氢。

“卤基”或“卤素”是指氟基、氯、溴基和碘基。

“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指基团–OH。

“杂芳基”是指环内的1个到10个碳原子以及1个到4个杂原子的芳香族基团，所述杂原子选自由氧、氮和硫组成的组。此类杂芳基可以具有单个环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，中氮茚基或苯并噻吩基)，其中所述稠环可以是或可以不是芳香族的和/或可以含有或可以不含有杂原子，条件是连接点通过芳香族杂芳基的原子。在一个实施例中，杂芳基的一个或多个氮和/或硫环原子被任选地氧化，以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包含吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。

“经取代的杂芳基”是指被1个到5个，例如1个到3个或1个到2个取代基取代的杂芳基，所述取代基选自由经取代的芳基定义的取代基的相同基团组成的组。

“杂芳基氧基”是指–O-杂芳基。

“经取代的杂芳基氧基”是指基团–O-(经取代的杂芳基)。

“杂芳基硫基”是指基团–S-杂芳基。

“经取代的杂芳基硫基”是指基团–S-(经取代的杂芳基)。

“杂环(heterocycle)”或“杂环(heterocyclic)”或“杂环烷基”或“杂环基”意指在环中具有至少一个非碳原子，例如氮、氧和硫的任何环体系。在一些实施例中，杂环是1个到10个碳原子和1个到4个杂原子的包含稠环、桥环和螺环体系的具有单个环或多个稠环的饱和或不饱和基团，所述杂原子选自由氮、硫或氧组成的组，其中在稠环体系中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过非芳香族环。在一个实施例中，杂环基的一个或多个氮和/或硫原子被任选地氧化，以提供N-氧化物、亚磺酰基、磺酰基部分。杂环包含但不限于：吡咯、吲哚、呋喃、苯并呋喃、噻吩、苯并噻吩、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、2-咪唑、4-咪唑、3-吡唑、4-吡唑、哒嗪、嘧啶、吡嗪、噌啉、酞嗪、喹唑酮、喹喔啉、3-(1,2,4-N)-三唑基、5-(1,2,4-N)-三唑基、5-四唑基、4-(1-O,3-N)-恶唑、5-(1-O,3-N)-恶唑、4-(1-S,3-N)-噻唑、5-(1-S,3-N)-噻唑、2-苯并恶唑、2-苯并噻唑、4-(1,2,3-N)-苯并三唑和苯并咪唑。

“经取代的杂环”或“经取代的杂环烷基”或“经取代的杂环基”是指被1到5个，例如1个到3个与如经取代的环烷基所定义的相同的取代基取代的杂环基。

杂环和杂芳基的实例包含但不限于吖丁啶、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、中氮茚、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑酮、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噻唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑啉二酮、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)(也被称为硫代吗啉基(thiamorpholinyl))、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷和四氢呋喃基。

“杂环基氧基”是指基团–O-杂环基。

“经取代的杂环基氧基”是指基团–O-(经取代的杂环基)。

“杂环硫基”是指基团–S-杂环基。

“经取代的杂环硫基”是指基团–S-(经取代的杂环基)。

“肼基”是指基团–NHNH

“经取代的肼基”是指肼基，其中如烷基等非氢原子附加到肼基胺基中的一个或两个上。经取代的肼基的实例为–N(烷基)-NH

“硝基”是指基团–NO

“氧代”是指原子(＝O)或(-O

“螺环基”是指3个到10个碳原子的具有带有螺环接的环烷基或杂环基(由单个原子形成的环接，所述环接为环的唯一公共成员)的二价饱和环状基团，如以下结构所例示的：

“磺酰基”是指二价基团-S(O)

“经取代的磺酰基”是指基团-SO

“磺酰基氧基”是指基团–OSO

“硫代酰基”是指基团H-C(S)-、烷基-C(S)-、经取代的烷基-C(S)-、烯基-C(S)-、经取代的烯基-C(S)-、炔基-C(S)-、经取代的炔基-C(S)-、环烷基-C(S)-、经取代的环烷基-C(S)-、环烯基-C(S)-、经取代的环烯基-C(S)-、芳基-C(S)-、经取代的芳基-C(S)-、杂芳基-C(S)-、经取代的杂芳基-C(S)-、杂环-C(S)-和经取代的杂环-C(S)-，其中烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、环烷基、经取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环和经取代的杂环如本文所定义的。

“硫基”是指基团-SH。

“硫代羰基”是指二价基团-C(S)-，其等效于–C(＝S)-。

“硫酮”是指原子(＝S)。

“烷硫基”是指基团-S-烷基，其中烷基如本文所定义的。

“经取代的烷硫基”是指基团-S-(经取代的烷基)，其中经取代的烷基如本文所定义的。

如本文所使用的术语“可检测响应”是指通过观察或通过仪器可直接或间接检测到的信号的发生或信号的变化。在一些实施例中，可检测响应是导致波长分布模式或吸光度或荧光强度的变化或光散射、荧光寿命、荧光偏振或以上参数的组合的变化的光学响应。

如本文所使用的术语“染料”是指发射光以产生可观察到的可检测信号的化合物。

如本文所用的，术语“荧光发生”是指在与所关注的生物化合物或分析物结合和/或在被酶切割后表现出荧光的变化的化合物或组合物。

如本文所用，术语“荧光基团”是指能够在激发时发射光的部分或化合物，并且包含在与所关注的生物化合物或分析物结合时和/或在被酶切割时展现出荧光的荧光发生荧光基团。本公开的荧光基团可以被取代以改变荧光基团的溶解度、光谱性质或物理性质。

如本文所用，“药学上可接受的盐”或“生物相容性盐”是抗衡离子，其在如使用时是无毒的并且对生物分子不具有实质有害作用。此类盐的实例包含K

如本文所使用的术语“连接子”或“L”是指单个共价键或包括一系列稳定共价键的部分，所述部分通常并入1-40个多价原子，所述多价原子选自由C、N、O、S和P组成的组，其将荧光发生或荧光化合物共价连接到另一个部分，如化学反应性基团或生物和非生物组分。连接子中的多价原子的数量可以为例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30，或更大的数量，多达40或更多。连接子可以是线性的或非线性的；一些连接子具有侧链或侧链官能团或两者。此类侧链部分的实例为亲水性改性剂，例如可溶性基团，如磺酰基(-SO

术语“反应性基团”在本文中还被称为“反应性配体”(或“R

示例性反应性基团包含但不限于烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐、异氰酸盐、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、胺、肼、腙、酰肼、重氮基(diazo)、重氮(diazonium)、硝基、腈、硫基、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、亚磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸盐、硝酮、羟胺、肟、羟肟酸、异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、尿素、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸盐、亚胺、叠氮、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化物。反应性官能团还包含用于制备生物缀合物的那些，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(或琥珀酰亚胺基酯(SE))、马来酰亚胺、磺酸基二氯苯基(SDP)酯、磺酸基四氟苯基(STP)酯、四氟苯基(TFP)酯、五氟苯基(PFP)酯、次氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、环辛炔-胺等。用于制备这些官能团中的每种官能团的方法是本领域众所周知的，并且其针对特定目的的应用或修饰处于本领域的技术人员的能力内(参见例如Sandler和Karo编辑,“有机官能团制备(Organic Functional Group Preparations)”,《学术出版社(Academic Press)》,圣地亚哥(San Diego),1989)。示例性反应性基团或反应性配体包含NHS酯、亚磷酰胺和以下表1中所列示的其它部分。核苷酸、核苷和糖(例如，核糖基和脱氧核糖基)由于至少其通过酶催化形成磷酸二酯键的能力，也被视为反应性配体。为了避免疑问，饱和烷基不被视为反应性配体。

如本文所用的术语“载体分子”是指与本文所公开的细胞追踪剂化合物共价结合或变得与其共价结合的生物组分或非生物组分。此类组分包含但不限于氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合物微粒、生物细胞、病毒和其组合。包含的是其中载体分子包括具有至少4个多价原子和通常多于10个多价原子(即，除了氢和卤基的原子)，例如，至少15个此类原子的有机部分，如在具有至少20个此类原子的分子的情况下的实施例。

术语“缀合的物质”或“S

如本文所用，“靶标结合部分”是指与荧光基团连接或可以与荧光基团连接，以提供具有特异性结合活性和荧光发生或荧光性质两者的化合物的部分。示例性目标结合部分包含：细胞骨架结合部分，如紫杉醇或肌动蛋白结合肽；DNA结合分子，如Hoechst或硝基-Hoechst；多核苷酸(其可以杂交成互补序列)；以及其抗体和抗体结合片段。

如本文所使用的术语“固体支撑物”是指基本上不溶于液相并且能够结合所关注的分子或颗粒的基质或介质。适用于本文的固体支撑物包含半固体支撑物，并且不限于具体类型的支撑物。有用的固体支撑物包含固体和半固体基质，如气凝胶和水凝胶、树脂、珠、生物芯片(包含薄膜涂覆的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也被称为微量滴定板或微孔板)、膜、传导和非传导金属、玻璃(包含显微镜载玻片)和磁性支撑物。有用的固体支撑物的更具体的实例包含硅胶、聚合物膜、颗粒、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝胶、多糖，如

如本文所使用的，术语“染色”是在显微术中用于增强显微图像中的对比度的技术。染色剂和染料通常用于突出生物组织和细胞中的结构。染色还涉及将染料添加到底物，以对具体化合物，如蛋白质、核酸、脂质或碳水化合物的存在进行定量或鉴定具体化合物的存在。生物染色还用于在流式细胞术中标记细胞，并在凝胶电泳中标记蛋白质或核酸。染色不限于生物材料，并且可以用于研究其它材料的形态，如半结晶聚合物和嵌段共聚物。

“低级烷基”表示含有1个到8个碳原子的直链和支链烃部分，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基、新戊基、叔戊基等。“低级卤代烷基”表示具有一个或多个卤素原子取代基的低级经取代的烷基，通常为氟基、氯、溴基或碘基。

“低级烯烃”表示含有1个到8个碳原子的烃，其中碳-碳键中的一个或多个碳-碳键是双键。

“低级炔烃”表示含有1个到8个碳原子的烃，其中碳中的一个或多个碳与三键结合。

“核苷”是指由在1'位置处与戊糖连接的嘌呤、脱氮杂嘌呤或嘧啶核苷碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮杂腺嘌呤、脱氮杂鸟苷等组成的化合物。当核苷碱基为嘌呤或7-脱氮杂嘌呤时，糖部分连接在嘌呤或脱氮杂嘌呤的N

如本文所使用的术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中酯化的最常见的位点是连接到戊糖的C-5位置处的羟基。如本文所使用的术语“核苷/核苷酸”是指包含核苷和核苷酸两者以及其类似物的一组化合物。关于核苷/核苷酸的“类似物”包含具有经修饰的碱基部分、经修饰的糖部分和/或经修饰的磷酸盐部分的合成类似物，例如由Scheit,“核苷酸类似物(Nucleotide Analogs)”(约翰威立公司(John Wiley),纽约(NewYork),1980)总体描述的。磷酸盐类似物包括磷酸盐的其中磷酸原子呈+5氧化状态并且氧原子中的一个或多个氧原子被非氧部分替代的类似物，示例性类似物包含硫代磷酸盐、二硫代磷酸盐、硒代磷酸盐、二硒代磷酸盐、苯基硫代磷酸盐、苯胺磷酸盐、氨基磷酸盐、硼磷酸盐等，如果此类抗衡离子存在，则包含缔合的抗衡离子，例如H

“多核苷酸”(其包含“寡核苷酸”)意指天然核苷酸单体或其类似物的线性聚合物，包含双链和单链脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其α-异头物形式等。通常核苷单体通过磷酸二酯键连接，其中如本文所使用的，术语“磷酸二酯键(phosphodiester linkage)”是指磷酸二酯键(phosphodiester bond)或包含其磷酸盐类似物的键，如果此类抗衡离子存在，则包含缔合的抗衡离子，例如H

“水溶性基团”意指增加本发明化合物在水性溶液中的溶解度的取代基。示例性水溶性基团包含但不限于季胺、硫酸盐、磺酸盐、羧基盐、膦酸盐、磷酸盐、聚醚、聚羟基、硼酸盐、聚乙二醇和氧化乙烯的重复单元(-(CH

示例性化合物、组合物、方法、用途和试剂盒

本文提供了硅罗丹明(SiR)染料和其缀合物、包含此类染料的试剂盒和组合物以及使用此类染料以检测生物材料并对生物材料进行定量的方法、制备此类染料和/或对此类染料进行官能化或缀合此类染料的方法。

1.染料和缀合物

公开了式(I)化合物，如以上实施例1中所示：

其中：

R

R

或者R

每个L

每个R

每个R

R

R

R

R

R

每个L

R

R

R

E为SO

R

R

R

R

R

每个R

每个R

R

R

R

R

进一步地，其中(i)如果R

或其螺内酯形式和/或盐。

还公开了图1A-1Q中示出的化合物1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59。尽管如三乙胺等抗衡离子被示出为具有某些化合物，如化合物10A-13，但对此类化合物的提及不包含特定抗衡离子，除非明确指出。如此，例如，“化合物10A”包含具有其它阳离子的盐以及对应游离磺酸(磺酰基氢氧化物)。类似地，在一些情况下，前体、副产物、试剂等被示出为例如具有化合物45；这些化合物仅出于信息目的，并且不限制化合物自身的结构。如R

还公开了其中R

所列示的如以上的化合物1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的所选化合物并非旨在作为本公开的染料的排他性列表。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，取代基和化合物结构的多种修饰、取代和改变是可能的。例如，如本文所描述的，还提供了本文所述的化合物的缀合物。

本公开的包括苯环(即，式(I)的R

可替代地，R

在一些实施例中，提供了展现出近红外荧光的化合物。本公开的SiR化合物的荧光可以通过在SiR的稠环体系中包含另外的环而被红移。例如，R

在一些实施例中，任选地除了R

本领域的技术人员将理解，化合物可以展现出互变异构、构象异构、几何异构和/或立体异构的现象。由于本说明书和权利要求书中的式的附图不一定代表所有可能的互变异构、构象异构、对映异构或几何异构形式，因此应当理解，本公开涵盖具有本文所描述的功用的一种或多种功用的化合物的任何互变异构、构象异构、对映异构和/或几何异构形式。

另外，还将显而易见的是，化合物可以以许多不同的质子化状态存在，这尤其取决于其环境的pH等。尽管本文提供的结构式描绘了几种可能的质子化状态中的仅一种质子化状态下的化合物，但是应当理解，这些结构仅是说明性的，并且本公开不限于任何特定质子化状态。SiR化合物的任何和所有质子化形式旨在落入本公开的范围内。

此外，本公开的化合物可以承载多个正电荷或负电荷。与酶底物的缔合的抗衡离子通常通过合成和/或化合物通过其获得的分离方法决定。典型的抗衡离子包含但不限于铵、钠、钾、锂、卤化物、乙酸盐、三氟乙酸盐等和其混合物。将理解的是，任何缔合的抗衡离子的标识不是本公开的关键特征，并且除非另有说明，否则本公开涵盖与任何类型的抗衡离子缔合的化合物。

在本公开的某些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包括本文提供的化合物中的任何化合物和至少一种溶剂。在某些实施例中，溶剂包括水或DMSO或其组合。在某些实施例中，组合物进一步包括培养基。

在某些实施例中，提供了组合物，所述组合物包括：a)本文提供的化合物中的一种或多种化合物；以及b)载体。

在某些实施例中，提供了组合物，所述组合物包括：a)本文提供的化合物中的一种或多种化合物；以及b分析物。

2.反应性基团、载体分子和固体支撑物

在示例性实施例中，本文提供的SiR化合物包括反应性基团或反应性配体，所述反应性基团或反应性配体是选自以下的成员：丙烯酰胺、羧酸的活化酯、酰基叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮、氮丙啶、硼酸盐、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、酰肼、亚氨基酯、异氰酸盐、异硫氰酸盐、马来酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂复合物、磺酰基卤、硫基和可光活化的基团。在一些实施例中，化合物包括可用于与另一分子缀合的反应性基团或反应性配体。示例性反应性基团和/或配体包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、羧基、羧基酯、马来酰亚胺、酰胺、磺酸基二氯苯基(SDP)酯、磺酸基四氟苯基(STP)酯、四氟苯基(TFP)酯、五氟苯基(PFP)酯、乙酰氧基甲基(AM)酯、次氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖和环辛炔胺等。

这些反应性基团可以在本文提供的SiR化合物的合成期间或之后共价连接，以提供含反应性基团的SiR化合物。以此方式，含反应性基团的SiR化合物可以与含有或被修饰成含有具有合适的反应性的官能团的各种载体分子或固体支撑物共价连接，从而引起组分的化学连接。在示例性实施例中，本文公开的SiR化合物的反应性基团和固体支撑物的载体分子的官能团包括可以在其之间生成共价键的亲电体和亲核体。可替代地，反应性基团包括可光活化的基团，所述可光活化的基团仅在用适当波长的光照明之后才变成化学反应性的。通常，反应性基团与载体分子或固体支撑物之间的缀合反应导致反应性基团的一个或多个原子并入到将SiR化合物连接到载体分子或固体支撑物的新键中。

例如，将NHS酯与具有亲核基团(例如氨基或巯基)的连接子或分子缀合的通用方案需要将NHS酯溶解在水性乙腈中(乙腈的百分比由染料获得可溶性的疏水性确定)以及将连接子溶解在水中(或如果连接子为疏水的，则为水性乙腈溶液)。在涡旋或摇动的同时，向溶液中添加水性碳酸氢钠缓冲液(1M)以实现0.1M的缓冲液浓度。在室温下摇动混合物，持续10分钟到30分钟。可以通过反相HPLC对反应混合物中的粗缀合物进行纯化。

官能团和键的所选实例如表1中示出的，其中亲电基团和亲核基团的反应得到共价键。本领域的技术人员可以根据所缀合的化合物的标识、那些化合物中的其它部分的反应性(例如，以避免不期望的副产物)以及对共价键所期望的性质，选择合适的基团配对。因此，在一些实施例中，反应性配体选自表1中列出的亲电基团或亲核基团。在一些实施例中，化合物的反应性基团或反应性配体选自表1中列出的亲电基团。在一些实施例中，化合物的反应性基团或反应性配体选自表1中列出的亲核基团。

表1：到有用的共价键的一些途径的实例

用于将本公开的SiR化合物与待缀合的物质连接的反应性基团的选择通常取决于待缀合的物质上的反应性基团或官能团和所期望的共价键的类型或长度。通常存在于有机或无机物质(生物分子或非生物分子)上的官能团的类型包含但不限于胺、酰胺、硫基、醇、酚、醛、酮、磷酸盐、咪唑、肼、羟胺、经二取代的胺、卤化物、环氧化物、甲硅烷基卤、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯烃键或这些基团的组合。单一类型的反应性位点可用于物质上(通常为多糖或二氧化硅)，或者各种位点可能存在(例如，胺、硫基、醇、酚)，如通常为蛋白质。

通常，反应性基团将与胺、硫基、醇、醛、酮或与二氧化硅反应。优选地，反应性基团与胺或硫基官能团或与二氧化硅反应。在一个实施例中，反应性基团或为丙烯酰胺、羧酸的活化酯、酰基叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、甲硅烷基卤、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮、氮丙啶、硼酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包含酰肼)、亚氨基酯、异氰酸盐、异硫氰酸盐、马来酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂复合物、磺酰基卤或硫醇基。“反应性铂复合物”特指如美国专利第5,714,327号描述的化学反应性铂复合物。

在反应性基团为羧酸的活化酯(如羧酸的琥珀酰亚胺基酯)、磺酰基卤、四氟苯基酯或异硫氰酸盐的情况下，所产生的化合物可特别用于制备载体分子，如蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或半抗原的缀合物。在反应性基团为马来酰亚胺、卤代烷基或卤代乙酰胺(包含美国专利第5,362,628号、第5,352,803和第5,573,904中公开的任何反应性基团)时，所产生的化合物可特别用于与含硫基的物质缀合。在反应性基团为酰肼的情况下，所产生的化合物可特别用于与高碘酸盐氧化的碳水化合物和糖蛋白缀合，并且另外是细胞显微注射的可醛固定的极性示踪剂。在反应性基团为甲硅烷基卤的情况下，所产生的化合物可特别用于与二氧化硅表面缀合，特别是在将二氧化硅表面掺入到随后用于远程离子检测或定量的光纤探针中的情况下。

在特定方面，反应性基团是可光活化的基团，使得所述基团仅在用适当波长照明之后才转化成反应性物种。适当波长通常是小于400nm的UV波长。此方法提供了在溶液中或固定在固体或半固体基质上的到仅靶标分子的特异性连接。以此方式，本文提供的包括可光活化的反应性基团的SiR化合物与阴离子蛋白质缔合，并且可以与蛋白质共价缀合。可光活化的反应性基团包含但不限于二苯甲酮、芳基叠氮和双吖丙啶。

在某些实施例中，反应性基团是可光活化的基团、羧酸的琥珀酰亚胺基酯、卤代乙酰胺、卤代烷基、肼、异硫氰酸盐、马来酰亚胺基团、脂肪族胺、甲硅烷基卤、尸胺或补骨脂素。在某些实施例中，反应性基团为羧酸的琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺或甲硅烷基卤。在一个特定实施例中，反应性基团为羧酸的琥珀酰亚胺基酯、磺酰基卤、四氟苯基酯、异硫氰酸盐或马来酰亚胺。

使报道分子与载体分子或固体支撑物连接的共价键的选择通常取决于待缀合的组分上的化学反应性基团。上一节中关于反应性基团的讨论也在此相关。除了肼基附属物之外，通常存在于生物或非生物组分上的示例性反应性基团包含但不限于胺、硫基、醇、酚、醛、酮、磷酸盐、咪唑、肼、羟胺、经二取代的胺、卤化物、环氧化物、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸或这些基团的组合。单一类型的反应性位点可用于组分上(通常为多糖)，或者各种位点可能存在(例如，胺、硫基、醇、酚)，如通常为蛋白质。载体分子或固体支撑物可以与可以相同或不同的多于一种报道分子缀合，或者与被半抗原另外修饰的物质缀合。尽管通过仔细控制反应条件可以获得某种选择性，但标记的选择性最好通过选择适当的反应性化合物来获得。

在式(I)的SiR化合物的缀合物形成的情况下，产物仍被视为式(I)化合物，其中新缀合的材料被视为通过式(I)的侧基之一，例如R

载体分子:

在另一个示例性实施例中，本说明书的SiR化合物与载体分子共价结合。如果化合物具有反应性基团(或反应性配体)，则载体分子可以通过反应性基团与化合物可替代地连接。反应性基团可以含有反应性官能部分和连接子两者，或包含仅反应性官能部分。

多种载体分子可用于本公开中。示例性载体分子包含抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核酸聚合物、碳水化合物、脂质和聚合物。

在示例性实施例中，载体分子包括氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合物微粒、生物细胞、病毒和其组合。在另一个示例性实施例中，载体分子选自半抗原、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、蛋白质、肽或多糖。在另一个示例性实施例中，选自R

在示例性实施例中，载体分子包括氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、合成聚合物、聚合物微粒、生物细胞、病毒和其组合。在另一个示例性实施例中，载体分子选自半抗原、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、蛋白质、肽或多糖。在一个优选实施例中，载体分子为氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体、酪胺、合成聚合物、聚合物微粒、生物细胞、细胞组分、离子螯合分子、酶底物或病毒。在另一个优选实施例中，载体分子为抗体或其片段、抗原、亲和素或链霉亲和素、生物素、葡聚糖、抗体结合蛋白、荧光蛋白、琼脂糖和非生物微粒。通常，载体分子为抗体、抗体片段、抗体结合蛋白、亲和素、链霉亲和素、毒素、凝集素或生长因子。优选的半抗原包含生物素、地高辛和荧光蛋白。

抗体结合蛋白包含但不限于蛋白质A、蛋白质G、可溶性Fc受体、蛋白质L、凝集素、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗IgD、抗IgE或其片段。

在示例性实施例中，酶底物选自：氨基酸、肽、糖、醇、烷酸、4-胍基苯甲酸、核酸、脂质、硫酸盐、磷酸盐、-CH

在另一个示例性实施例中，载体分子为氨基酸(包含被磷酸盐、碳水化合物或C

在另一个示例性实施例中，载体分子包括核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，任选地含有用于连接荧光基团或其它配体，如炔基键的另外的连接子或间隔子(美国专利第5,047,519号)、氨基烯丙基键(美国专利第4,711,955号)或其它键。在另一个示例性实施例中，核苷酸载体分子是核苷或脱氧核苷或双脱氧核苷。

示例性核酸聚合物载体分子为单链或多链、天然或合成DNA或RNA寡核苷酸或DNA/RNA杂交体，或掺入如吗啉衍生的磷酸盐等不常见连接子(俄勒冈州科瓦利斯的AntiVirals公司(AntiVirals,Inc.,Corvallis OR))或肽核酸，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元，其中核酸含有少于50个核苷酸，更典型地少于25个核苷酸。

在另一个示例性实施例中，载体分子包括通常为多糖的碳水化合物或多元醇，如葡聚糖、FICOLL(康乃狄克州费尔菲尔德的GE医疗公司(GE Healthcare,Fairfield,CT))、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、淀粉、琼脂糖和纤维素，或为聚合物，如聚(乙二醇)。在一个相关实施例中，多糖载体分子包含葡聚糖、琼脂糖或FICOLL。

在另一个示例性实施例中，载体分子包括脂质(通常具有6个–25个碳)，包含糖脂、磷脂和鞘脂。可替代地，载体分子包括如脂质体等脂质囊泡，或者为脂蛋白(参见以下)。一些亲脂性取代基可用于促进将缀合的染料化合物传送到细胞或细胞器中。

可替代地，载体分子为细胞、细胞体系、细胞片段或亚细胞颗粒。此类型的缀合的材料的实例包含病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、生物细胞(如动物细胞、植物细胞、细菌或酵母)或细胞组分。可以被标记或其成分分子可以被标记的细胞组分的实例包含但不限于溶酶体、内体、细胞质、细胞核、组蛋白、线粒体、高尔基器、内质网和液泡。

在另一个实施例中，载体分子为金属螯合部分。尽管结合所关注的金属离子并改变其荧光性质的任何螯合剂是合适的缀合物，但是优选的金属螯合部分为冠醚，包含二芳基二氮杂冠醚，如Kuhn等人(1995)的美国专利第5,405,975号中所描述的；1,2-双-(2-氨基苯氧基乙烷)-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)的衍生物，如Kuhn等人(1995)的美国专利第5,453,517号(通过引用并入)和Tsien等人(1991)的美国专利第5,049,673号中描述的；2-羧基甲氧基-苯胺-N,N-二乙酸(APTRA)的衍生物，如Raju等人,《美国生理学会(Am.J.Physiol.)》256:C540(1989)中描述的；以及基于吡啶基的金属离子螯合剂和菲咯啉金属离子螯合剂，如Kuhn等人(1997)的美国专利第5,648,270号中描述的。

在另一个示例性实施例中，载体分子与有机或无机材料非共价缔合。具有亲脂性取代基的载体分子的示例性实施例可以用于通过将染料化合物非共价掺入在膜内而靶向如生物膜或脂质体等脂质组装体，例如，用作膜结构的探针或用于掺入在脂质体、脂蛋白、薄膜、塑料、亲脂性微球或类似材料中。

在一个示例性实施例中，载体分子包括特异性结合对成员，其中本发明化合物与特异性结合对成员缀合，并且用于检测样品中的分析物。可替代地，标记的特异性结合对成员的存在指示所述特异性结合对的互补成员的位置；每个特异性结合对成员在表面上或在腔中具有与另一个特异性结合对成员的特定空间和极性组织特异性结合并互补的区域。示例性结合对示出在表2中。

表2.代表性特异性结合对

固体支撑物：

在某些实施例中，本文公开的SiR化合物与固体支撑物共价结合。固体支撑物可以通过荧光基团或通过反应性基团(如果存在)或通过载体分子(如果存在)与SiR化合物连接。

适用于本文的固体支撑物通常基本上不可溶于液相。用于本文的固体支撑物不限于具体类型的载体。而是，大量的支撑物是可用的并且是本领域的普通技术人员已知的。因此，有用的固体支撑物包含固体和半固体基质，如气凝胶和水凝胶、树脂、珠、生物芯片(包含薄膜涂覆的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也被称为微量滴定板或微孔板)、膜、传导和非传导金属、玻璃(包含显微镜载玻片)和磁性支撑物。有用的固体支撑物的更具体的实例包含硅胶、聚合物膜、颗粒、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝胶、多糖，如SEPHAROSE(康乃狄克州费尔菲尔德的GE医疗公司)、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL(GE医疗公司)、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝化纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包含聚(乙烯乙二醇))、尼龙、乳胶珠、磁性珠、顺磁性珠、超顺磁性珠、淀粉等。

在某些实施例中，固体支撑物可以包含用于连接本文公开的染料化合物的固体支撑物反应性官能团，包含但不限于羟基、羧基、氨基、硫基、醛、卤素、硝基、氰基、胺基、尿素、碳酸盐、氨基甲酸盐、异氰酸盐、砜、磺酸盐、磺酰胺、亚砜等。有用的反应性基团在上面公开，并且同等地适用于本文的固体支撑物反应性官能团。

合适的固相支撑物可以基于所期望的最终用途和对各种合成方案的适用性来选择。例如，在期望酰胺键形成以将本文公开的SiR化合物与固体支撑物连接的情况下，可以采用通常用于肽合成的树脂，如聚苯乙烯(例如，从Bachem公司、半岛实验室(PeninsulaLaboratories)等获得的PAM-树脂)、POLYHIPE树脂(从加拿大的Aminotech公司(Aminotech,Canada)获得)、聚酰胺树脂(从半岛实验室获得)、嫁接有聚乙二醇的聚苯乙烯树脂(TENTAGEL，德国图宾根大学的Rapp Polymere公司(Rapp Polymere,Tubingen,Germany))、聚二甲基丙烯酰胺树脂(可从加利福尼亚的Milligen/Biosearch(Milligen/Biosearch,California)获得)或PEGA珠(从聚合物实验室有限公司(PolymerLaboratories)获得)。

3.与靶标结合分子的缀合物

通常，关于本文描述的包括SiR部分和缀合的部分(例如，靶标结合部分、核苷酸、多核苷酸、亚磷酰胺等)的化合物，SiR部分具有式(I)的结构，其中其取代基(例如，R

在一些实施例中，提供了缀合物，其中SiR部分与靶标结合部分，如抗体、细胞骨架结合部分或核酸结合部分连接。包括靶标结合部分的SiR化合物可以用于对通过靶标结合部分结合的靶标进行荧光染色，例如，以用于本文其它地方描述的荧光显微术和超分辨率显微术应用。

例如，为了制备此类缀合物，可使靶标结合部分的反应性基团(例如，抗体上的胺)与式(I)化合物上的反应性基团，如NIIS酯反应，以提供根据本公开的缀合物。在一些实施例中，本文公开的化合物首先通过将其部分转化为与靶标结合部分反应的反应性配体来活化。此类缀合反应的产物也被视为本文公开的化合物。

因此，在一些实施例中，式(I)化合物包括靶标结合部分。在一些实施例中，靶标结合部分为式(I)的R

在一些实施例中，靶标结合部分是细胞骨架结合部分。

在一些实施例中，细胞骨架结合部分是微管结合部分，如多西紫杉醇。缀合的多西紫杉醇的示例性结构为

在一些实施例中，细胞骨架结合部分为肌动蛋白结合肽。缀合的肌动蛋白结合肽的示例性结构为

在一些实施例中，靶标结合部分为肌动蛋白结合部分，如鬼笔环肽。示例性鬼笔环肽缀合物可以使用硅罗丹明，如化合物7A制备。

在一些实施例中，靶标结合部分是核酸结合部分，例如DNA结合部分。示例性核酸结合部分是Hoechst部分或硝基-Hoechst部分。缀合的Hoechst部分的示例性结构为

用于对涉及R

4.亚磷酰胺和标记的核苷、核苷酸和多核苷酸

本文还提供了根据式(I)的包括亚磷酰胺的化合物。亚磷酰胺可以是式(I)的R

在一些实施例中，化合物为具有式(L1)的亚磷酰胺化合物：

其中X和Y一起形成连接子；B

亚磷酰胺化合物可以通过多种已知方法合成。通常，合成进行如下。D的酚羟基(如果有的话)受到染料保护基保护，所述染料保护基可以用DNA合成脱保护剂，例如氨、乙醇胺、甲胺/氢氧化铵的混合物以及叔丁胺/水/甲醇的混合物(1:2:1)去除，例如，参见美国专利第5,231,191号。如此保护的染料在本文中被称为染料的“受保护衍生物”。在一些实施例中，保护基是苯甲酸或特戊酸的酯。然后，用例如碳二亚胺使受保护染料(例如羧酸)的反应性配体活化，并使受保护染料与醇连接子衍生物，例如，氨基醇，例如乙醇胺、己醇胺等在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或另一种类似非质子溶剂反应，以得到具有游离醇官能团的受保护染料，例如醇酰胺衍生物。然后使用标准程序，使游离醇与亚磷酸化剂，例如含有催化量的四唑二异丙胺的含二-(N,N-二异丙基氨基)甲氧基膦的乙腈反应，以得到亚磷酰胺，例如美国专利第5,231,191号。

在一些实施例中，提供了用本文描述的SiR部分标记的多核苷酸。此类多核苷酸可以利用式(L1)化合物通过核苷酸的糖部分使用固体支撑物合成来标记化学合成的或可自动化学合成的多核苷酸的5'端产生。可替代地，包括第一反应性配体(例如，亲核反应配体，如伯胺)的多核苷酸可以通过使其与包括可与第一反应性配体(例如，亲电反应性配体，如活性酯，例如NHS酯)相容的第二反应性配体的式(I)化合物反应来标记。

在一些实施例中，提供的亚磷酰胺化合物具有式(L2)：

其中可变取代基定义如下。B

在一些实施例中，B

通常，式(L2)的核苷酸亚磷酰胺可以如美国专利第9,783,560号中描述的合成，所述美国专利在此通过引用以其整体并入。

式(L2)化合物适合于内部标记化学合成的多核苷酸。因此，本文还提供了包括用本文公开的SiR部分标记的碱基的多核苷酸，例如其中所述碱基通过式(I)的R

本文还提供了具有以下结构的标记的核苷/核苷酸

NUC-DYE

其中NUC为核苷/核苷酸或核苷/核苷酸类似物，并且DYE是本文所描述的含SiR的染料部分。NUC和DYE可以通过连接子连接，其中所述连接子通过式(I)的位置R

核苷酸的标记可以使用大量已知核苷/核苷酸标记技术中的任何一种来完成，所述核苷/核苷酸标记技术采用已知的连接子、连接基团和缔合的互补官能团。通常，连接SiR化合物和核苷的连接子应(i)对多核苷酸合成条件是稳定的，(ii)不干扰多核苷酸-靶标杂交，(iii)可与相关酶，例如聚合酶、连接酶等相容，并且(iv)不会不利地影响染料的荧光性质。适合于使用的示例性碱基标记程序包含以下：Gibson等人,《核酸研究》,15:6455-6467(1987)；Gebeyehu等人,《核酸研究》,15:4513-4535(1987)；Haralambidis等人,《核酸研究》,15:4856-4876(1987)；Nelson等人,《核苷和核苷酸(Nucleosides andNucleotides)》,5(3):233-241(1986)；Bergstrom等人,《美国化学会志(JACS)》,111:374-375(1989)；美国专利第4,855,225号、第5,231,191号和第5,449,767号。

在一些实施例中，连接子包括炔属胺基或烯属胺基，染料与核苷/核苷酸碱基之间的连接子通过使染料的活化N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与核苷/核苷酸的炔基氨基或烯基氨基衍生的碱基反应而形成。在另外的实施例中，所产生的连接子是3-(羧基)氨基-1-丙炔-1-基。在其它实施例中，连接子包括具有以下结构的经取代的炔丙基乙氧基胺基：-C≡C-CH

在一些实施例中，标记的核苷/核苷酸为式(L3)化合物：

其中B为核苷酸碱基，例如，尿嘧啶、胞嘧啶、脱氮杂腺嘌呤或脱氮杂鸟苷；分别地，W

根据本公开的使用亚磷酰胺化合物对示例性双标记的引物的制备展示在图8中。根据本公开的使用NHS酯化合物对示例性双标记的引物的制备展示在图9中。

为了进行通常与亚磷酰胺化合物、核苷和核苷酸制备，包含有用试剂和反应条件有关的另外的讨论，请参见美国专利第6,008,379号和第9,783,560号，所述美国专利通过引用并入本文。

5.用于增加水溶性的部分

可以期望的是增加本文提供的SiR化合物的水溶性，例如，以允许在水性环境中使用较高浓度的SiR化合物和/或使SiR化合物对于活细胞的完整细胞膜是不可渗透的。如此，在一些实施例中，R

在一些实施例中，增溶官能团可以作为连接子的一部分提供。例如，可以提供聚氧乙烯连接子-(CH

在一些实施例中，增溶官能团可以作为芳基或杂芳基上的取代基提供。在一些实施例中，化合物包括被可以相同或不同的至少1个、2个或3个增溶官能团(例如，磺酸盐)取代的芳基或杂芳基(例如，苯基)。在一些实施例中，化合物包括被至少1个，例如，至少2个磺酸盐，如彼此成间位朝向的2个磺酸盐取代的芳基或杂芳基(例如，苯基)。

示例性增溶取代基为包括聚氧乙烯连接子、反应性配体和用2个磺酸盐取代的苯基的增溶取代基，例如，

6.用途；染色和检测方法

本文提供的SiR化合物和缀合物可以用于多种生物应用。已经发现SiR化合物和缀合物具有出乎意料的性质，包含在不牺牲其它特性的情况下增加亮度和光稳定性。令人惊讶地发现，SiR化合物在R1或R2位置处的缀合不会不利地影响化合物的光化学性质；相反，看到亮度和光稳定性增加了(参见例如化合物4、5和6)。

在一些实施例中，本文提供的SiR化合物可以用于标记细胞、细胞结构、细胞器、靶标分子等或对细胞、细胞结构、细胞器、靶标分子等进行染色。在一些实施例中，提供了对细胞或细胞结构进行染色或标记细胞或细胞结构的方法，所述方法包括：a)使含有一个或多个细胞或细胞结构的样品与式(I)的SiR化合物接触，以形成所接触样品；b)将所述所接触样品温育适当量时间，以形成经温育的样品；c)用适当波长对所述样品照明，以形成所照明样品；以及d)检测来自所述所照明样品的荧光发射。

在一些实施例中，提供了检测靶标分子的方法，所述方法包括：a)使含有或认为含有靶标分子的样品与式(I)的SiR化合物接触，以形成所接触样品；b)将所述所接触样品温育适当量时间，以形成经温育的样品；c)用适当波长对所述样品照明，以形成所照明样品；以及d)检测来自所述所照明样品的荧光发射，其中所述荧光发射用于检测所述靶标分子。

在一些实施例中，提供了用于检测生物结构的方法，所述方法包括：a)将含有或认为含有具体生物结构的样品与式(I)的SiR化合物组合，其中所述生物结构含有核酸；b)将经组合的样品与SiR化合物温育足以使所述SiR化合物与生物结构中的核酸组合以形成具有对应于所述生物结构的可检测荧光信号的SiR核酸复合物的模式的时间；以及c)检测对应于所述生物结构的荧光信号。

在一些实施例中，本文提供的方法中使用的化合物选自1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59或其开放形式或螺内酯形式和/或盐或游离酸。

标记的抗体。在一些实施例中，本文提供的SiR部分可以与本文描述的抗体缀合，以提供包括抗体的式(I)化合物。如此，提供了用于对抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等进行染色或检测抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等的方法，所述方法包括使疑似包括抗原的样品与包括对抗原具有特异性的抗体的式(I)化合物接触。本文还提供了用于对抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等进行染色或检测抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等的方法，所述方法包括使疑似包括抗原的样品与对所述抗原具有特异性的第一抗体接触，以及使所述第一抗体与包括对所述第一抗体具有特异性的抗体的式(I)化合物接触(即，本文公开的用SiR部分标记的第二抗体)。还提供了此类式(I)化合物作为第一或第二抗体对所关注的抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等进行染色或检测所关注的抗原或包括抗原的细胞、细胞组分、组织等的对应用途。此类方法和用途涵盖免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞术(例如FACS)、蛋白质印迹、荧光ELISA和可使用荧光标记的抗体的任何其它方法。

细胞骨架染色。在一些实施例中，本公开的SiR部分可以与如本文描述的细胞骨架结合部分缀合，以提供包括细胞骨架结合部分的式(I)化合物。如此，提供了用于对细胞骨架组分(例如肌动蛋白或微管)进行染色或检测细胞骨架组分的方法，所述方法包括使细胞样品(例如，包括渗透化细胞和/或固定细胞)与包括细胞骨架结合部分的式(I)化合物接触(例如，肌动蛋白或微管结合部分，如本文所描述的那些部分中的任何部分)。

核酸染色和检测。在一些实施例中，本公开的SiR部分可以与如本文描述的核酸结合部分缀合，以提供包括核酸结合部分的式(I)化合物。在一些实施例中，本公开的SiR部分可以与多核苷酸或与掺入到多核苷酸中的核苷酸连接，其然后可以充当标记的引物或探针。可以将此类化合物与含有或认为含有核酸聚合物的样品组合，并且然后将化合物和样品的混合物温育足以使化合物与样品中的核酸聚合物组合，以形成具有可检测荧光信号的一个或多个化合物核酸复合物的时间。核酸可以是DNA，例如dsDNA或ssDNA。核酸也可以是RNA或RNA-DNA杂交体。可以使用化合物来标记或检测多种样品，如水性溶液、测序或扩增反应(如PCR)、细胞样品(例如，用于FISH或常规核或染色体染色)以及电泳凝胶中的核酸。本领域的技术人员将认识到何时使用包括一般核酸或DNA结合部分的化合物以及何时使用靶向特定序列的探针或引物。

在一些实施例中，提供了对核酸进行染色的方法，所述方法包括：将含有或认为含有核酸的样品与式(I)化合物组合；以及将样品和化合物温育足以使化合物与样品中的核酸组合，以形成得到可检测荧光信号的一种或多种化合物-核酸复合物的时间。在一些实施例中，化合物选自1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59或其开放形式或螺内酯形式和/或盐或游离酸。

可以使用例如本文描述的能够特异性地结合靶多核苷酸的SiR化合物，并且通过例如检测来自所述复合物的荧光或检测由于复合物形成而造成的荧光的变化确定包括所述靶多核苷酸和SiR化合物的复合物是否形成来特异性检测靶多核苷酸，任选地其中由于复合物形成而造成的荧光的所述变化是由于切割或构象变化而引起的淬灭剂淬灭减少。

可以使用SiR化合物-核酸复合物的特性，包含荧光信号的存在、位置、强度、激发和发射光谱、荧光偏振、荧光寿命和其它物理性质来对样品的各方面或部分进行检测、区别、分类、定量和/或分析。本公开的化合物与一种或多种另外的试剂(例如，可检测地不同的荧光试剂)任选地结合使用，包含相同类别的具有不同光谱性质的化合物(参见，例如，本文其它地方的发射和近红外染料的偏移的讨论)。

还提供了使用本文公开的SiR化合物对多核苷酸进行测序的方法。本领域的技术人员将认识到在测序方法中可以采用荧光部分的各种方式，例如，作为引物上的标记、链终止核苷酸，如双脱氧核苷酸或可逆终止子核苷酸或二核苷酸(参见，例如，对于可逆终止子核苷酸和二核苷酸的一般性讨论的美国专利第8,017,338号、PCT公开第WO2008/037568号和美国专利第7,476,504号)。可以使用其中在检测之前例如通过如毛细管电泳等电泳分离测序反应产物的测序方法。可替代地，可以使用其中原位检测产物的测序方法(参见例如以上引用的文献)。

活/死细胞测定。某些实施例提供了一种用于对细胞进行染色和/或评估细胞活力的方法、用途或组合物，所述方法、用途或组合物可与例如流式细胞术和荧光显微术的用途相兼容。此类方法和用途可以包括将细胞或细胞的混合物与本文公开的SiR化合物一起温育；提供对细胞或细胞的混合物的刺激以引发荧光信号；以及测量荧光信号。方法和用途可以进一步包括例如通过确定荧光度是否超过预定阈值(指示无活力)或通过将结果分组为活群体和死群体(其中死细胞群体在其膜完整性受损的情况下，显示较大程度的染色)来对活和/或死细胞的量进行定量。

在一些实施例中，本公开的SiR化合物被递送或传递到非活性真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人细胞。当用光源对细胞照明时，可以收集、检测、分析或测量荧光发射。可以用诱导细胞死亡的物质或试剂，例如喜树碱或星状孢菌素对测定中的细胞进行处理。可以使用任何适当的荧光检测设备，如读板仪、荧光显微镜或流式细胞仪获取数据。

在一些实施例中，将细胞或细胞的混合物与至少一种、两种、三种或四种另外的荧光分子一起温育，其中所述至少一种、两种、三种或四种另外的荧光分子与根据本公开的化合物可光谱地区分，并且从所述至少一个、两个、三个或四个另外的荧光分子测量对荧光信号进行了测量。如果发射最大数分开至少30nm，或者如果来自源的荧光可以通过使用光学滤波器，例如，滤波器对来区分，则来自两个源的荧光被视为是可光谱地区分的，其中来自分子中的至少一个分子的荧光通过滤波器中的至少一个滤波器而区别地减小。

在另一个实施例中，可以在多个器皿中含有细胞的情况下执行测定方法。在任何器皿中，细胞可以是一种类型或不同类型的细胞。细胞可以是在不同条件下，例如在不同培养基存在下生长的相同类型。细胞中的一些细胞可以用凋亡诱导剂或半胱天冬酶抑制剂处理。可以由光源，例如扫描光源对多个器皿(阵列)照明。细胞可以是相同或不同的生物。

超分辨率成像和显微术；单分子定位。在一些实施例中，本文描述的化合物用于超分辨率成像或显微镜检查。对于超分辨率成像和显微术的评论，请参见Huang等人,《生物化学年鉴(Annu Rev Biochem)》,2009；78:993–1016；Leung等人,《应用光谱学(AppliedSpectroscopy)》2011；65:967-980；以及Schermelleh等人,《细胞生物学杂志(J.CellBiol.)》2010；190:165-175。在一些实施例中，本文描述的化合物用于单分子定位显微术(例如，活细胞中)。对于单分子定位显微术的详细讨论，请参见Patterson等人,《物理化学年度评论(Annu.Rev.Phys.Chem.)》2010；61:345-367；Qu等人,《美国国家科学院院刊》2004；101:11298-11303；以及Shtengel等人,《美国国家科学院院刊》2009；106:3125-3130。在任何此方法或用途中，在允许用化合物对样品或其所关注的组分进行染色的条件下，可以使样品与本文所述的化合物(例如，其包括靶标结合部分)接触。然后可以根据超分辨率或单分子定位成像或显微术技术对染色的样品进行成像。

染色溶液。在一些实施例中，通过将SiR化合物溶解在染色溶液，例如与样品和预期用途相容的水性溶液或水性混溶性溶液中而制备本公开的SiR化合物以供使用。对于期望最小扰动细胞形态或生理的生物样品，相应地选择染色溶液。对于溶液测定，在一些实施例中，染色溶液不扰动进行评估的靶标材料的天然构象。高浓度的有机溶剂、阳离子和氧化剂通常也会降低荧光，如同浓度≥0.01％的离子型清洁剂十二烷基硫酸钠(SDS)一样。然而，许多染色溶液添加剂不会干扰化合物-核酸复合物的荧光(例如，高达8M的尿素；高达1g/mL的CsCl；高达溶液的50％的甲酰胺；以及高达40％的蔗糖)。本文提供的SiR化合物在缓冲溶液中的稳定性通常比单独在水中高；并且降低游离氧自由基的水平的试剂，如β-巯基乙醇有助于化合物的稳定性。

染色溶液可以通过将本公开的SiR化合物直接溶解在以下中制备：水性溶剂，如水、缓冲溶液，如缓冲盐水(在一些实施例中，对于某种活力区分应用而言为非磷酸盐)、三(羟甲基)甲胺(TRIS)缓冲液(例如，含有EDTA)；或水混溶性有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)；或低级醇，如甲醇或乙醇。可以将SiR化合物预先溶解于浓度大于或等于染色溶液中所使用的浓度的约100倍的有机溶剂(在一些实施例中为100％的DMSO)中，然后用如水或缓冲液等水性溶剂稀释一次或多次，使得SiR化合物以有效量存在。

本公开的SiR化合物的有效量是与靶标材料组合足以得到可检测荧光响应的量。溶液中的SiR化合物浓度必须足以接触样品中的靶标材料并且得到可检测信号，但是太多化合物可能会引起背景荧光的问题。染色溶液的最佳浓度和组合物通过样品的性质(包含物理、生物、生化和生理性质)、SiR化合物-样品相互作用的性质(包含化合物到核酸的位点的传送速率)以及所执行的分析的性质确定，并且可以根据标准程序，如以下实例中描述的那些来确定。

样品类型。SiR化合物与含有或认为含有所关注的生物材料的样品组合，例如细胞(其可以是具体类型)、抗原、细胞组分或核酸。

样品任选地为生物结构(即生物体或生物体的离散单位)或溶液(包含含有生物结构的溶液)或固体或半固体材料。因此，用于实践本公开的样品材料任选地不含溶液，固定在固体或半固体材料中或上，从生物结构中提取(例如从裂解的细胞、组织、生物体或细胞器中)或保持封闭在生物结构中。靶标材料也可以见于细胞的胞质液、细胞的细胞质中，或者可以是细胞外的。为了使靶标与SiR化合物结合，可以在水性环境中提供靶标以接触SiR化合物，即使没有将核酸封闭在生物结构中也是如此。

样品可以是天然的或合成的，并且可以从多种源获得。样品中靶标材料的存在可能是由于自然生物过程，或者成功或不成功的合成或实验方法、不期望的污染或疾病状态的结果。靶标材料对天然源可以是内源性的，或者可以作为外来材料，如通过感染、转染或治疗方法引入。靶标材料可以存在于样本的全部或仅一部分中，并且靶标材料的存在可以用于在单独样品之间进行区分，或区别单个样品内的一部分或区域，或标识样品或样品的特性。

在一些实施例中，含有靶标材料的样品是细胞或水性溶液或水性混溶性溶液，所述水性溶液或水性混溶性溶液从液体源直接获得或作为来自固体材料(有机或无机)的洗涤液或已经引入细胞以用于培养的生长培养基，或已经放置靶标材料以用于评价的缓冲溶液。当靶标材料处于细胞中时，细胞任选地为包含微生物的单个细胞或与二维或三维层中的其它细胞缔合的多个细胞，包含多细胞生物体、胚胎、组织、活检、长丝、生物膜等。可替代地，样品为固体，任选地为通过浸润从液体或蒸气中去除的涂片、刮切或滞留物。在本公开的一个方面，样品从生物流体获得，包含分离的或未经过滤的生物流体，如尿液、脑脊髓液、血液、淋巴液、组织匀浆、间质液、细胞提取物、粘液、唾液、痰液、粪便、生理分泌物或其它类似流体。可替代地，样品从环境源获得，如土壤、水或空气；或从工业源获得，如从废料流、水源、供应管线或制造批料提取。工业源还包含发酵介质，如来自生物反应器或如酿造等食品发酵过程；或食品，如肉类产品、获得产品、生产产品或乳制品。

在靶标材料存在于溶液中的情况下，样品溶液从经纯化的或合成的靶标材料之一到如细胞提取物或匀浆或其它生物流体等粗混合物或来自生物、工业或环境源的稀溶液而变化。在一些情况下，期望的是在与化合物组合之前，将靶标材料与溶液中的其它生物分子或流体的混合物分离。存在许多用于将各种靶标材料，如核酸、多肽、代谢物、寡糖和多糖、脂质以及其组合与通常具有其它生物分子的粗混合物分离以及对各种靶标材料进行纯化的技术。这些技术包含使用各种支撑物或溶液的或流动流中的如色谱技术和电泳技术等手段。可替代地，可以用适当的降解酶(例如，RNase、DNase和/或蛋白酶)对生物分子的混合物进行处理，从而使得非靶标材料降解并且可以更容易地去除。

样品的来源和类型以及SiR化合物的用途将决定哪种化合物特性以及因此哪种SiR化合物对特定样品的染色最有用。在利用持续的高强度照明(例如显微术)检测化合物的荧光的情况下，光漂白速率低于常用化合物(例如荧光素)的SiR化合物是优选的，特别是用于活细胞中。化合物对活体系的相对低的毒性通常使得能够检查活样品中的核酸，而很少或没有化合物自身引起的扰动。在化合物必须穿透细胞膜或凝胶的情况下，更具渗透性的SiR化合物是优选的，但是某些细胞会通过除了跨细胞膜的被动扩散的方式，例如通过吞噬作用或其它类型的摄入而易于占据被示出为对其它细胞不可渗透的化合物。快速且容易渗透细胞的化合物不一定会快速渗透凝胶。在其中在凝胶上对核酸进行染色的应用中，SiR化合物还被选择为具有高结合亲和力(例如，K

另外的试剂。本公开的SiR化合物可以与可单独检测的一种或多种另外的试剂结合使用。如果另外的试剂单独使用，例如，用于对同一样品的不同等分试样进行染色或如果另外的试剂对样品的不同部分或组分进行染色，则所述另外的试剂可以是可单独检测的，而不管所述另外的试剂的信号是否与化合物-核酸复合物的荧光信号是否是可检测地不同的。可替代地，本公开的SiR化合物被选择为得到与期望与SiR化合物组合使用的其它试剂的相响应不同的可检测响应。在一些实施例中，一种或多种另外的试剂是荧光的并且具有与化合物-核酸复合物的光谱性质不同的光谱性质。例如，本文描述的SiR化合物可以与常用的荧光抗体，如用荧光素异硫氰酸盐或藻红蛋白标记的那些抗体组合使用。可以使用任何荧光检测体系(包含视觉检查)来检测具有不同敏感度水平的化合物之间的光谱性质的差异。此类差异包含但不限于激发最大数的差异、发射最大数的差异、荧光寿命的差异，相同激发波长或不同波长下的荧光发射强度的差异、吸收率的差异、荧光偏振的差异、与靶标材料组合的荧光增强的差异或其组合。可检测地不同的化合物任选地为具有不同光谱性质和不同选择性的本公开的SiR化合物之一。在本公开的一个方面，化合物-核酸复合物和另外的检测试剂具有相同或重叠的激发光谱，但是具有显然不同的发射光谱，例如，具有分开了≥10nm、≥20nm或≥50nm的发射最大数。所有荧光试剂的同时激发可能需要激发其波长对于每种试剂单独来说次优，但对于试剂的组合来说最优的样品。可替代地，可以在与用于激发本发明化合物-核酸复合物的波长不同的波长下同时或依次激发一种或多种另外的试剂。

另外的化合物任选地用于根据大小、形状、代谢状态、生理条件、基因型或其它生物参数或其组合来区别例如含有细胞或其组分的生物样品。所述另外的试剂对用于与特定特性的非选择性试剂结合使用的样品的相同特性具有选择性，或者对用于与对样品的一个特性具有选择性的试剂结合使用的样品的另一个特征具有选择性样本。在本公开的一个方面，一种或多种另外的化合物在细胞内代谢，以在某些细胞内而不是其它细胞内得到荧光产物，使得本公开的花青化合物的荧光响应仅在不进行此类代谢过程的情况下占主导。可替代地，一种或多种另外的化合物对细胞的某些外部组分，如细胞表面蛋白或受体，例如荧光凝集素或抗体具有特异性。在本公开的又另一方面，一种或多种另外的化合物主动或被动地跨细胞膜并且用于指示细胞膜的完整性或运作(例如钙黄绿素AM或BCECF AM)。在另一方面，另外的试剂选择性地结合富含AT的核酸并且用于指示染色体显带。在本公开的另一方面，另外的试剂为细胞器染色剂，即对特定细胞器具有选择性的染色剂，例如，可以选择一种或多种另外的试剂，以用于潜在地敏感地摄取到线粒体中(例如罗丹明123或四甲基罗沙明(rosamine))或用于由于活细胞的细胞器中的pH梯度而摄取(例如，Diwu等人,《细胞术(CYTOMETRY)》第7增刊,第77页,摘要426B(1994))。

将另外的化合物添加到待分析的以有效量存在的样品中，化合物的最佳浓度通过本领域通常已知的标准程序确定。每种化合物任选地在单独溶液中制备或在一种溶液中组合，这取决于预期的用途。在以合适的波长对染色的细胞照明之后，如上所述，根据细胞对照明的荧光响应来对其进行分析。另外，差异荧光响应可以用作对细胞或核酸进行分类以用于进一步分析或实验的基础。例如，对“存活”于某种程序的所有细胞进行分类，或者对样品中的某种类型的所有细胞进行分类。细胞可以根据本领域已知的程序，如Mansour等人(1987)的美国专利第4,665,024号中的程序手动地或使用自动化技术进行分类。

7.试剂盒

在另一方面，提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文公开的SiR化合物(其可以是但不一定是本文公开的缀合物)和一种或多种其它试剂。试剂盒中可以提供本文描述的SiR化合物的任何实施例。在一些实施例中，试剂盒中包含以上描述的至少一种另外的试剂与根据本公开的化合物。在某些实施例中，试剂盒进一步包括以下中的一种或多种：缓冲剂、纯化介质或包括样品的小瓶。在一些实施例中，试剂盒进一步包括细胞毒性剂、凋亡诱导剂、细胞、溶剂或干燥剂。试剂盒还可以包含可用于执行本公开方法，例如缀合方法、测定方法或合成方法的试剂。作为后者的实例，可以提供包括乙烯基的化合物与用于执行硫基-烯反应以使具有取代基的化合物衍生化的试剂，或者可以提供包括反应性配体，如本文描述的NHS酯或其它反应性配体的化合物与用于执行亲核取代反应以使具有取代基的化合物衍生化的试剂。在一些实施例中，试剂盒包括有机溶剂和干燥剂中的至少一种。在一些实施例中，溶剂为DMSO。在一些实施例中，试剂盒进一步包括至少一种另外的物质，如溶剂、缓冲液、稳定剂、pH调节剂等。在一些实施例中，试剂盒进一步包括抗褪色剂。

试剂盒还可以包含真核细胞。在一些实施例中，试剂盒可与流式细胞术的使用兼容。在一些实施例中，试剂盒可与荧光显微术的使用兼容。在一些实施例中，试剂盒包括用于将化合物与抗体缀合的试剂。

在一些实施例中，试剂盒中的SiR化合物与抗体缀合，所述抗体可以例如适合用作第二抗体(例如来自如兔或山羊等第一物种的对如人、小鼠或兔等第二物种的抗体具有特异性的抗体，其中第二物质不同于第一物种)。

在一些实施例中，试剂盒可与核酸合成反应，例如，PCR、qPCR或rtPCR等扩增反应或DNA测序的使用兼容。此类试剂盒可以包括NTP或dNTP、聚合酶和一种或多种引物。NTP/dNTP或引物中的至少一种可以用本文公开的化合物标记，或者试剂盒可以进一步包括用本文公开的化合物标记的探针。在一些实施例中，此类标记的探针进一步包括硅罗丹明部分的淬灭剂或能量转移伙伴，例如，所述淬灭剂或能量转移伙伴可以使探针适合用于涉及降解、切割或通过SiR部分改变(例如，增加)荧光的探针的或构象改变的测定，如TaqMan测定或使用分子信标探针的分析。

在某些实施例中，本文公开的试剂盒包括本文描述的化合物中的一种或多种以及用于储存一种或多种化合物的一个或多个容器。试剂盒任选地含有对于如何制备一种或多种化合物或如何制备含有一种或多种SiR化合物的组合物，以及如何施用化合物或含有化合物的组合物的说明书。在某些实施例中，试剂盒包括用于执行本文公开的方法的说明书。在某些实施例中，方法为体内方法。试剂盒可以进一步包括用于递送SiR化合物或含有化合物的组合物的一件或多件设备，包含但不限于注射器、移液器、移液管、刮刀、小瓶、注射器针以及其各种组合。

8.SiR化合物和相关中间体的制备方法

提供了制备式(I)化合物的方法，所述式(I)化合物包含化合物1、1A、1B、1C、2、2A、3、4A、5、6、7、7A、7B、8、9、10A、10B、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59。还提供了制备用于制备式(I)化合物的合成中间体的方法。

对于不同的生物学应用，特别是对于超分辨率成像和细胞内靶向，已经通过修饰氧杂蒽部分合成了许多官能化的SiR染料。然而，氧杂蒽部分的修饰通常导致染料的光物理性质，如吸收和发射波长、量子产率和光稳定性的显著变化。为此，本文提供了一种新的合成策略以在位置10硅处将官能团或反应性基团引入到SiR染料化合物。具体地，在10位置处引入一个或多个乙烯基以形成单乙烯基和双乙烯基SiR染料，所述单乙烯基和双乙烯基SiR染料可以通过硫基-烯反应进一步衍生化以引入官能团或反应性基团。在本文提供的合成方法中，不涉及Si-氧杂蒽酮中间体(参见图2B和2E)。

此外，用于制备SiR衍生物的当前合成方法的大多数都使用极其危险的试剂(例如叔丁基锂、仲丁基锂、亚硫酰氯和6N HCl)，以及需要漫长且费力的合成步骤。相比之下，本文提供的合成方法仅需要两个步骤来制备关键SiR核心结构，然后需要提供连接子的最终硫基-烯反应，所述连接子在本文中被称为“乙基硫丙酸连接子”或“ESP连接子”，其可以利用靶标细胞器的各种配体偶联(参见图2B-2E)。本公开的包括此ESP连接子的SiR化合物具有出乎意料的性质，包含增加的亮度和光稳定性。

此外，与甲基乙烯基-SiR(化合物1)的硫基-烯反应可提供范围为4个到12个原子的不同长度的连接子。荧光基团与靶标配体的接近在设计SiR活细胞荧光探针中很重要。

代表用于制备式(I)化合物的有用前体或合成中间体的式P1a、P1b、P2和P2a如以下示出的。根据此途径的示例性化合物和步骤示出在图2B-E中。

简而言之，在从结尾到开始描述的第一合成途径中，可以由式(P2)化合物和式(P2a)化合物制备式(I)化合物。式(P2a)化合物可以通过已知方法制备。式(P2)化合物可以由式(P1a)化合物和式(P1b)化合物(可以相同或不同)以及SiCl

在一些实施例中，提供了制备式(I)化合物的方法，所述方法包括：使式(P2)化合物

与式(P2a)化合物

在CuBr

在一些实施例中，提供了制备式(P2)化合物的方法：

所述方法包括使式(P1a)化合物

和式(P1b)化合物

与有机锂碱，如丁基锂反应，并且然后与SiCl

某些式(I)化合物的合成途径进一步包括另外的步骤，例如，其中所期望的取代基与导致初始式(I)化合物的步骤不太兼容。

例如，R

可替代地或另外，R

可用于提供各种式(I)化合物的另外的细节和任选步骤在本文其它地方进行了描述，例如附图、实例中以及以上对缀合物、反应性配体、亚磷酰胺、核苷酸和核苷以及用于增加溶解度的部分的描述中。

实例

提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实例1.化合物的制备

向充分干燥的1L三颈圆底烧瓶中添加3-溴-N,N-二甲基苯胺(25g，125.0mmol)。将THF(300mL)转移到烧瓶中。将反应混合物冷却到-78℃，并且将温度保持30分钟。将n-BuLi(59.8mL的含2.3M n-BuLi的己烷中，137mmol)添加到另外的漏斗中，并且在45分钟内逐滴添加到反应混合物中。在同一室温下搅动1小时之后，在-78℃下将甲基乙烯基二氯硅烷(10.61mL，81.2mmol)添加到反应混合物中。去除干冰浴以将温度增加到室温(RT)，并在RT下进一步搅动90分钟。用水淬灭反应混合物，并且使用旋转蒸发仪去除THF的大部分。用EtOAc(150mL)稀释粗产物，并且用EtOAc(2×150mL)进一步提取水层。将经组合的有机层用盐水洗涤，在Na

向75mL的压力器皿中添加3,3'-(甲基(乙烯基)硅烷二基)双(N,N-二甲基苯胺)(3.8g，12.24mmol)、2-羧基苯甲醛(3.67g，24.48mmol)和CuBr

向含有化合物1(400mg，0.91mmol)的250mL石英烧瓶中添加3-巯基丙酸(154mg，1.45mmol)、DMPA(58mg，0.23mmol)和THF(20mL)。将烧瓶与氩气球连接。在RT下，用长波长UV光对反应照明2小时。使用旋转蒸发仪浓缩光解反应混合物。通过硅胶上柱色谱对粗产物进行纯化(CHCl

向含有化合物2(330mg，0.6mmol)的烧瓶中添加DMF(10mL)、三乙胺(252μL，1.81mmol)和TSTU(363mg，1.21mmol)。在RT下将反应混合物搅动1.5小时。使用高真空泵通过旋转蒸发去除溶剂。通过硅胶上柱色谱对粗产物进行纯化(CHCl

向2'-(4-羟氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-双(1H-苯并咪唑)(28mg，66.0μmol)于DMF中的溶液(2mL)中添加K

将含20％TFA的DCM(1.0mL)添加到中间体(14mg，23.5μmol)中，并在RT下搅动15分钟。使用旋转蒸发仪去除溶剂，以得到Boc脱保护的中间体。向化合物2A(12mg，18.6μmol)于DMF(2.0mL)中的溶液中添加DIEA(12mg，93.2μmol)和含Boc脱保护的中间体的DMF(1.0mL)，并且在RT下将反应搅动2小时。使用高真空泵通过旋转蒸发去除溶剂。在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(MeOH/H

由于硅原子上的立体中心和螺内酯化，化合物4可以以两种非对映异构体的混合物形式存在。在Biotage C-18纯化期间，将两种非对映异构体(化合物4B和化合物4C)分离。一种非对映异构体在TLC上比化合物4C运行得更慢，因此在图中将此非对映异构体称为“底部”，并且将化合物4C称为“顶部”。然而，申请人注意到，由于尚未指定两种非对映异构体的配置，因此此命名是任意的。

向化合物2A(200mg，0.31mmol)于DMSO中的溶液(8mL)中添加6-氨基己酸(61mg，0.47mmol)和DIEA(120mg，0.93mmol)于DMSO/H2O(1:1，8mL)的溶液，并且在RT下搅动2小时。在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(MeOH/H

将多西紫杉醇(117mg，0.15mmol)溶解于甲酸(3.0mL)中，搅动20分钟，并且去除溶剂，以得到3'-氨基多西紫杉醇。向中间体(80mg，0.12mmol)、DIEA(73mg，0.61mmol)和PyAOP(95mg，0.18mmol)于DMF(4mL)中的溶液中添加上述含3'-氨基多西紫杉醇的DMF(2mL)。使用高真空泵通过旋转蒸发去除溶剂。通过硅胶上柱色谱对粗产物进行纯化(CHCl

在最终柱色谱纯化期间将化合物5的每种非对映异构体分离。化合物5B在TLC上比化合物5C运行得更慢，因此在图中将此非对映异构体称为“底部”，并且将化合物5C称为“顶部”。但是，尚未指定两个非对映异构体的正确配置。

将(4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-吲哚-3-基)甲基)-10-(4-氨基丁基)-4-(4-羟氧基苯基)-8,13,15,19-四甲基-1-氧杂-5,8,11-三氮杂环壬烷-15-烯-2,6,9,12-四酮2,2,2-三氟乙酸盐

Milroy,Lech-Gustav等人,“活细胞中的静态肌动蛋白的选择性化学成像(Selective Chemical Imaging of Static Actin in Live Cells)”,《美国化学会志》,第134卷,2012年4月4日,第8480-8486页。

根据以下示出的反应方案合成化合物6A。

向2A(100mg，0.155mmol)于DMF中的溶液中(1.5mL)添加氨基-PEG

向中间体(61mg，76.20μmol)、DIEA(41mg，0.32mmol)和PyAOP(50mg，0.095mmol)于DMF中的溶液中(2mL)添加(4R,7R,10S,13S,19S,E)-7-((1H-吲哚-3-基)甲基)-10-(4-氨基丁基)-4-(4-羟氧基苯基)-8,13,15,19-四甲基-1-氧杂-5,8,11-三氮杂环壬烷-15-烯-2,6,9,12-四酮2,2,2-三氟乙酸盐(50mg,63.5μmol)。在RT下将反应混合物搅动30分钟，并且使用高真空泵通过旋转蒸发去除溶剂。在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(MeOH/H

在最终柱色谱纯化期间将化合物6A的每种非对映异构体分离。化合物6A-A在TLC上比化合物6A-B运行得更慢，因此在图中将此非对映异构体称为“ESP-PEG4-A”，并且将化合物6A-B称为“ESP-PEG4-B”。但是，尚未指定所述两个非对映异构体的正确配置。根据以上程序制备含有PEG

化合物6C的合成如以下示出的。

根据用于制备以上描述的化合物6的程序制备含有C6连接子的化合物6C。

向充分干燥的500mL三颈圆底烧瓶中添加3-溴-N,N-二甲基苯胺(6.01g，30.0mmol)和THF(60mL)。将反应混合物冷却到-78℃，并且将温度保持30分钟。使用注射器在5分钟内在-78℃下将n-BuLi(12.0mL的含2.5M n-BuLi的己烷，30.0mmol)逐滴添加到反应混合物中。在同一室温下搅动30分钟之后，在-78℃下将二甲基二氯硅烷(1.51mL，12.5mmol)添加到反应混合物中。去除干冰浴以将温度增加到RT，并在RT下进一步搅动90分钟。用饱和NH

向75mL的压力器皿中添加3,3'-(甲基(乙烯基)硅烷二基)双(N,N-二甲基苯胺)(2.8g，9.38mmol)、2-羧基苯甲醛(4.23g，28.14mmol)和CuBr

向2-(7-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-5,5-二甲基-3,5-二氢二苯并[b,e]西林-10-基)苯甲酸酯(300mg，0.70mmol)于1,2-二氯乙烷(4mL)中的溶液中添加POCl

将叔-丁基哌啶-4-羧酸酯盐酸盐(186mg，0.84mmol)和DCM/MeCN(1:1，14mL)添加到含有以上经酰化的粗产物的烧瓶中。在0℃下向此溶液中添加三乙胺(1.95mL，14.0mmol)，并在RT下进一步搅动15小时。使用旋转蒸发仪去除溶剂。在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(Di-水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)，0％到95％梯度)，以得到酯化合物(287mg)。

将含50％TFA的DCM添加到酯化合物中，并搅动2小时。通过旋转蒸发仪去除挥发性材料，并在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(Di-水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)，0％到95％梯度)，以得到化合物7A(188mg，在3个步骤中为41％)。

在130℃下，将4-[6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H-苯并咪唑基-2-基]-2-苯二胺(50mg，0.16mmol)和4-羟基-3-硝基苯甲醛(39mg，0.23mmol)于AcOH中的溶液(5.0mL)加热3小时。使用旋转蒸发仪去除所述溶剂。通过硅胶上柱色谱对粗产物进行纯化(CHCl

将中间体1(20mg，42.6μmol)、4-(Boc-氨基)丁基溴(14mg，55.4μmol)和K

将中间体2(4.4mg，6.87μmol)于30％TFA中的DCM溶液(1mL)搅动10分钟。使用旋转蒸发仪去除溶剂。向化合物7A(5.0mg，8.7μmol)于DMF中的溶液(1.0mL)中添加PyAOP(5.4mg，10.3μmol)和DIEA(4.4mg，34.3μmol)。在RT下搅动5分钟后，将含脱保护的中间体的DMF(1.0mL)添加到以上溶液中。在RT下将反应混合物搅动2小时。使用高真空泵通过旋转蒸发去除溶剂。在C-18柱上通过Biotage对粗产物进行纯化(Di-水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)，0％到95％梯度)，以得到化合物7B(5.5mg，53％)。

实例2.核染色

为了展示基于化合物2的荧光材料的适用性，通过在ESP染料连接子位点处掺入Hoechst部分合成了活细胞核染料。出乎意料的是，基于化合物2的探针在不牺牲其它期望的性质的情况下极大地提高了荧光基团亮度。

使用荧光显微术将化合物4的荧光强度与SiR-Hoechst(瑞士的Spirochrome公司)进行比较。在37℃下用1μM或2μM下的SiR-Hoechst或化合物4对活Hela细胞进行染色，持续30分钟。在用LCIS缓冲液洗涤以去除过量染料之后，使用荧光显微镜的Cy5通道收集了来自5次重复的图像，并使用HCS Studio软件进行了分析。细胞的代表性图像示出在图3A-3B(用SiR-Hoechst染色)和图3C-3D(用化合物4染色)中。图3E示出了条形图，其将用SiR-Hoechst和化合物4染色的细胞的核信号强度进行了比较。基于对1μM和2μM下的荧光强度的比率进行求平均，平均核信号强度在用化合物4染色的细胞中比用SiR-Hoechst染色的细胞中高48％。

实例3.细胞骨架染色.

为了进一步展示基于化合物2的荧光材料的适用性，也使用靶标配体多西紫杉醇制备了微管蛋白探针。出乎意料的是，基于化合物2的探针在不牺牲其它期望的性质的情况下极大地提高了荧光基团亮度。将化合物5(使用多西紫杉醇作为靶标结合部分的微管蛋白探针)的荧光强度与SiR-紫杉醇进行比较(瑞士的Spirochrome公司)。在37℃下，用0.5μM化合物5或SiR-紫杉醇对活Hela细胞染色30分钟，并且制备活Hela细胞，以用于成像。图像示出在图4A-4B(用化合物5染色)和图4C-4D(用SiR-紫杉醇染色)中。用化合物5染色的细胞示出了与用SiR-紫杉醇染色的细胞相比更亮的信号。

实例4.活细胞和固定细胞中的核染色以及化合物7的光稳定性

SiR衍生物通过非荧光螺内酯与荧光两性离子之间的苯环上的2'-羧基平衡存在。螺内酯形式为实现SiR细胞可渗透性的主要形式。为了制备细胞不渗透的SiR染料，将大体积的仲胺(如哌啶)掺入到2'-羧基中，从而防止螺内脂化，并导致SiR染料始终为荧光的或“发亮(on)”。合成化合物7A，并将其与Hoechst偶联以制备化合物7或与硝基Hoechst偶联以制备化合物7B(图2E)。

将化合物7的荧光强度和光稳定性与TO-PRO-3(具有远红外荧光的固定细胞核酸染色剂)进行了比较。在RT下用1μM化合物7或TO-PRO-3将固定Hela细胞染色30分钟，并制备固定Hela细胞，以用于使用荧光显微镜的Cy5通道进行成像。如图5C中示出的，化合物7染色出乎意料地比图5A中示出的TO-PRO-3染色更亮。如图5D中示出的，在对激发光的1分钟暴露之后，化合物7仍保留了基本荧光，然而TO-PRO-3染色更小，如图5B中示出的。

因为Hoechst染料在蓝色通道中为荧光的，所以可能渗漏到Hoechst缀合的SiR染料的蓝色通道中。将硝基添加到Hoechst部分，产生了化合物7B，在DAPI通道中，渗漏令人惊讶地减少了约50％。另外，Cy5通道中的信号令人惊讶地增加了约12％。

以5k/孔的密度将Hela细胞铺板在96孔板上，并在CO

实例5.化合物10B的光稳定性

将水溶性连接子连接到本公开的SiR化合物增加了其水溶性，这对于抗体标记和其它应用是有用的。与AlexaFluor 647缀合物相比，本公开的水溶性SiR染料和其缀合物是极度光稳定的。

将Hela细胞放置在载玻片上，并在25℃下用50μM的化合物10B或ALEXA FLUOR

实例6.所公开的SiR化合物的荧光特性

确定了溶解于水(仅染料)中的或作为溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的山羊抗小鼠(GAM)IgG缀合物的各种公开的化合物和ALEXA FLUOR

当在溶剂中溶解时对某些化合物进行了测试。执行了三次重复，以确定激发和发射最大数。数据示出于表4中。

实例7.近红外发射SiR亚磷酰胺和标记的多核苷酸

甲硅烷基取代通常得到罗丹明染料朝红色的光谱偏移为75nm。为了合成发射650nm以上的标记的核苷酸和多核苷酸(例如，引物和探针)，将甲硅烷基取代基掺入到二氯罗丹明亚磷酰胺中，以产生化合物51-54。计算的发射最大数示出于下表5中。

使用化合物54-亚磷酰胺和FAM亚磷酰胺的FAM和SiR标记的引物的生成展示在图8中。化合物54(和类似化合物)可以用于自动合成多发色团结构，以用于FRET分析。由化合物59的NHS酯进行的用FAM和SiR部分标记的引物的生成展示在图9中。

实例8.固定细胞染色；抗体缀合

SiR化合物在两性离子(开放)形式与螺(封闭)形式之间平衡存在，如本文中其它地方所述。靶标结合部分与其探针与如固定细胞或抗体等配体的靶标的结合可能更倾向于荧光开放形式，而游离的、未结合的SiR探针可能主要以封闭形式存在，例如通过可逆性疏水性聚集稳定。

给出可以用于不同应用的SiR化合物的途径示出在图10A-10B中。能够对固定细胞进行染色的SiR化合物的制备示出在图10A中。

由于一些SiR染料在不溶解官能团的情况下对于一些用途可能是无法充分水溶解的，因此可以将水溶性连接子与SiR连接，以促进缀合，如抗体标记。示例性增溶取代基为包括聚氧乙烯连接子、反应性配体和用2个磺酸盐取代的苯基的增溶取代基，例如，

还可以通过添加一个或多个磺酸基来提高本文提供的SiR化合物的水溶性。参见例如化合物8。

实例9.取代和缀合对SiR化合物的荧光特性的影响

执行了实验，以使用化合物10A、11、12和13检查不同SiR取代模式对吸收最大数的影响。分别在化合物10A和12中用甲基替代化合物11的乙烯基中的一个或两个。在化合物13中，相对于化合物12将两个环外胺中的每个环外胺上的一个甲基消除。发现当每个乙烯基变为甲基时，吸收最大数向蓝色偏移约5nm。当两个环外胺中的每个环外胺上的一个甲基被消除时，观察到30nm的偏移(表6)。因此，使用通过Si与SiR部分连接的基团对SiR染料进行修饰的作用小于去除甲基的作用。

将SiR，在此实施例中为化合物8、10A和12与IgG的缀合对吸光度(示出在图11A中)和对发射(示出在图11B中)的最大数的影响与IgG-AF647的进行了比较。与AF647缀合物相比，SiR缀合物(665nm/690nm)的吸收和发射最大数红移了大约20nm。发射最大数向红色偏移了15nm。当使用Cy5滤波器时，此偏移导致的信号比AF647少。

以7.5k/孔的密度将Hela细胞铺板在96孔板中，并且在CO

使用荧光显微术将SiR缀合物、化合物10A(DOL＝15)和化合物10A(DOL＝10)的荧光强度与AF647缀合物进行比较，其中DOL为标记的程度。在25℃下用与AF647缀合的小鼠抗微管蛋白(示出在图12A所示)或与化合物10A缀合的小鼠抗微管蛋白(图12B中示出为DOL＝15)以递增浓度对活小鼠细胞进行染色，持续60分钟。在用PBS缓冲液洗涤以去除过量染料后，使用荧光显微镜的Cy5通道收集图像并使用集成软件度图像进行分析。细胞的图像示出在图12A-12B中。图12C示出了将荧光与标记的第二试剂的浓度进行比较的图。与Cy5通道中的AF647相比，SiR染料使图像暗淡6-8倍，与上面讨论的偏移最大数一致。SiR染料缀合物示出了良好的靶标特异性，并且未观察到脱靶或背景荧光。成像期间观察到很少光学漂白或未观察到光学漂白。

将由化合物13和14(图1G中示出的结构)制备的SiR-山羊抗小鼠(GAM)缀合物的荧光强度和光稳定性与AF647进行了比较。

以5,000个细胞每孔的密度将A549细胞铺板在Greiner 96孔板上，并允许其粘附过夜。第二天，在37℃下用50μM依托泊苷将其处理两小时，以诱导pH2AX的磷酰化以用于抗体探测，然后在室温下固定在于PBS中制备的4％PFA中，持续20分钟。固定之后，将细胞在PBS中冲洗3次，并用于PBS中制备的0.1％Triton X-100进行透化，持续20分钟。Triton处理后，将细胞在PBS中洗涤3次，并且放置在用含3％BSA的PBS制成的封闭溶液中。在室温下或在4℃下持续一小时，以5μg/mL用在封闭溶液中制备的第一抗体对每个板进行处理。在与第一抗体一起温育之后，在PBS中将细胞洗涤3次，并保存在封闭溶液中，然后再用第二抗体进行探测。从5μg/mL的封闭溶液中制备用化合物13(DOL 4.7)、化合物14(DOL4.0)或AF647(DOL 4.9)标记的第二抗体，并且在室温下将细胞温育一小时，然后在PBS中洗涤3次，并且将板移动到CX-5CellInsight，以用于对信号进行定量。在超过700秒的时间段内每秒收集一次荧光信号数据。在Prism中进行了数据分析/制图。

在暴露于激发光约12分钟的时间段内，对在未安装抗褪色介质的样品中的荧光强度进行了监测。如图13中示出的，与AF647相比，化合物13和14两者在整个时间过程中均对光学漂白更具耐性。

实例10.近红外荧光SiR染料

合成了近红外荧光SiR染料，包含化合物18、20、22、24和26(示出在图1I中)、化合物28、29、30、31和32(示出在图1J中)、化合物45和46(示出在图1M中)以及化合物47、48、49和50(示出在图1N中)，并且测试了其发射最大数。发现发射最大数相对于化合物，如化合物1朝红色波长偏移。

实例11.核酸分析

在多核苷酸合成反应中使用了SiR-亚磷酰胺化合物，如化合物51-54，以提供荧光标记的引物和探针。在扩增和测序反应中使用了引物和探针，以提供对反应产物的标记和/或检测。

可以在使用固体支撑物合成的多核苷酸的化学自动合成中使用化合物51-54，以提供荧光标记的引物和探针。

可以通过毛细管电泳来分辨测序反应产物，并对其进行检测。

可以使用双标记的探针(例如，包括能量转移伙伴，例如淬灭剂，如TaqMan

实例12.用ESP-SiR异构体进行的核染色

为了展示基于化合物2(乙基磺丙基-硅罗丹明，ESP-SiR)的荧光材料的不同非对映异构体的适用性，通过在ESP-SiR染料连接子位点处掺入Hoechst部分合成了活细胞核染料。出乎意料的是，使用两种异构体之一(化合物4B)制备的探针在不牺牲其它期望的性质的情况下大大提高了荧光基团亮度。

使用荧光显微术对化合物4(化合物4B和化合物4C)的每种异构体的荧光强度进行了比较。使用了DMSO储备溶液(1mM)，以在含有丙磺舒的PBS中将每种异构体的溶液制备成最终浓度5、2.5、1.25和0.6μM。

在37℃下用每种浓度的异构体对活Hela细胞或A549细胞进行染色，持续30分钟。在用LCIS缓冲液洗涤以去除过量染料之后，使用荧光显微镜的Cy5通道收集了来自5次重复的图像，并使用HCS Studio软件进行了分析。图14示出了用化合物4B和4C染色的细胞的核信号强度。在测试的浓度中的每种浓度下，用化合物4B染色的两种细胞类型中的平均核信号强度比用化合物4C染色的细胞高几乎2倍。

使用荧光显微术将化合物4B和4C的荧光强度与SiR-Hoechst(瑞士的Spirochrome公司)进行比较。在37℃下用1μM下的SiR-Hoechst或化合物4B或4C对活Hela细胞进行染色，持续30分钟。在用LCIS缓冲液洗涤以去除过量染料之后，使用荧光显微镜的Cy5通道和DAPI通道收集了来自5次重复的图像，并使用HCS Studio软件进行了分析。图15示出了条形图，其将用SiR-Hoechst与化合物4B和4C染色的细胞的核信号强度进行了比较。在Cy5通道上，化合物4B展现出与来自Spirochrome(瑞士)的SiR染料更高的信号强度，然而在所有三种化合物的DAPI通道上几乎没有观察到信号。

实例13.用ESP-SiR异构体进行的微管蛋白染色

为了进一步展示基于化合物2的荧光材料的适用性，也使用靶标配体多西紫杉醇制备了微管蛋白探针(化合物5)。出乎意料的是，使用化合物2的非对映异构体之一制备的探针(化合物5A)在不牺牲其它期望的性质的情况下大大提高了荧光基团亮度。将化合物5的两个非对映异构体和两种异构体的混合物的荧光强度与SiR-紫杉醇进行了比较(瑞士的Spirochrome公司)。在37℃下，用0.5μM的每种化合物对活Hela细胞染色30分钟，并且制备活Hela细胞，以用于成像。图16示出了条形图，其将所测试的每种化合物和非对映异构体的混合物的信号强度进行了比较。与化合物5B(TLC上的紫杉醇-红(Taxol-Red)(A)顶部斑点)、A和B的混合物以及来自Spirochrome公司的SiR-紫杉醇化合物相比，化合物5A(紫杉醇-红(B))；TLC上的底部斑点对微管蛋白具有更好的结合性。

实例14.连接子对ESP-SiR异构体的细胞染色的影响

为了进一步展示基于化合物2的荧光材料的性能，使用环肽作为靶标结合部分合成了肌动蛋白探针。出乎意料的是，基于化合物2的探针(化合物6)在不牺牲其它期望的性质的情况下极大地提高了荧光基团亮度。将化合物6的荧光强度与SiR-肌动蛋白(瑞士的Spirochrome公司)进行了比较。

对化合物6的衍生物进行了测试，以比较连接子类型对细胞染色功效的影响。将包含PEG

还测试了化合物6-PEG