治疗或诊断TNF相关炎性疾病的TNF靶向适配体及其用途

摘要

本公开涉及与肿瘤坏死因子α(TNF)结合的核酸适配体。本公开进一步提供包含这些抗TNF适配体的医药组合物，以及将其用于治疗和诊断应用的方法，例如，减轻肝损伤和于体内或体外监测TNF的存在。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张于2018年4月20日提交的美国临时申请62/660,324 的权益，其整体内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开涉及用于治疗肿瘤坏死因子α(TNFα)相关炎性疾病的核酸适配体，以及将其用于治疗和诊断应用的方法。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNFα或TNF)是参与炎症的细胞因子。它主要由活化的巨噬细胞和其它如淋巴细胞、中性粒细胞和NK细胞的免疫细胞分泌。TNF在生理条件下形成同源三聚体，并与其受体TNFR1或 TNFR2结合以触发下游NF-κB、MAPK或死亡信号传导途径，其调节细胞增殖、分化或凋亡。TNF在几乎所有类型的炎性相关疾病中起作用，并且失调的TNF分泌引起包括类风湿性关节炎、牛皮癣、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、神经退行性疾病、肝损伤和癌症的疾病。

然而，直接对抗TNF的抗体可诱导对抗例如枯否细胞(Kupffer cell) 和多形核白细胞等表达膜结合性TNF的细胞的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，且未有用于TNF浓度的常规预测标记或用于在体内检测TNF的诊断工具。此外，如抗体的蛋白质类药物需要基于细胞的生产系统，其通常昂贵且具有批次间的变化。

因此，开发用于靶向和检测TNF的非蛋白质类试剂是非常有意义的。

发明内容

本公开基于抗TNFα(即抗TNF)核酸适配体的开发，其在体外抑制TNF信号传导并减弱体内TNF介导的急性肝损伤。

因此，本公开的一个方面的特征在于结合TNF且中和TNF活性的核酸适配体(抗TNF适配体)。本公开的任何核酸适配体的长度可以长达200个核苷酸(nts)。例如，抗TNF核酸适配体可以由40至100 个核苷酸组成。

在一些具体实施例中，核酸适配体包含具有 5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’ (SEQ ID NO：1)核苷酸序列的核酸基序(motif)。此抗TNF适配体可以包含与SEQ ID NO：1至少85％一致(例如，至少90％、至少95％或更高)的核酸序列。在一实施例中，核酸适配体包含SEQ ID NO：1 的核酸序列。在另一实施例中，核酸适配体由SEQ IDNO：1的核酸序列所组成。

在一些具体实施例中，核酸适配体与聚乙二醇(PEG)部分(moiety) 缀合(例如，分子量为约15至40kDa的PEG部分)。

在一些具体实施例中，核酸适配体呈现含有两个核酸适配体复制物(copies)的二聚体形式。在一些具体实施例中，PEG部分链结该两个核酸适配体复制物。

在一些具体实施例中，核酸适配体与可检测标记缀合。

本公开另一方面的特征在于医药组合物，其包含本文所述的任何抗TNF适配体和药学上可接受的载体。

在另一方面，本公开提供用于抑制个体中TNF活性的方法，其包括向有此需要的个体施用有效量的本文所述的任何核酸适配体。在一些具体实施例中，该个体为患有由TNFα介导的疾病、疑似患有由TNFα介导的疾病、或有由TNFα介导的疾病风险的人类患者(例如，类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩病、急性肝损伤、急性肺损伤(ALI)、急性肺衰竭、全身性炎症反应综合征(SIRS)相关性脑病、急性呼吸窘迫综合征、干眼症、眼色素层炎、急性胰腺炎、急性肾小球损伤、急性肾功能衰竭、ANCA相关性血管炎或急性脑病)。在一些具体实施例中，个体已接受或正在进行涉及TNF拮抗剂的治疗。在一些具体实施例中，个体处于疾病的急性期。

在另一方面，本公开提供一种减轻肝损伤或促进肝再生的方法，包括将有效量的本文所述的任何核酸适配体施用至有需要的个体。在一些具体实施例中，该个体具有与肝脏疾病相关的肝损伤(例如，肝炎、肝硬化、肝纤维化、脂肪肝病、肝癌或急性肝损伤)。在一些具体实施例中，所施用的核酸适配体的量足以降低个体中血清天冬氨酸转氨酶(AST)的水平(level)、血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平或两者皆有。在一些具体实施例中，所施用的核酸适配体的量足以减少中性粒细胞浸润至个体的肝脏中。

在本文公开的任何方法中，核酸适配体可以气管内的方式施用于需要治疗的个体。在一些具体实施例中，适配体可以通过吸入或皮下注射施用。

此外，本公开提供用于检测样品中TNF存在的方法，该方法包括将本文所述与可检测标记缀合的抗TNF核酸适配体与疑似含有TNF 的生物样品接触，以及检查核酸适配体与样品中TNF的结合。

在另一方面，本公开提供一种体内监测肿瘤坏死因子α(TNF)的方法，该方法包括向有此需要的个体施用有效量的与可检测标记缀合的抗TNF核酸适配体，以及基于可检测标记所释放的信号检测核酸适配体的位置。在一些具体实施例中，个体是患有或疑似患有肝脏疾病的人类患者。在一些具体实施例中，检测步骤通过测量位于人类患者肝脏处的可检测标记所释放的信号水平来进行。

在下面的描述中阐述了本公开的一个或多个具体实施例的细节。从以下附图和若干实施例的详细描述以及所附权利要求书，本公开的其它特征或优点将显而易见。

附图说明

图1是显示aptTNF-α和/或aptTNF-α-PEG可用于在急性损伤阶段抑制TNF-α介导的细胞凋亡而不影响组织修复阶段的增殖信号传导的示意图。

图2A至图2G包括显示aptTNF-α以高亲和力结合人类TNFα，并且可以用作体内监测TNFα的分子成像探针的数据。图2A：示例性 aptTNF-α的结构。该aptTNF-α包含SEQ ID NO：1。图2B：aptTNF-α和人类TNFα的解离常数的图表(左图)和显示aptTNF-α与人和小鼠TNFα结合的图表(n＝3，右图)。图2C：显示在有ALI和没有ALI 的小鼠体内检测aptTNF-α信号的照片(n＝3)。图2D：量化图2C中的aptTNF-α信号的图表。图2E：显示在适配体施用后4小时(n＝3)，

图3A至图3C包括显示aptTNF-α-PEG对TNFα途径的抑制持续时间短于抗TNFα抗体的数据。图3A：示例性二聚体aptTNF-α-PEG 的示意图，该aptTNF-α适配体含有两个SEQ IDNO：1复制物。图3B：显示aptTNF-α-PEG与小鼠TNFα(n＝3)结合的图表。图3C：显示在经TNFα处理之后的4小时后(上图)和24小时后(下图)，通过 TNF-α/NF-kB报告基因测定确认aptTNF-α、aptTNF-α-PEG和抗TNFα抗体的抑制作用的图(n＝3)。

图4A至图4J包括显示通过气管内(i.t.)或静脉内(i.v.)递送 aptTNF-α和aptTNF-α-PEG以抑制LPS诱导的ALI的数据。图4A：显示气管内或静脉内施用aptTNF-α-PEG对血氧饱和度水平影响的图表。图4B：显示气管内或静脉内施用aptTNF-α-PEG对经体重标准化的湿肺重量影响的图表。图4C：显示肺组织的苏木精及曙红(hematoxylin and eosin，H&E)和中性粒细胞染色的一系列照片。图4D：显示气管内或静脉内施用aptTNF-α-PEG对肺损伤评分影响的图表。图4E：显示气管内或静脉内施用不同浓度的aptTNF-α-PEG对支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白质影响的图表。图4F：显示气管内或静脉内施用不同浓度的aptTNF-α-PEG对BALF中总细胞数影响的图表。图4G：显示气管内或静脉内施用不同浓度的aptTNF-α-PEG对BALF中的骨髓过氧化酶(MPO)活性影响的图表。图4H至图4J：显示肺组织中指定的细胞因子/趋化因子表达水平的一系列图。图4A至图4J包括来自不同处理组(n＝6)的数据。处理剂量表示为μg/kg。

图5A至图5G包括显示aptTNF-α和aptTNF-α-PEG减弱 D-GalN/TNFα诱导的急性肝损伤程度并加强早期肝再生的数据。图5A：一系列照片显示aptTNF-PEG缀合物挽救了由TNF和D-GalN诱导的肝组织中严重的肝细胞死亡和出血(H&E染色)，以及经aptTNF-α-PEG 处理抑制了中性粒细胞浸润(中性粒细胞染色)。图5B：显示与NAC 相比，aptTNF-α和aptTNF-α-PEG对降低由D-GalN和TNF诱导的AST 血清水平具优异作用的图表。图5C：显示aptTNF和aptTNF-α-PEG处理显著抑制急性肝损伤小鼠模型中TNF和D-GalN诱导的ALT血清水平的图表。图5D至图5F：一系列图表显示促炎性细胞因子(IL1β、IL6) 和中性粒细胞募集趋化因子(CXCL2)的表达水平经TNF和D-GalN 注射而增加，并且经aptTNF-α或aptTNF-α-PEG处理而降低。图5G：显示急性肝损伤小鼠模型中，aptTNF-α或aptTNF-α-PEG处理增加 PCNA蛋白表达并促进肝再生的照片。图5A至图5G包括来自不同处理组(n＝6)的肝组织的数据。处理剂量表示为μg/kg。

图6是显示aptTNF-α或aptTNF-α-PEG抑制肝组织中半胱天冬酶 3(caspase-3)活化的照片。

图7是一系列图表，显示巨噬细胞募集趋化因子(CCL2)及中性粒细胞募集趋化因子(IL23和IL17)的表达水平通过TNFα和D-GalN 注射而增加并通过aptTNF-α-PEG处理而降低。

图8是一系列图表，显示急性肝损伤小鼠模型中，aptTNF-α和 aptTNF-α-PEG处理增加细胞周期蛋白d1(CCND1)和PCNA mRNA 表达并促进肝再生。

图9A至图9C包括显示aptTNF-α可用作体内监测肝脏TNFα的诊断剂的数据。图9A：一系列照片显示

具体实施方式

本公开部分基于抗TNF核酸适配体(aptTNF)及其PEG缀合物的开发，其对于抑制TNF信号传导和于体内减轻TNF介导的急性肝损伤显示出优异的效果。例如，示例性适配体(例如，aptTNF或 aptTNF-PEG)被发现其对于体外抑制TNF信号传导而言与抗TNF抗体一样有效或优于抗TNF抗体。此外，从急性肝损伤的动物模型获得的结果显示，对于降低血清氨基转移酶的水平而言，示例性抗TNF适配体显示出与N-乙酰半胱氨酸(一种常用的急性肝损伤治疗剂)相似或更有效的治疗效果，其导致浸润到肝脏的中性粒细胞的减少并促进肝再生。因此，如本文所述的抗TNF适配体可用于减轻炎症、减少肝损伤和/或促进肝再生，从而有效治疗由TNF介导的疾病，例如肝脏疾病。抗TNF适配体也在急性肺损伤的小鼠模型中显示出组织保护作用和全身性抗炎作用。此外，鉴于对TNF的结合亲和力，任何抗TNF 适配体也可用作诊断试剂，用于在体外或体内检测TNF的存在和/或水平。TNF的存在和/或水平可以作为与TNF信号传导相关的炎性病症和癌症相关的生物标志物(biomarker)。

因此，本文描述了抗TNF适配体、包含其的医药组合物，以及将其用于治疗和/或诊断目的的方法。

抗TNF适体

本文描述的是与TNF结合并抑制TNF介导的信号传导的核酸适配体(抗TNF适配体)，其如所预期的将减少炎症。如本文所用的核酸适配体是指对特定靶分子(TNF，例如人类TNF)具有结合活性的核酸分子(DNA或RNA)。适配体可以通过与TNF分子结合来阻断TNF介导的信号传导。本公开的抗TNF适配体，呈线性或环状形式，可以是RNA、DNA(例如，单链DNA)、经修饰的核酸或其混合物。抗TNF 适配体可以是非天然存在的分子(例如，含有不存在于天然基因中的核苷酸序列或含有天然不存在的经修饰核苷酸)。替代地或另外地，抗TNF适配体可不含有编码功能肽的核苷酸序列。

TNF，指肿瘤坏死因子(也称为肿瘤坏死因子α、TNFα、恶病毒素(cachexin)或恶病质素(cachectin))，是一种与炎症有关的细胞因子。它主要由活化的巨噬细胞产生，但也可以由其它细胞类型产生，包括中性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞。在人类中，TNF由TNFA基因编码，示例性人类TNF序列以GenBank登录号NP_000585.2提供。

本文公开的抗TNF核酸适配体可包含与 5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’ (SEQ ID NO：1)至少85％(例如，90％、95％或98％)一致的核苷酸序列。

两种核酸的“相似性百分比”使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877所改进的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法确定。这些算法被并入 Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST 程序(2.0版)中。可以用NBLAST程序，得分(score)＝100，12 字长(wordlength)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本公开的核酸分子同源的核苷酸序列。当两个序列之间存在空位(gap)时，可以使用Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述的 Gapped BLAST程序。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

在其它具体实施例中，与 5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列相比，本文所述的抗TNF适配体可含有最多5个(例如，最多5、4、3、2或1个)核苷酸变异。如图2A 所示，SEQ ID NO：1的某些部分形成双链体结构。在一些情况下，任何双链体区段中的一个或多个碱基对所涉及的核苷酸可以用不同的碱基对转换或替换。这些变体将保持与图2A中所示的SEQ ID NO：1相同的二级结构，并保持所有的环结构/序列。

本文公开的任何抗TNF适配体可含有至多200个核苷酸(nts)，例如150nts、100nts、80nts、70nts、60nts、50nts、40nts或30nts。在一些实施例中，抗TNF适配体可含有范围为30至150nts、30至100 nts、30至80nts、30至70nts、30至60nts、30至50nts或30至40nts 的核苷酸。

抗TNF适配体可以特异性结合人类TNF。或者，适配体可以结合来自不同物种(例如人类和小鼠)的TNF分子。当与TNF结合时，此适配体可以阻断TNF介导的细胞信号传导至少20％(例如，40％、50％、 80％、100％、2倍、5倍、10倍、100倍或1,000倍)。TNF适配体对TNF介导的信号传导的抑制活性可以通过常规测定和/或以下实施例中描述的那些测定而确认。

于一些具体实施例中，本文所述的抗TNF适配体可含有非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键结(骨架(backbones))。此经修饰的寡核苷酸赋予所需的性质，例如增强的细胞摄取、对靶核酸改善的亲和力和增加的体内稳定性。

于一实施例中，本文所述的适配体具有经修饰的骨架，包括保留磷原子者(参见例如，美国专利第3,687,808号、第4,469,863号、第 5,321,131号、第5,399,676号和第5,625,050号)和不具有磷原子者(参见例如，美国专利第5,034,506号、第5,166,315号和第5,792,608号)。含磷的经修饰骨架实例包括但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯(包括3'-亚烷基磷酸酯、5'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯)、次磷酸酯 (phosphinates)、磷酰胺(phosphoramidates)(包括3'-氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺)、硫代磷酰胺、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯，具有3'-5'链结，或2'-5'链结。这些骨架还包括具有反极性的骨架，即3'至3'、5'至5'或2'至2'链结。不含磷原子的经修饰骨架由短链烷基或环烷基核苷间链结，混合杂原子和烷基或环烷基核苷间链结，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间链结而形成。这些骨架包括具有吗啉代链结的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰骨架；含有骨架的烯烃；氨基磺酸骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH

在另一实施例中，本文描述的适配体包括一个或多个经取代的糖部分。这些经取代的糖部分可以包括在其2'位置的下列基团之一：OH； F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S- 炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。它们还可以在它们的2'位置上包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的硅基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效动力学特性的基团。优选的经取代的糖部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基氨基氧基乙氧基和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基的部分。参见Martin等人(1995)Helv.Chim.Acta，78，486-504。

替代地或另外地，本文所述的适配体包括一种或多种经修饰的天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰的核碱基包括如下列所述者：美国专利第3,687,808号；《简明高分子科学与工程百科全书》，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编辑，John Wiley &Sons，1990年；Englisch等人，Angewandte Chemie，国际版，1991 年，30，613；以及Sanghvi,Y.S.，第15章，《反义研究和应用》，第 289-302页，CRC出版社，1993年。其中某些核碱基特别有用于增加适配体分子与其靶向位点的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6- 氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6经取代的嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、 5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi等人编辑，《反义研究与应用》，CRC出版社，BocaRaton，1993年，第276-278页。

本文所述的任何适配体可通过常规方法制备，例如化学合成或体外转录。它们如本文所述的预期生物活性可以通过如以下实施例中所描述者来验证。用于表达任何抗TNF适配体的载体也在本公开的范围内。

本文所述的任何适配体可通过共价键、非共价键或两者，与一个或多个聚醚部分(例如聚乙二醇(PEG)部分)缀合。因此，在一些具体实施例中，本文描述的适配体是聚乙二醇化的。本公开并不意味着限制特定分子量的PEG部分。在一些具体实施例中，聚乙二醇部分的分子量范围为5kDa至100kDa、10kDa至80kDa、20kDa至70kDa、 20kDa至60kDa、20kDa至50kDa、10kDa至40kDa、10kDa至30 kDa、15kDa至40kDa、15kDa至30kDa、15kDa至35kDa、15kDa至25kDa、20kDa至40kDa、20kDa至35kDa、或20kDa至30kDa。在一些实施例中，PEG部分具有20kDa的分子量。与本文所述的抗 TNF适配体缀合的PEG部分可以是直链或支链的。它可以与核酸适配体的5'末端、适配体的3'末端或两者缀合。需要时，PEG部分可以共价缀合到核酸适配体的3'末端。预期PEG缀合会延长核酸适配体的半衰期。

用于将PEG部分与核酸缀合的方法是本领域已知的，并且先前已描述于如在PCT公开WO 2009/073820 A2中，其相关教导通过引用而并入本文。应当理解，经PEG缀合的核酸适配体和用于将PEG缀合至本文所述的核酸适配体的方法是示例性的，并不意味着限制。

在一些情况下，核酸适配体可以与一个或多个N-乙酰基葡糖胺 (GalNAc)部分缀合，以促进组织特异性递送(例如，肝脏递送)。

抗TNF核酸适配体可以呈现多聚体形式，例如，二聚体形式。在一些具体实施例中，抗TNF适配体二聚体可以包含通过合适的聚合物部分链结的两种抗TNF适配体，所述聚合物部分可以是如本文所述的 PEG部分。二聚抗TNF适配体的非限制性实例显示于图3A中。二聚体中的两个适配体中的一个或两个可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。两个抗TNF适配体可以相同或不同。例如，抗TNF适配体中的一个或两个可以包含SEQ ID NO：1。在一些具体实施例中，抗TNF 核酸适配体是抗TNF适配体二聚体，其中具有SEQ ID NO：1的两个适配体通过PEG连接。

本文描述的任何抗TNF适配体可化学合成。适配体可用官能团操作，以与用于治疗目的的药物缀合，或者与用于体内或体外诊断目的的可检测标记(例如，成像剂，如造影剂)缀合。如本文所用，“缀合的”或“附接的”意指两个实体是缔合的，优选具有足够的亲和力，从而实现两个实体之间的缔合的治疗/诊断益处。两个实体之间的缔合可以是直接的或通过连接基(linker)，例如聚合物连接基。缀合的或附接的可以包括共价或非共价链结以及其它形式的缔合，例如一个实体在另一个之上或之内，或者在第三实体之上或之内的任一个或两个实体的包埋(entrapment)，例如胶束(micelle)。

在一个实施例中，如本文所述的抗TNF适配体附接于可检测标记，该标记是能够直接或间接释放可检测信号的化合物，使得可以在体外或体内检测、测量和/或鉴定适配体。这些“可检测标记”的实例旨在包括但不限于，荧光标记、化学发光标记、比色标记、酶标记、放射性同位素和亲和标记，例如生物素。这些标记可以直接或间接通过常规方法与适配体缀合。

在一些具体实施例中，可检测标记是适合于对由TNF介导的疾病成像的药剂，其可以是放射性分子、放射性药物或氧化铁颗粒。适用于体内成像的放射性分子包括但不限于，

不受特定理论的束缚，本文所述的抗TNF适配体可赋予至少以下益处。第一，抗TNF适配体是小尺寸分子(例如，具有约14kDa的分子量)，其可以穿透血脑屏障(BBB)并且有用于治疗神经退行性疾病。第二，制造抗TNF适配体不需要基于细胞的系统，并且具有成本效益。第三，与蛋白质类的治疗剂(例如单克隆抗体)相比，抗TNF适配体在体内具有更短的半衰期。因此，抗TNF适配体可能更适合用于治疗急性炎症疾病，因为预期它们会阻断急性期TNF信号传导而不影响对抗感染的长期先天性免疫。

医药组合物

可以将如本文所述的一种或多种抗TNF适配体(单体或多聚体，如二聚体)或其PEG缀合物与药学上可接受的载体(赋形剂)混合，以形成用于治疗目标疾病的医药组合物。“可接受的”是指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)，并且对待治疗的个体无害。包含缓冲剂的药学上可接受的赋形剂(载体)，其是本领域熟知的。参见，例如，《雷明顿：药学技术与实践(第二十版)》， (2000年)，Lippincott Williams和Wilkins，K.E.Hoover编辑。

用于本公开方法的医药组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，并呈冻干制剂或水溶液的形式。参见，例如，《雷明顿：药学技术与实践(第二十版)》(2000年)，Lippincott Williams和Wilkins， K.E.Hoover编辑。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基芐基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或芐醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如 TWEEN

在一些实施例中，本文所述的医药组合物包括含有TNF结合适配体(或用于产生适配体的载体)的脂质体，其可通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等人(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688； Hwang等人(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。具有增强循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE) 的脂质组合物而产生。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所希望直径的脂质体。

如本文所述的抗TNF适配体也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术是本领域已知的，参见例如《雷明顿：药学技术与实践(第二十版)》，MackPublishing(2000)。

在其它实施例中，本文所述的医药组合物可以配制成缓释形式。缓释制剂的合适实例包括含有TNF结合适配体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7-乙基-L- 谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT

用于体内施用的医药组合物必须是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜过滤而轻易地实现。可将治疗性TNF结合适配体组合物置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

本文所述的医药组合物可以是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或用于口服、肠胃外或直肠给药的栓剂，或通过吸入或吹入给药。

为了制备固体组合物如片剂，可以将主要活性成分与药物载体(例如常规压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其它药物稀释剂(例如水)混合，以形成含有本公开化合物或其药学上可接受的无毒盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当将这些预制剂组合物称为均匀时，意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物再分成上述类型的单位剂型，其含有0.1至约500mg本公开的活性成分。新组合物的片剂或丸剂可被包覆或以其它方式混合，以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂型和外剂型组分，后者在前者上形成包衣。这两种组分可以通过肠溶层(enteric layer) 分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这些肠溶层或包衣，这些材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。

合适的表面活性剂特别包括非离子试剂，例如聚氧乙烯山梨糖醇(例如Tween

合适的乳液可使用市售的脂肪乳液制备，例如Intralipid

乳液组合物可以是通过将抗TNF适配体与Intralipid

用于吸入或吹入的医药组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些具体实施例中，该组合物通过口服或鼻腔呼吸途径施用，用于局部或全身作用。

优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体进行雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、帐篷或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以适当方式从装置递送制剂而施用，优选为口服或经鼻施用。

治疗和诊断应用

TNF在几乎所有类型的炎症相关疾病中起作用，并且失调的TNF 分泌引起诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、神经退行性疾病、急性肺损伤(或急性肺衰竭)、急性肝损伤、成人呼吸窘迫综合征和癌症等疾病。因此，调节TNF介导的信号传导和/或检测TNF的存在/水平可以有效地治疗或诊断TNF介导的疾病。

如本文所述的任何抗TNF适配体或其PEG缀合物可用于治疗和诊断用途。例如，抗TNF适配体可用于抑制TNF介导的信号传导，从而有效治疗由TNF介导的疾病，包括类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩病、哮喘、全身性炎症反应综合征(SIRS)相关性脑病、肝脏疾病(如急性肝损伤)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、干眼症、眼色素层炎、急性胰腺炎、急性肾小球损伤、急性肾功能衰竭、ANCA相关性血管炎或急性脑病。

急性肝功能衰竭(ALF)或急性肝损伤是一种罕见但危及生命的疾病，其中大多数肝细胞在先前未存在肝脏疾病的情况下经历细胞死亡(Bernal等人，N.Engl.J.Med.2013；369:2525-34)。随着ALF的进展，其它组织(包括心血管、呼吸、肾脏、中枢神经、血液系统)的功能障碍将很快发生。在肝移植之前唯一可用的ALF治疗是静脉输注N-乙酰半胱氨酸(NAC)(Mumtaz等人，Hepatol.Int.2009；3(4): 563-70；Sales等人，Ann.Hepatol.2013；12(1):6-10)。然而，NAC显示对患有晚期脑水肿的ALF患者没有益处(Lee等人，Gastroenterology 2009；137:856-64)。因此，临床的替代选择仍然是ALF患者(特别是脑病)和没有肝移植设施的中心所未满足的需求。

ALF背后的潜在机制包括肝细胞和不同类型的免疫细胞之间的相互作用(Possamai等人，J.Hepatol.2014；61(2):439-45)。一旦肝细胞经历细胞死亡，所释放的危险相关分子模式(DAMP)将活化常驻的中性粒细胞和肝巨噬细胞(枯否细胞)。经活化的枯否细胞将分泌肿瘤坏死因子(TNF)和趋化因子，以将更多的单核细胞和中性粒细胞募集到受损的肝组织中，从而加重肝细胞中的死亡信号传导(Krenkel等人，2014；3(6):331-43；Bantel等人，Front Physiol.2012；3:79)。此外，TNF将影响血脑屏障通透性，引起神经炎症，并引发脑水肿和脑病(Lv等人，Liver Int.2010；30(8):1198-210；Bémeur等人，Neurochem. Int.2010；56(2):213-5；Butterworth等人，Hepatology.2011；53(4): 1372-6)。尽管TNF阻断剂在动物模型中显示出有希望的治疗功效，但它们在急性酒精性肝炎患者中引起严重感染(Naveau等人，Hepatology 2004；39:1390-1397；Boetticher等人，Gastroenterology 2008；135: 1953-1960)。严重感染可能由不必要的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)效应引起，其由抗体或Fc 融合重组蛋白所造成，该Fc融合重组蛋白识别在巨噬细胞、活化T淋巴细胞和多形核白细胞上表达的膜结合TNF(Naveau等人，Hepatology 2004；39:1390-1397；Tracey等人，Pharmacol.Ther.2008；117(2):244-79)。此外，由于这些TNF阻断剂的长半衰期导致的TNF/NF-κB信号传导的持续抑制，阻止了急性肝损伤后的肝再生(Naveau等人，Hepatology2004；39:1390-1397；Tracey等人，Pharmacol.Ther.2008；117(2):244-79； Bhushan等人，Am.J.Pathol.2014；184(11):3013-25)。

血清中TNF浓度较高的患者可能对抗TNF治疗有较好的反应，并减少感染的副作用。然而，仍没有TNF浓度的常规预测标记或用于在体内检测TNF的诊断工具。如上所述，本文公开的TNF适配体可以被操作和修饰以缀合至成像剂，用于CT、MRI、超声波和内窥镜检测(Bird-Lieberman等人，Nat.Med.2012；18(2):315-21；Van den Brande 等人，Gut.2007；56(4):509-17)。使用适配体预筛选抗TNF治疗的潜在反应者可以提高安全性和疗效。在一些具体实施例中，本文公开的抗TNF适配体具有诊断治疗效果，且可用作潜在的监测工具。在TNF 移植之前，抗TNF适配体可以为ALF患者提供替代治疗方法。

此外，用于aptTNF-/aptTNF-α-PEG的解毒剂是适配体本身的互补序列，可以容易地设计和合成，这可以允许即时施用解毒剂。不受特定理论的束缚，本文所述的抗TNF适配体任选地与适配体抑制剂(包括反义序列)一起，可以允许在急性组织损伤阶段适当抑制TNFα途径，避免组织修复阶段时抑制再生，并在需要时加强对抗效果的即时终止。

SIRS是终末器官(end-organ)损害期间发生的常见现象(Bernal 等人，N.Engl.J.Med.2013；369:2525-34；Ware等人，N.Engl.J.Med. 2000；342:1334-49；Gattinoni等人，Am.J.Resp.Crit.Care.2016；194: 1051-2)。如下文所述的ALI模型中所证明的，在LPS诱导的ALI中，全身性LDH、AST和ALT水平增加，并且在主要重要器官中检测到aptTNF-α信号。细胞因子风暴的激增将单一器官疾病推进为全身性炎症疾病，并且可导致多器官功能障碍，包括中枢神经、心血管、呼吸、胃肠、肾和血液系统等。不受特定理论的束缚，本文所述的小分子大小的适配体可以允许有效的组织穿透。在一些具体实施例中，本文描述的适配体可以穿透血脑屏障。不受特定限制，本文所述的抗TNF适配体可用于治疗重症监护医学中常见的SIRS相关脑病。

为了实施本文公开的方法，可以通过合适的途径(例如静脉内) 将有效量的本文所述的含有至少一种抗TNF适配体的医药组合物施用于需要治疗的个体(例如人类)，其通过合适的途径，例如推注或通过连续输注一段时间的静脉内施用、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径施用。用于液体制剂的市售喷雾器，包括喷射雾化器和超声波雾化器，有用于给药。液体制剂可以直接雾化，而冻干粉末可以在重构后雾化。或者，本文所述的含有抗TNF适配体的组合物可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器雾化，或者作为冻干和研磨的粉末吸入。

如本文所用，“有效量”是指单独或与一种或多种其它活性剂组合赋予个体治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些具体实施例中，治疗效果是阻断TNF介导的细胞信号传导、减少炎症、减少肝损伤和/ 或增加肝再生。确定TNF结合适配体的量是否达到治疗效果对于本领域技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所知，有效量根据所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数，包括年龄、身体状况、大小、性别和体重、治疗持续时间、同时点疗法的性质(如果有的话)、特定的给药途径以及医疗人员的知识和专业中的相似因素而有所不同。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用各组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。

如半衰期的实证考量通常将有助于确定剂量。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常(但不是必需地)基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，TNF结合适配体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。

在一个实施例中，如本文所述的抗TNF适配体的剂量可以在已经施用一次或多次TNF结合适配体的个体中凭经验确定。给予个体增量剂量的拮抗剂。为了评估拮抗剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。

通常，对于施用本文所述的任何抗TNF适配体，可以向需要治疗的个体给予初始候选剂量，其可以基于个体对抗TNF适配体的反应进行调整。出于本公开的目的，取决于上述因素，典型的日剂量可以为约0.1μg/kg至100mg/kg或更高中的任何一者。

在一些具体实施例中，对于体重正常的成年患者，可以施用剂量范围为约0.3至5.00mg/kg。具体的剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定个人和个人的病史，以及个人药剂的性质(例如药剂的半衰期和本领域熟知的其它考虑因素)。

为了本公开的目的，如本文所述的TNF结合适配体的合适剂量将取决于特异性TNF结合适配体、疾病/病症的类型和严重性、TNF结合适配体是否用于预防或治疗目的、既往疗法、患者的临床病史和对拮抗剂的反应，以及主治医师的自由裁量权。临床医生可以施用TNF结合适配体，直到达到所需结果的剂量。在一些具体实施例中，期望的结果是炎症减少(例如，减少中性粒细胞浸润到组织中)、肝损伤减少和/或肝再生增加。确定剂量是否产生所需结果的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。一种或多种TNF结合适配体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理条件、施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及技术人员已知的其它因素。TNF结合适配体的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在目标疾病或病症发展之前、期间或之后。

如本文所用，术语“治疗”是指向个体施予或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述个体具有目标疾病或病症、所述疾病/病症的症状或对所述疾病/病症的易感性，其目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善或影响疾病、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。

减轻目标疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展、或降低疾病的严重程度。减轻疾病并不一定需要治疗效果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意味着推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的进展。这些延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是一种降低在给定时间范围内发生一种或多种疾病症状的可能性和/或减少症状程度的方法。在给定的时间范围内，与不使用该方法相比，这些比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的多个个体。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法察觉的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

在一些具体实施例中，将本文所述的TNF结合适配体以足以将 TNF介导的信号传导降低至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的个体，其可以通过常规测定和/或以下实施例中描述者确认。在一些具体实施例中，TNF结合适配体施用的量是在个体体内组织中有效减少至少5％ (例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的炎症炎(例如，减少中性粒细胞浸润、减少一种或多种促炎性细胞因子(例如，IL1β和IL-6)、一种或多种巨噬细胞募集趋化因子(例如，CCL2)、一种或多种中性粒细胞募集趋化因子(例如，IL23 和IL17)或其组合)。

在其它具体实施例中，TNF结合适配体以有效降低个体中(例如，在患有肝损伤的个体中)的氨基转移酶(例如丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST))的血清水平的量施用，以降低至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)。在一些具体实施例中，抗TNF适配体以有效增加肝脏中细胞周期基因(例如，细胞周期蛋白D1或PCNA)的表达(从而促进肝再生) 至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或更高)的量施用。

可以使用医药领域普通技术人员已知的常规方法将医药组合物施用至个体，这取决于待治疗的疾病类型或疾病部位。该组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库(reservoir)施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，其可以通过可注射的贮库(depot)施用途径给予个体，例如使用1个月、3个月或6个月贮库的可注射或可生物降解的材料和方法。在一些实施例中，医药组合物通过眼内或玻璃体内施用。在一些实施例中，医药组合物经气管内施用。在其它实施例中，医药组合物可以通过吸入或皮下注射施用。

可注射组合物可含有各种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇 (甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性TNF结合适配体，由此输注含有TNF结合适配体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂，例如TNF结合适配体的合适可溶性盐形式的无菌制剂，可以溶解在药物赋形剂中并加以施用，例如注射用水，0.9％盐水或5％葡萄糖溶液。

在一个具体实施例中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用 TNF结合适配体。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括TNF结合适配体的各种可植入的贮库来源或局部递送导管，例如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入设备、位点特异性载体(site specific carrier)、直接注射或直接应用。参见，例如，PCT公开第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568 号。

于一些具体实施例中，本文所述的适配体与不同的材料相容，并且可以制成用于局部用途的不同制剂。在一些具体实施例中，在具有急性肺损伤的个体中通过气管内途径增加施用本文所述的抗TNF适配体比通过静脉内途径在较低的药物浓度下可获得最佳效果。在一些具体实施例中，局部递送增加局部有效药物浓度并降低全身副作用，其可用于炎性疾病，包括哮喘。

含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送也可以使用。受体介导的DNA递送技术描述于例如Findeis 等人(1993)，趋势生物技术(TrendsBiotechnol.)，11:202；Chiou等人(1994)，《基因治疗：直接基因转移的方法和应用》(GeneTherapeutics：Methods and Applications of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff编辑)； Wu等人(1988)，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)，263:621；Wu等人 (1994)，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)，269:542；Zenke等人(1990)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:3655；Wu等人(1991)，生物化学期刊 (J.Biol.Chem.)，266:338。

含有多核苷酸的治疗组合物(例如，本文所述的TNF结合适配体或用于其产生的载体)以约100ng至约200mg的DNA给药，用于基因治疗方案中的局部给药。在一些具体实施例中，在基因治疗方案期间，也可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg的DNA或更多的浓度范围。

通过本文描述的方法治疗的个体可以是哺乳动物，例如农场动物、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。于一实施例中，个体是人类。含有抗TNF适配体的组合物可用于在需要治疗的个体中减轻炎症、促进肝再生、减少肝损伤、减少肿瘤负荷。在一些实施例中，个体可以是相对于健康人类个体(例如，没有与TNF相关的疾病者)具有升高的TNF血清水平的人类个体。可以使用常规医学实践评估个体内(例如，个体的血清中)TNF的水平。

在一些实施例中，个体可以是具有由TNF介导的疾病、疑似患有由TNF介导的疾病或具有由TNF介导的疾病风险的人类患者(包括类风湿性关节炎、牛皮癣、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、急性肺损伤、神经退行性疾病、与肝损伤相关的肝脏疾病和癌症)。示例性肝脏疾病包括肝炎、肝硬化、肝纤维化、脂肪肝病和肝癌。在一些实施例中，个体可以是患有TNF介导的急性炎性病症的人类患者。实例包括急性肝损伤、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、干眼症、眼色素层炎、急性胰腺炎、急性肾小球损伤、急性肾衰竭、ANCA相关性血管炎、急性脑病。

具有目标疾病或病症(例如，TNF介导的疾病，包括类风湿性关节炎、牛皮癣、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、神经退行性疾病、急性肺损伤、急性肝损伤和癌症)的个体可以通过常规医学检查来鉴定，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波。疑似患有任何这些目标疾病/病症的个体可能表现出疾病/病症的一种或多种症状。具有疾病/病症风险的个体可以是具有与该疾病/病症相关的一种或多种风险因子的个体。此个体也可以通过常规医学实践来识别。还可以使用本文描述的方法评估个体内的TNF水平。于一些具体实施例中，具有较高TNF浓度的患者对抗TNF疗法(例如，抗TNF适配体治疗) 具有更好的反应，并且减少由感染引起的副作用。

在本文描述的方法中使用的具体剂量方案，即剂量、时间和重复将取决于特定个体(例如，人类患者)和个体的病史。

在一些具体实施例中，抗TNF适配体可以与另一种合适的治疗剂共同用于目标疾病，如本文中所述。替代地或另外地，抗TNF适配体也可以与其它用于增强和/或补充药剂有效性的药剂联合使用。

目标疾病/病症的治疗功效可以通过例如以下实施例中描述的方法评估。

在一些具体实施例中，将与本文公开的可检测标记物(例如显像剂)缀合的抗TNF适配体施用于个体，以评估个体中的TNF水平。此 TNF检测可用于鉴定相关患者的抗TNF治疗(例如，用本文公开的抗 TNF医药组合物治疗或用抗TNF抗体治疗)。

可以使用本文所述的任何适配体通过常规方法在体外检测样品 (例如，疑似含有TNF的生物样品，包括但不限于血液样品和尿液样品)中的TNF。在一些情况下，适配体可以与可检测标记缀合，其可以直接或间接释放信号，指明样品中TNF的存在和/或水平。或者，抗 TNF适配体可用于体内成像TNF在个体(例如，如本文所述的人类患者)中的存在和位置。从本文所述的任何诊断测定(体外或体内)获得的结果可以指明与TNF相关的疾病的风险或状态。

用于治疗或诊断的试剂盒

本公开还提供用于减少炎症(例如，减少炎性蛋白质的产生或减少中性粒细胞浸润、减轻TNF介导的疾病(例如，类风湿性关节炎、牛皮癣、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、急性肺病、神经退行性疾病、与肝脏疾病和癌症相关的肝损伤)和检测个体中的TNF水平。此类试剂盒可包括一个或多个包含结合TNF适配体的容器，例如本文所述的任何适配体。

在一些具体实施例中，试剂盒可包含根据本文所述任何方法使用的说明书。所包括的说明书可以包括适配体施用的描述，以治疗、延迟发作或减轻目标疾病，如本文中所述。试剂盒可以进一步包括基于鉴定该个体是否患有目标疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在其它具体实施例中，说明书包括向具有目标疾病风险的个体施用适配体的描述。

关于TNF结合适配体使用的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装说明书(例如，包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读指令(例如，磁性或光学储存碟上携带的说明书)也是可以接受的。

标签或包装说明书表明该组合物用于与癌症相关的疾病或病症的治疗、延迟发作和/或缓解，例如本文所述者。可以提供用于实践本文描述的任何方法的说明书。

本公开的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶(vial)、瓶子(bottle)、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与特定装置结合使用的包装，例如吸入器、鼻腔给药装置(例如雾化器)或输液装置，例如微型泵。试剂盒可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的TNF结合适配体。

试剂盒可以任选地提供额外的组件，例如缓冲器和解释信息。通常，该试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插件。在一些具体实施例中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。

一般技术

除非另有说明，本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。《分子克隆：实验室手册(第二版)》(Sambrook 等人，1989)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)；《分子生物学方法》，Humana Press；《细胞生物学：实验室手册》(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑，1987)；《细胞和组织培养介绍》(J. P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；《细胞和组织培养：实验室程序》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J. Wileyand Sons；《酶学方法》(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册》(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；《分子生物学现行方案》(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；《PCR：聚合酶链反应》(Mullis 等人编辑，1994)；《免疫学现行方案》(J.E.Coligan等人编辑，1991)；《分子生物学精编实验指南》(Wiley and Sons，1999)；《免疫生物学》 (C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《抗体》(P.Finch，1997)；《抗体：实用方法》(D.Catty编辑，IRL Press，1988-1989)；《单克隆抗体：一种实用的方法》(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；《使用抗体：实验室手册》(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑， Harwood Academic Publishers，1995)。无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本公开。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或申请标的，本文引用的所有出版物均以参照方式并入。

实施例

实施例1：TNF靶向核酸适配体及其对急性肺损伤(ALI)的治疗作用

材料和方法

化学品和寡核苷酸

所有化学品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，寡核苷酸通过IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA，USA)合成。

aptTNF-α的序列是

5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’ (SEQ ID NO：1)。

SELEX

通过硝酸纤维素滤膜SELEX鉴定人类TNF-α靶向适配体。合成的单链DNA库由80个核苷酸长的单链DNA组成，其中40个随机序列侧为引子序列

5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG[N]

PEG缀合物

将过量的胺标记的aptTNF-α与双官能N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇(NHS-PEG-NHS，分子量20kDa，Polysciences Inc.，Warrington， PA)在碳酸氢钠缓冲液(pH 8.3)中于37℃培育18小时，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PEG化二聚体aptTNF-α(aptTNF-α-PEG)，并通过Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific，Hudson，NH，USA) 测定浓度。

结合亲和力测定

将人类TNFα蛋白(0、8.75、17.5、35、70、140nM，R&D Systems) 与aptTNF-α(50nM)在37℃下培育1小时。此外，将小鼠TNFα蛋白(140nM)或BSA(140nM)与aptTNF-α(50nM)或aptTNF-α-PEG (50nM)一起培育。然后通过硝酸纤维素滤膜收集与蛋白质结合的适配体，并通过加热洗脱。通过定量PCR(LightCycler 480System，Roche Applied Science，Mannheim，Germany)定量经洗脱的适配体的量。通过GraphPad Prism 5(GraphPadSoftware，San Diego，CA)使用等式Y ＝Amax×X/(Kd+X)计算解离常数(Kd)。蛋白质结合适配体(人类TNF-α蛋白和小鼠TNF-α蛋白)的相对量表示为倍数变化，使用 BSA作为参考(1倍)。

aptTNF-α的生物分布

小鼠购自实验动物中心(中国台湾，台北)。所有动物实验均根据中央研究院动物设施的指导进行。给6周龄Balb/c雄性小鼠施用 LPS(10mg/kg，气管内)以诱导ALI。在LPS施用后1小时静脉内注射

细胞培养和荧光素酶活性测定

将HEK293细胞在含有10％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco BRL， Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中培养，并用NF-κB报告基因(pGL4.32，Promega，Madison，WI，USA)转染。在转染后 24小时，用潮霉素处理细胞，以选择抗生素抗性克隆体。将表达NF-κB 报告基因的HEK293细胞接种到96孔板(每个2000个细胞)中过夜培养。将TNFα蛋白(5ng)与aptTNF-α(50、500nM)、aptTNF-α-PEG (10、50nM)或抗人类TNFα抗体(10、50nM，R&DSystems)加入每个独立的孔。培育4或24小时后，根据制造商的方案，通过荧光素酶测定系统(Promega)测定荧光素酶活性。数据表示为相对荧光素酶活性，使用未经处理的组作为阴性对照(0％活性)和用TNFα处理组作为阳性对照(100％活性)。

急性肺损伤(ALI)动物研究

为了诱导ALI，用LPS(10mg/kg)气管内处理6周龄Balb/c雄性小鼠。LPS处理后1小时，气管内或静脉内给予aptTNF-α(1600μg/kg) 或aptTNF-α-PEG(32、320μg/kg)。通过MouseMonitor

定量PCR

通过Trizol(Invitrogen)从小鼠肝组织中提取RNA，并根据制造商的方案，使用随机六聚体(Invitrogen)，通过SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。在LightCycler 480系统(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)上进行定量PCR。qPCR中使用的针对小鼠cDNA的引物序列如下所列：IL-1β，5’-agttgacggaccccaaaag-3’ (正向)(SEQ ID NO：3)和5’-agctggatgctctcatcagg-3’(反向)(SEQ ID NO：4)；IL-6，5’-gctaccaaactggatataatcagga-3’(正向)(SEQ ID NO： 5)和5’-ccaggtagctatggtactccagaa-3’(反向)(SEQ ID NO：6)；CXCL2， 5’-aatcatccaaaagatactgaacaaag-3’(正向)(SEQ ID NO：7)和 5’-ttctctttggttcttccgttg-3’(反向)(SEQ ID NO：8)；actb， 5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’(正向)(SEQ ID NO：9)和5’-accagaggcatacagggaca-3’(反向)(SEQ ID NO：10)；CCL2， 5’-catccacgtgttggctca-3’(正向)(SEQ ID NO：11)和5’-gatcatcttgctggtgaatgagt-3’(反向)(SEQ ID NO：12)；5-IL17， 5’-cagggagagcttcatctgtgt-3’(正向)(SEQ ID NO：13)和 5’-gctgagctttgagggatgat-3’(反向)(SEQ ID NO：14)；IL23， 5’-tccctactaggactcagccaac-3’(正向)(SEQ ID NO：15)和 5’-agaactcaggctgggcatc-3’(反向)(SEQ ID NO：16)；CCND1，5’-tttctttccagagtcatcaagtgt-3’(正向)(SEQ ID NO：17)和 5’-tgactccagaagggcttcaa-3’(反向)(SEQ ID NO：18)；和PCNA， 5’-ctagccatgggcgtgaac-3’(正向)(SEQ ID NO：19)和5’-gaatactagtgctaaggtgtctgcatt-3’(反向)(SEQ ID NO：20)。

蛋白质印迹法(Western blot)和免疫组织化学染色

用于蛋白质印迹法的初级抗体如下所列：抗GAPDH(Santa Cruz) 和抗PCNA(CellSignaling Technology，Beverly，MA，USA)。苏木精和曙红染色(H&E)于中央研究院生物医学科学研究所的病理核心室内进行。根据由动物急性肺损伤研究组(Matute-Bello等人，Am.J. Respir.Cell Mol.Biol.2011；44:725-38)设计的评分系统计算肺损伤评分。对于免疫组织化学染色，以1：100稀释使用抗Ly6G(克隆1A8， Biolegend，San Diego，CA，USA)抗体。使用ImmPRESS

统计

结果显示为平均值±平均值的标准误差，P值通过学生t检定计算。双尾P值低于0.05被定义为具有统计学意义。

结果

AptTNF-α以高亲和力结合TNFα，并在体内靶定TNFα

通过硝酸纤维素滤膜SELEX选择TNFα靶向适配体(aptTNF或 aptTNF-α，图2A)，通过FASTAptamer分析，并使用Mfold基于预测的二级结构进行优化。aptTNF-α和人类TNFα的解离常数(Kd)为8nM (图2B，左图)。由于数据进一步显示aptTNF-α也与小鼠TNFα结合(图2B，右图)，随后使用ALI小鼠模型研究aptTNF-α的体内结合效应。

数据显示，在ALI组中，在2小时和4小时在胸腔中清楚地观察到aptTNF-α信号，但在LPS诱导的ALI后24小时消失(图2C及图 2D)。该观察结果与ALI时肺组织中报导的TNFα动力学一致(Cakarova 等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.2009；180:521-32)。由于SIRS可能在ALI后发生并导致多器官损害，因此在给予aptTNF-α后4小时收集重要器官，并检查其生物分布。数据显示，施用相同剂量的aptTNF-α，与对照组相比，ALI组的肝、脾、肺和肾中的aptTNF-α信号显著增加 (图2E及图2F)。在对照组中，aptTNF-α信号主要在肾脏和膀胱中观察到，器官参与适配体排泄，但信号强度低于ALI组。进一步的血液检查也显示ALI组的LDH、AST和ALT水平显著增加。该数据支持 aptTNF-α生物分布图像研究中观察到的终末器官损害的发生(图2G)。总之，数据显示aptTNF-α对人类TNFα具有良好的体外结合亲和力，并且可以在体内靶定TNFα，如小鼠ALI模型所示。

AptTNF-α-PEG抑制TNFα介导的信号传导

接下来，研究了aptTNF-α或其衍生物是否有效抑制TNFα介导的信号传导。由于生理活性的TNFα在生理条件下以三聚体形式存在，因此通过在两个aptTNF-α单体(aptTNF-α-PEG，图3A)之间添加聚乙二醇(PEG)连接基来合成二聚体aptTNF-α，以加强aptTNF-α的潜在拮抗作用。数据显示二聚体aptTNF-α-PEG还对人和小鼠TNFα蛋白具有特异性结合活性(图3B)。

此外，报告基因测定显示，虽然单体aptTNF-α在500nM浓度下有效抑制TNF-α/NF-κB信号传导，但二聚体aptTNF-α-PEG在TNFα处理后4小时测量的50nM信号传导时具有更好的抑制TNF-α/NF-κB 的效力(图3C，上图)。此外，单体aptTNF-α在TNFα处理后24小时消退的抑制作用和二聚体aptTNF-α-PEG的抑制作用降低至原始功效的约40％。相反，在TNFα处理后24小时，抗TNFα抗体的抑制作用仍然存在(图3C，下图)。这些数据表明，aptTNF-α和aptTNF-α-PEG 在具有全身性炎症反应的急性疾病中的潜在作用，因为它们仅抑制急性期TNFα信号传导。这可以避免组织修复阶段所需的基础TNFα信号传导的干扰以及与持久抑制先天免疫相关的副作用。

AptTNF-α可减轻急性肺损伤的严重程度

接下来，使用LPS诱导的ALI小鼠模型研究aptTNF-α和 aptTNF-α-PEG的体内作用。如氧饱和度的显著降低所表明，数据显示 LPS治疗引起呼吸窘迫(图4A)。LPS处理组中湿肺重量的增加表明肺泡-毛细血管膜对LPS诱导的损伤具有增强的通透性(图4B)。LPS 诱导的ALI组的组织学检查显示在肺泡间隔中，肺泡中隔增厚和红细胞、中性粒细胞和纤维蛋白链有积聚的现象，并且伴随肺损伤评分增加(图4C及图4D)。对BALF的进一步分析显示总蛋白水平增加、总细胞数增加、骨髓过氧化酶(MPO)活性增强、促炎性细胞因子/趋化因子(IL-1β、IL-6和CXCL2)的表达上调(图4E至图4J)。这些表型和分子结果符合预期的组织反应级联(cascade)，其由细胞因子和趋化因子反应ALI协调。

随后，显示气管内或静脉内施用aptTNF-α-PEG，以剂量依赖性方式在表型、组织学和分子层面挽救LPS诱导的损伤(图4A至图4J)。数据显示，当通过气管内途径递送时，与全身递送相比，aptTNF-α-PEG 具有更好的功效，这可能与更高的局部浓度相关。尽管气管内施用 aptTNF-α也在一定程度上抑制了LPS诱导的ALI，但这仅在相对高的药物浓度(aptTNF-α-PEG的5倍)中实现，表明aptTNF-α-PEG的效力更高。总之，数据表明，aptTNF-α-PEG或aptTNF-α可以抑制由TNFα途径和随后的细胞因子风暴介导的急性期细胞凋亡信号，其最终导致 ALI中的组织损伤。

实施例2：新型TNF靶向适配体对急性肝衰竭(ALF)具有治疗作用

材料和方法

除了下面描述的动物研究之外，使用的材料方法与实施例1中的相同。

急性肝衰竭(ALF)动物研究

为了诱导ALF，给6周龄Balb/c雄性小鼠注射D-半乳糖胺(D-GalN， 100mg/kg，腹膜内)和人类TNFα(40μg/kg，静脉内)。接下来，静脉内给予N-乙酰半胱氨酸(NAC，600mg/kg)、aptTNF-α(1600μg/kg) 或aptTNF-α-PEG(3.2、32、320μg/kg)处理，血液在处理后6小时取样(Saito等人，Hepatology.2010；51:246-54；Sass等人，Cytokine.2002； 19:115-20)。血液用于AST和ALT分析(Fuji Dri-Chem 4000i)。处理后6或24小时牺牲小鼠。收集肝组织用于RNA、蛋白质提取以及免疫化学染色。

结果

AptTNF-α减弱TNFα介导的急性肝衰竭(ALF)并加强早期肝再生

对于具有猛暴型结果的ALF患者，目前在肝移植前可用的治疗是全身输注N-乙酰半胱氨酸(NAC)(Bernal等人，N.Engl.J.Med.2013； 369:2525-34)。由于ALF是TNFα介导的，随后研究了aptTNF-α和 aptTNF-α-PEG在ALF中的作用，并使用D-半乳糖胺(D-GalN)/TNF-α诱导的小鼠ALF模型将其作用与NAC进行比较。

数据显示注射D-GalN/TNFα诱导严重的肝细胞死亡，并伴随组织出血和中性粒细胞浸润。用aptTNF-α-PEG处理减少了观察到的肝损伤 (图5A)。血清AST/ALT和组织促炎性细胞因子/趋化因子(IL-1β、 IL-6和CXCL2)的进一步分析显示，aptTNF-α(1600μg/kg)或aptTNF-α- PEG(3.2μg/kg至320μg/kg)至NAC(600mg/kg)具有优异的肝脏保护作用(图5B至图5F)。巨噬细胞募集趋化因子(CCL2)和中性粒细胞募集趋化因子(IL23、IL17)也通过TNF和D-GalN注射而增加，并且通过aptTNF-α-PEG处理而减少(图7)。此外，aptTNF-α-PEG 具有剂量依赖性的肝保护作用，并且再次优于aptTNF-α(图5B至图 5F)。

此外，由于肝细胞在急性损伤期后从G0转变为G1期，因此在肝再生期间通常可观察到PCNA表达的上调。数据显示，与NAC处理组相比，aptTNF-α-和aptTNF-α-PEG处理组皆具有更高的PCNA蛋白(图 5G)和mRNA(图8)表达。数据表明，在急性损伤后， aptTNF-α/aptTNF-α-PEG处理组中肝细胞在较早时间点进入G1期(图 5G)。

aptTNF-PEG组也显示出显著更高的细胞周期蛋白D1的蛋白和 mRNA表达(数据未显示和图8)，NAC组中的表达仅略微增加(图8 和数据未显示)，也表明aptTNF-PEG组中的肝细胞在较早的时间点进入了再生过程。

此外，显示在接受aptTNF-α或aptTNF-α-PEG处理的组中，AST 和ALT升高逆转的程度相同。尽管如此，虽然在NAC治疗组中的ALT 升高可以逆转，但AST仍然很高(图5B及图5C)。在肝组织中，所有处理(包括使用NAC、aptTNF或aptTNF-PEG的处理)抑制半胱天冬酶-3活化(图6)。ALT是主要在肝脏中表达的酶。相反地，AST不仅在肝脏中表达，也在心脏、肌肉和脑组织中表达。由于肝功能衰竭不仅仅是单一器官疾病，而且可导致SIRS和多器官功能衰竭，我们的数据表明，使用aptTNF-α/aptTNF-α-PEG治疗不仅可以挽救急性肝损伤，还可以抑制SIRS过程。该数据暗示了aptTNF-α/aptTNF-α-PEG在 ALF中的潜在全身保护作用。总之，本文所述的数据显示 aptTNF-α/aptTNF-α-PEG具有良好的肝脏保护作用，并且还可能抑制 SIRS的过程，从而防止在临床实践中常见的多器官衰竭。

实施例3：AptTNF-α用作监测肝脏体内TNFα的诊断剂

材料和方法

生物分布分析

对于内源性小鼠TNF诱导，将6周龄Balb/c雄性小鼠以腹膜内注射D-GalN(650mg/kg)和LPS(10μg/kg)，以诱导急性肝衰竭。处理后6小时牺牲小鼠，收集血清和肝组织。对于生物分布测定，在D-GalN 和LPS处理后0.5小时，静脉注射经

结果

AptTNF-α用作体内监测TNFα的诊断剂

肝组织中，TNFα浓度较高的患者对抗TNFα治疗的反应可能更好。然而，没有常规的TNFα浓度预测标记或诊断工具来检测体内TNFα。为了减少抗TNFα治疗对无反应者的不良副作用，研究了aptTNF-α作为体内监测TNFα的诊断剂的可行性。为了诱导小鼠内源性TNFα分泌和急性肝损伤，将LPS和D-GalN注射到小鼠中。在LPS和D-GalN 注射后30分钟施用荧光标记的aptTNF-α。没有LPS和D-GalN注射但经荧光标记的aptTNF-α施用的小鼠用作阴性对照。与阴性对照组相比， AptTNF-α在LPS和D-GalN注射组的肝组织中显著蓄积(图9A至图 9C)，尽管两组中大量的aptTNF-α从肾脏过滤排泄到膀胱。

其它具体实施例

本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行结合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的示例。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修饰，以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求书的范围内。

等同物

虽然本文已经描述和说明了若干发明实施例，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果的各种其它装置和/或结构和/或本文所描述的一个或多个优点。这些变化和/或修饰中的每一者被认为是在本文描述的发明具体实施例的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于具体应用或应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的具体发明的具体实施例的许多等同物。因此，应该理解，前述实施例仅作为示例呈现，并且在所附权利要求书及其等同物的范围内，本公开的实施例可以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本公开的发明实施例涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则包括两个或更多这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包含于本公开的发明范围。

如本文定义和使用的所有定义应理解为字典所控制的定义、通过引用并入的文献中的定义，和/或所定义的术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均以参照方式并入本文所引用的每一标的，在某些情况下可涵盖整个文件。

除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”和“一个(an)”应理解为表示“至少一个”。

本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的元件中的“其中一个或两个”，即在某些情况下元件结合地存在而在其它情况下分离地存在。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即，如此结合的“一个或多个”元件。除了与“和/或”子句具体标示的元件之外，可以任选地存在其它元件，无论是与具体标示的那些元件相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指A(任选地包括除了B之外的元件)；在另一个实施例中，仅限于B(任选地包括除A之外的元件)；在又一个具体实施例中， A和B两者(任选地包括其它元件)等等。

如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当列表中的分隔项目时，“或”或“和 /或”应被解释为包含性(inclusive)的，即，包含至少一个，但也包括多个元件的数量或列表，以及任选的其它未列出的项目。只有明确表示相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者，当在权利要求书中使用时，“由……组成”将是指包含数字或列表中的一个元件。一般而言，此处使用的术语“或”仅应被解释为表示排他性条款之前的唯一替代方案(即“一个或另一个但不是两个”)，例如“任一”、“其中之一”或“正是其中之一”。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元件的列表，短语“至少一个”应理解为表示选自元件列表中的任何一个或多个元件中的至少一个元件，但不一定包括元件列表中具体列出的每个元件中的至少一个元件，并且不排除元件列表中元件的任何组合。此定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元件列表内具体标示的元件外，任选地存在的元件，无论是与具体标示的那些元件相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以参考在一个具体实施例中，至少一个(任选地包括多于一个)A，不存在B(并且任选地包括除B之外的元件)；在另一个具体实施例中，至少一个(任选地包括多于一个)B，不存在A(并且任选地包括除A 之外的元件)；在又一个具体实施例中，至少一个(任选地包括多于一个)A和至少一个(任选地包括多于一个)B(和任选地包括其它元件) 等等。

还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法所述的步骤或行为。

序列表

<110> 中央研究院

杨泮池

<120> 治疗或诊断TNF相关炎性疾病的TNF靶向适配体及其用途

<130> A0988.70085WO00

<140> 尚未分配

<141> 与此同时

<150> US 62/660,324

<151> 2018-04-20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

gcgccactac aggggagctg ccattcgaat aggtgggccg c 41

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(60)

<223> n 为 a、c、g、或 t

<400> 2

acgctcggat gccactacag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

ctcatggacg tgctggtgac 80

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

agttgacgga ccccaaaag 19

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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agctggatgc tctcatcagg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

<400> 5

gctaccaaac tggatataat cagga 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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aatcatccaa aagatactga acaaag 26

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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ttctctttgg ttcttccgtt g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ctaaggccaa ccgtgaaaag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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accagaggca tacagggaca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<213> 人工序列

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gatcatcttg ctggtgaatg agt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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cagggagagc ttcatctgtg t 21

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<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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tccctactag gactcagcca ac 22

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

<400> 20

gaatactagt gctaaggtgt ctgcatt 27