丙酮酸乙酯在治疗非酒精性脂肪肝中的应用

摘要

本发明涉及丙酮酸乙酯在治疗非酒精性脂肪肝中的应用，其中，所述非酒精性脂肪肝优选非酒精性脂肪浸润型肝炎，本发明为此提供一种含有丙酮酸乙酯的可供服用的药物制剂，优选口服的液体的水溶液制剂，其在水中，或水溶液中，或含水饮料中的体积浓度为0.03‑6％(v/v)，优选为1‑5％(v/v)，特别优选为2‑4％(v/v)，最优选为2‑3％(v/v)，本发明的口服液可以通过将丙酮酸乙酯作为添加剂，添加到任意一种口服饮料中制备得到，比如加入饮用水中，加入可乐中，加入果汁饮料中。

说明书

技术领域

本发明涉及药物新用途，特别涉及丙酮酸乙酯在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。

背景技术

丙酮酸乙酯,英文名称:Ethyl pyruvate(简称：EP)，CAS号:617-35-6，分子式:C5H8O3， 分子量:116.1152，是一种无色液体，其结构式如下：

现有技术公开了丙酮酸乙酯治疗肝脏炎症性损伤的动物实验，丙酮酸乙酯治疗酒精 性肝炎和胰腺炎的动物实验，如《实用肝脏病杂志》2009年第5期329-331,338,观 察丙酮酸乙酯(EP)对D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝损伤模型大鼠的保护作用， 并探讨其作用机制。《山西医科大学》2007年，丙酮酸乙酯对急性肝损伤保护作用 的研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病[1]。NAFLD影响着全球20-40％的成年人，并已成为一个迅速增加的健康问题[2]。NAFLD的特点是肝细胞过度脂 肪积聚，这既可以是一个单纯孤立的非酒精性脂肪肝型(NAFL)，也可以发展成 伴有炎症和细胞损伤，有或无纤维化的非酒精性脂肪浸润型肝炎(NASH)型[3]。

NASH是病情活动并更具破坏性的一种NAFLD类型[2,3]，它是一种常见的肝病， 其患病率约占成年人口的3-5.7％[4]。NASH也是肝衰竭的一个重要原因[2]。NASH 可能发展为肝硬化[2,3,5]，肝硬化往往需要肝移植才能治愈。据估计，NASH将在 未来十年取代丙型肝炎病毒感染成为美国肝移植的主要原因[3,6]。NASH也是肝细 胞癌最重要的原因之一[2,7,8]。尽管对NASH具有明确的形态学特征的定义，但 它的发生机制仍不清楚。NASH的发病机制常被描述为一个双击假说：第一，肝脂 肪变性使免疫细胞制敏；第二个“打击”涉及氧化应激，导致后期的炎症和纤维化 [9]。大量证据表明，氧化应激是NASH发生发展过程中的主要和必要的过程，抑 制应激激活转录因子NF-κB可防止NASH的发生[5]。脂质过氧化的增加是NASH 发展的一个标志[10]。此外，肠道细菌也可能在从良性肝脂肪变性发展成NASH的 过程中起主要作用[11,12]。尽管公共卫生系统承受着沉重的负担，但目前尚无FDA 批准的治疗该疾病的方法。因此，寻找新的治疗方法比以往任何时候都更加迫切。 EP是一种新型的抗炎药，对人体无毒、耐受性好，治疗窗口宽，安全、易给药[13]。 在短期治疗过程中，EP能缓解多种炎症性器官(肝、胰、肺、心、肾、脑)损伤，这 种安全、低成本的化合物还能减少肠道细菌转位，并抑制NF-κB激活，改善肠黏 膜炎症损伤[13]。此外，EP还具有高效清除过氧化氢、超氧阴离子和预防体内外脂 质过氧化的能力[14,15]。已经证实EP可改善实验性酒精性肝炎[16]和急性重症胰腺 炎(SAP)引起的肝损伤[17]。后者由胆碱缺乏型饮食喂养和单剂量的LPS注射诱 导，该模型中的肝脏形态与NASH具有一定的相似性[17]，长期胆碱缺乏饮食也用 于诱导脂肪肝[18]。现有研究表明长期使用EP可抑制动物模型中多种肿瘤(如肝细 胞癌、胃癌、前列腺癌)的生长，如果长期使用EP可降低致癌风险。

非酒精性脂肪浸润型肝炎是脂肪肝的一个亚型,约占5-7％的成年人口.此亚型可发展 成肝硬化和肝癌，因此需受特别关注.目前还没有公认的治疗药物.因此寻找开发新药非常迫切。由于NASH是一种慢性疾病，需要长期服药；因此，本发明在提供丙 酮酸乙酯治疗非酒精性脂肪肝的同时，开发了一种新的服用方法，通过在饮用水中 添加这种气味很好的化合物来治疗NASH。

发明内容：

丙酮酸乙酯在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

所述非酒精性脂肪肝为非酒精性脂肪浸润型肝炎。

所述药物为含有丙酮酸乙酯的可供服用的药物制剂，制剂中的药物活性成分为丙酮 酸乙酯，其余为药物学上可接受的载体。

所述药物制剂是任何可药用的剂型，

所述药物制剂，是口服的液体的水溶液制剂。

所述口服的液体的水溶液制剂可以通过将丙酮酸乙酯，添加到任意一种口服饮料中 制备得到，比如加入饮料水中，加入可乐中，加入果汁饮料中。

所述口服的液体的水溶液制剂，丙酮酸乙酯在水中，或水溶液中，或含水饮料中的体积浓度为0.03-6％(v/v)，

优选为1-5％(v/v)，

更优选为2-4％(v/v)，

最优选为2-3％(v/v)。

本发明发现，丙酮酸乙酯在人体安全耐受，可长期服用。

本发明为此提供一种含有丙酮酸乙酯的可供服用的药物制剂，制剂中的药物活性成 分为丙酮酸乙酯，其余为药物学上可接受的载体。

本发明所述药物可接受的载体在制剂中所占重量百分比可以是0.01-99.99％。

本发明的药物制剂，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支。

本发明的药物制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、口服液颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂等。 本发明的药物制剂其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、 稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进 行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括 例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服制剂。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂 可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙 基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、 脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁 油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯 甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。 对于液体制剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体 和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在 一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如 一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性， 可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的药物制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体。

所述药物可接受的载体包括但不限于以下物质，选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋 酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、 果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其 衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢 钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、 硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明优选的药物制剂形式，是液体的，混悬的，干粉的等常用的形式，最优选的是口服的水溶液形式。其制备是根据制剂学常规技术制备的，如以下方法：

口服液处方组成与制备①组成：丙酮酸乙酯，蒸馏水适量。②制备：取丙酮酸乙酯定溶于适量热蒸馏水中，冷却后过滤，随后添加蒸馏水至需要量即可。

本发明的药物制，其配方是经过筛选得到的，本发明采用了不同的配方进行比较筛 选，找出了最优选的配方即本发明的配方，该配方比现有制剂的配方有许多优点如： 口感好、不刺激、起效快、用量少、使用方便安全无毒。

本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量。

本发明的技术方案是通过实验获得的，实验采用在饮用水中添加丙酮酸乙酯作为使 用药物，通过服用来缓解实验性非酒精性脂肪浸润性肝炎，以下通过实验数据进一 步说明本发明的有益效果。

缩写:

非酒精性脂肪浸润性肝炎＝NASH，丙酮酸乙酯＝EP，活性氧簇＝ROS，蛋氨酸-胆碱缺乏＝MCD，丙二醛＝MDA，细菌转位＝BT，非酒精性脂肪性肝病＝NAFLD，肝 细胞性肝癌＝HCC，肠系膜淋巴结＝MLN。

摘要

炎症和氧化应激在非酒精性脂肪浸润性肝炎(NASH)的发病机制中起重要的作用。丙 酮酸乙酯(EP)是一种新型的抗炎剂和强效的活性氧清除剂。因此，本研究用这种安 全且人类耐受性良好的化合物EP去评估其是否能缓解实验性NASH。C57BL/6雄 性小鼠被饲喂蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)的饲料3周来诱发NASH。NASH小鼠被随机 分成3组：MCD治疗组动物仅予以正常饮用水；延迟EP治疗组先予以同MCD组 同样的方式喂养10d后，给予添加了3％(v/v)EP的饮用水；早期EP治疗组动物与 延迟EP组处理基本相同，除了EP治疗开始于MCD饮食的同一天；对照组以正常 饮食喂养，并给予正常饮水(每组10只)。与正常饮水处理的MCD组相比，早期EP 治疗显著降低了血清谷丙转胺酶(ALT)浓度，改善了NASH的组织学改变；EP的治疗作用机制与减少肝炎症细胞浸润、抑制肝NF-kB活化、降低肝组织丙二醛水 平、减少肠道细菌转位有关；这四个因素在NASH发病机制中起重要的作用。延迟 EP治疗显著降低仅50％的小鼠血清ALT浓度。结论：在饮用水添加EP可减轻实 验性NASH，EP可能是治疗NASH的一种新方法。

关键词：丙酮酸乙酯；非酒精性脂肪性浸润肝炎；炎症；氧化应激；NF-KB。

材料和方法

材料

除了特别说明的，所有化学品均从Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)公司购买。

动物实验

蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食是一种广泛使用的NASH动物模型[19,20]。通过 用MCD饮食来喂养体重约25g的C57BL/6雄性小鼠22天来诱导NASH(这是个 非常有侵略性的模型，一些小鼠可在22天内丢失30％的体重)。在饮用水中添加 EP(3％，v/v)。将患有NASH的小鼠随机分成以下3个治疗组：用正常饮用水 处理的MCD饮食组；延迟EP治疗组：从MCD饮食喂养的第10天起开始饮用添 加EP的水(因为预实验显示，所有动物在MCD饮食喂养10天后出现典型的NASH 病理，n＝5)；早期EP治疗组：从给予MCD饮食的第一天开始饮用添加EP的水； 对照小鼠喂食正常食物并给予正常饮用水(每组n＝10)。在实验之前将动物禁食 过夜，并且所有动物在实验期间可自由获得正常饮用水或补充有EP的饮用水。每 天监测每只动物的体重。

血清转氨酶测定

根据厂家的说明，使用市售试剂盒(Sigma Diagnostic)在37℃下测量血清AST和ALT水平。

NASH组织病理学

将福尔马林固定的肝组织切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，并使用光学显微镜观察。对所有样品进行盲分析以确定每个显微镜视野的病变程度，放大倍数为200 倍。每个组织样品评估五个视野。由病理学家根据目前公认的由Kleiner等人[21]修 订的标准化损伤评分系统对组织学活性进行分级，其评分为0至8，内容如下：1) 简单的4个等级(从0级到3级)用于评价脂肪变性的程度。使用低至中倍显微镜 视野来评估具有脂肪变空泡的肝细胞的百分比。正常肝脏组织(0级)只有少于5％ 的肝细胞含脂肪，而在1级肝脂肪变性中，5％～33％的肝细胞有脂肪变性。在2级 肝脂肪变性中，33-66％的肝细胞有脂肪存在。在3级肝脂肪变性中，超过66％ 的肝细胞中存在脂肪。2)使用4等级(从0到3)方法来评估肝小叶炎症，其被定 义为每个肝小叶病灶内有两个或两个以上的炎性细胞。正常肝脏(0级)每200倍 视野不含炎性病灶，而1级肝小叶炎症每200x视野少于2个炎性病灶。2级肝小叶 炎症则每200x视野包含2-4个炎性病灶，而3级肝小叶炎症则每200x视野则有4 个以上的炎性病灶。3)使用3级(从0-2)评分的方法来评估肝细胞气球样变的程 度。正常肝脏(0级)没有气球样变细胞。1级病变的肝脏只有个别气球样变细胞， 而2级病变的肝脏有很多的气球样变细胞，或者气球样变细胞占大多数。此外， 还评估了炎性细胞浸润，并且通过在200的放大倍数下平均每个显微镜视野的炎性 细胞数量来半定量地对结果进行评分。每个组织样品评估五个视野。

肝组织丙二醛含量(MDA)

脂质过氧化在NASH的发展中起重要作用。因此，照之前所说的方法[16,22]进行脂质过氧化的测定。结果表示为每克组织的MDA毫微摩尔。

对肝脏组织NF-кB活跃程度的评价

NF-kB是炎症的主要调节因子，这种多效转录因子与炎症过程和氧化应激有关[23]。 因此，用市售的ELISA试剂盒(Beijing BossBio Bio-Technology CO/LTD，Beijing，China)，并根据制造商的说明来测定肝NF-κB活化。

对肠道细菌转位的评估

肠道细菌可能是促使良性肝脏脂肪变性[11,12]向NASH发展的另一个始动因素。因 此，我们检测了转移到肠系膜淋巴结(MLN)的肠道细菌，方法如前所述[24,25,26]。 简言之，用10％的碘酒清洁皮肤。使用无菌技术，打开腹腔，暴露内脏。MLN 复合体被取出，称重，并置于含有0.5mL冰冷PBS的研磨管中。将MLN用玻璃研 磨机磨碎，并将250μL的匀浆物涂布在脑心浸液和MacConkey琼脂(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)上。在37℃需氧培养后24小时检查平板。对菌 落计数，结果表示为每毫克组织的菌落形成单位(CFU)。

q-PCR检测肝组织早期炎症因子TNF-a、IL-6表达

NASH伴有细胞损伤和炎症细胞浸润[3,27]。在多种动物模型中,炎症细胞可能通过 分泌TNF-α，IL-6这两种重要的早期炎症细胞因子导致肝损伤[13,16]。因此，如下 所述，通过实时RT-PCR测定TNF-α，IL-6的肝mRNA水平[28]。根据制造商的 说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用TRIzol试剂分离总RNA。为了确定细胞 因子信使RNA的相对量，使用Smart Cycler(Cepheid，Sunnyvale，CA)和DNA 荧光染料SYBR Green(MolecularProbes，Eugene，OR)监测样品互补DNA的扩 增。使用GenBank中报道的序列设计引物。引物序列如下：白细胞介素(IL)-6： 5′GAGGATACCACTCCCAACAGACC,3′AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA； 肿瘤坏死因子(TNF-α)：5′GGGACAGTGACCTGGACTGT,3′

CTCCCTTTGCAGAACTCAGG；甘油醛-3-磷酸脱氢酶：5′

GTCTTCACCACCATGGAGAAG,3′CCACCTTCTTGATGTCATCAT。如果可能， 将引物设计为跨越至少一个内含子，以最小化基因组扩增的风险。通过聚合酶的分 析验证了引物的特异性用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳连续反应(PCR)产物以 及PCR产物的直接测序。所有实时PCR运行包括熔解曲线分析，以确保每次PCR 反应产物的特异性。

晚期炎症介质HMGB1在血清和肝组织中的测量

HMGB1是致命的系统性炎症的晚期介质[29,30]。HMGB1能促进肝损伤,并在扑 热息痛肝毒性和急性重症胰腺炎的动物模型中介导肠道细菌转位[31]。肝细胞已 被报道为HMGB1的主要来源,参与酒精性肝病(ALD)的发病机制[32]。

HMGB1招募肝星状细胞和肝内皮细胞到乙醇诱导的实质细胞损伤部位[33]。此外,HMGB1与早期炎症细胞因子相比有一个较长的治疗窗口:血清中的肿瘤坏死因 子和白细胞介素六在败血症发生后可升高5天,而血清HMGB1水平可升高至 少21天[30]。因此,HMGB1可以成为NASH等慢性肝病的较好治疗靶点。目前, HMGB1在NASH中的作用尚不清楚。因此,本研究用酶联免疫(ELISA)来测 定血清和肝组织HMGB1水平。血液(1000μl)是通过心脏穿刺获得的；血清在-80° c冷冻储存。为了提取蛋白质,我们用T-Per提取液(皮尔斯,洛克福德,il)对小鼠 肝组织样品进行均质化,并按照制造商的指导,采用1:20的比例来提取肝组织蛋白 质。肝组织匀浆液以10,000克被离心5分钟以去除颗粒组织碎片。上清液在-80° c被冷冻储存。蛋白质浓度是使用商业上可获得的布拉德福德检测(Bio-Rad,大力 神,ca)测定的。HMGB1是根据制造商的说明使用从神户测试公司(日本神奈川县 229-0011)购买的HMGB1ELISA试剂盒进行测量的。HMGB1水平表示为每毫克 肝组织蛋白质的HMGB1量(单位为微克)。

免疫组化染色来检测肝细胞凋亡

肝细胞凋亡是NASH的标志之一,肝细胞凋亡可导致肝损伤和纤维化[27,34]。因此,根据制造商的说明,我们用由BD Pharmingen(美国加利福尼亚州圣何塞)公司 提供的染色试剂盒来检测肝细胞凋亡。

统计方法

数据被表述为平均数±标准差。连续性数据用双尾学生的t检验或方差分析来检验,然后对费舍尔的迷幻剂测试进行分析。肠道细菌转位数据则采用威尔科克森u 型检验方法。误差为5％。

结果

血清转氨酶(ALT和AST)浓度

与正常对照动物相比,3周MCD饮食喂养显著增加血清ALT浓度(p≤0.05,n＝10 为每组)。与使用正常饮用水处理的MCD喂养动物相比,早期EP治疗能显著降低 血清ALT水平(n＝10,p＝0.0019,*表明p<0.05与对照组相比；··表示p<0.05 与MCD组相比),但没有显著降低血清AST浓度(n＝10,p≥0.05)。在延迟EP治疗 组中,50％的小鼠(5/10)对延迟EP治疗反应良好(5只小鼠的血清ALT有统计学 意义上的降低,p≤0.03；但其余50％的小鼠(5/10)对延迟的EP治疗没有反应；因此, 延迟治疗并没有显著降低整个延迟EP治疗组的血清ALT浓度(n＝10,p≥0.05)(图 1)。

肝脏组织病理学

在MCD喂养22天后的组织学评价中,与对照动物相比,MCD喂养的小鼠的肝脏损 伤评分为7.5±0.2(平均值±SEM,n＝10),这些肝脏有广泛的炎症细胞浸润(215± 35每高倍视野,n＝10)。由于炎症细胞浸润与气球样变细胞的数量有关,该组分为两 个亚群:在第一MCD亚组(n＝5)中,90％以上的肝细胞有脂肪存在,且气球样变占 大多数,而这5只小鼠炎症细胞浸润数量相对较少(118±10)。在第二亚组(n＝5) 中,66％以上的肝细胞有脂肪存在,而气球样变数量较少(每200倍视野仅有几 个),但这5只小鼠有广泛的炎症细胞浸润(292±11,n＝5),其炎症细胞浸润的数量 显著大于第一亚群(p≤0.05)。相比之下，早期EP治疗显著降低肝损伤评分至4.3 ±0.2(n＝10)和减少炎症细胞数至(每个高倍视野142±20，n＝10)；晚期EP治 疗没有显著降低肝损伤评分(6.1±0.6,n＝10)和减少炎症细胞数(220±每个高倍视 野，n＝10)。(1＝对照组，动物饲喂正常饲料，喝正常饮用水，2＝MCD组，动物 饲喂MCD饮食，喝正常饮用水，3＝晚期EP治疗组，动物饲喂MCD饮食10天后 开始添加3％的EP到饮用水来治疗，4＝早期EP治疗组，给动物喂食MCD饮食的 同时，添加3％的EP到饮水中，EP治疗从第一天开始)。

肝组织丙二醛MDA水平

氧化应激是促进NASH发展的重要因素。因此，在本研究测量了肝组织MDA，这 是个能反映活性氧簇ROS的参数。对照组的肝组织样品中有基础水平很低的MDA 浓度。在MCD组中，MDA水平显着增加。EP治疗显著降低MDA浓度(*表示与 对照组相比p<0.05；

肝NF-κB活化

对照组的肝组织样品中有很低的活化NF-κB水平。在MCD组中，NF-κB水平显 着增加。EP治疗显著降低了NF-κB活化(*表明与对照组相比p<0.05；

肠道细菌移位至肠系膜淋巴结((MLN)

我们的研究表明，在对照组中，肠道细菌转位数量很少；然而，在经正常饮用水处理的MCD组中，存在大量的肠道细菌转位。EP治疗(早期和晚期)可显著降低肠道 转位(*表明与对照组相比P<0.05；

血清和肝组织HMGB 1

MCD喂养3周后，各组动物的血清HMGB 1水平均为阴性。正常对照组肝组织 HMGB 1浓度为32.8±3(ng/mL)，MCD饮食喂养组(31.2±4.5)和EP处理组(33.2± 5.6)都没有显著改变肝组织的HMGB 1含量。(数据表示为平均±标准差，每组10 例，p≥0.0 5)。HMGB 1免疫组织化学染色也证实了这一结果，核内HMGB 1在各 组间无差异(阴性结果未显示)。

肝组织TNF-α和IL-6 mRNA水平的研究

与正常对照组相比较，MCD饲料喂养3周后，MCD组和EP治疗组肝脏TNF-α 和IL-6均无明显升高(p≥0.05)。这可能是因为这两种早期炎性细胞因子的治疗窗口 时间较短，其浓度升高的时间不能持续5天[30]。因此，在本模型的前5天，其肝 脏TNF-α和IL-6水平可能升高，并可能导致肝脏损伤，这一假设在以下的实验中 得到了证实：n＝3(每组3只)，和正常组对比，用MCD饲料喂养小鼠2天后，其 肝组织TNF-α mRNA水平增加(3.7±0.5)倍，IL-6mRNA水平增加(9.2±1.1)倍。EP 治疗组均能将肝脏TNF-α和IL-6 mRNA水平降低至正常对照水平(每组均为均值± 标准差，n＝3)。

NASH患者肝细胞凋亡的研究

在本研究中，MCD组和EP组凋亡细胞数量均较少(平均每高倍视野不超过5个)， 各组间无显着性差异，由于试剂盒提供的阳性对照片显示同一染色程序后有大量阳 性凋亡细胞(未显示)，说明染色试剂盒和染色方法为有效的。(1＝对照组，2＝MCD 诱导的NASH+正常饮水组，3＝MCD诱导的NASH+延迟治疗组，4＝MCD诱导 NASH+早期EP治疗组)。

讨论

EP是传统上的注射剂，动物或健康志愿者/病人需要注射EP[13],这对于许多患者来说这是很困难的，因为NASH是一种慢性疾病。本研究成功地在饮用水中添加了 气味良好的EP来治疗实验性NASH，这具有重要的临床意义，因为这种方法容易 为患者所接受。

与正常饮水处理的NASH动物相比，早期和延迟EP治疗均能明显抑制肠道细菌移位，其机制可能是EP改善肝损伤，EP能减轻肝损伤，从而可产生更多的胆汁流 量，由于胆汁对维持肠粘膜完整性和抑制肠道细菌生长有显著影响[35]，EP组可能 比单纯MCD组有更多的肠腔胆汁流量，以帮助恢复肠道固有细菌的稳态。以下证 据进一步证实了这一假说：正常小鼠胆汁流量为90微L/h，NASH明显减少胆汁流 量至25微L/h，EP治疗组有50微L/h胆汁流量(每组5只)。

MCD可显著增加肠细菌向门静脉循环的易位，肠源性细菌/LPS可激活肝聚噬Kupffer细胞(KCs)。在酒精性肝病中，活化的KCs可产生大量的活性氧(ROS)、促 炎细胞因子和趋化因子，这些有害因素可促进肝脏损伤。

在本研究中，早期和晚期炎症介质浓度均未明显增加，因此KCs或其他炎症细胞不大可能通过分泌早期和晚期炎症介质来造成肝脏损伤。我们的结果表明KCs(或其他 炎症细胞)很可能通过产生ROS而导致NASH肝脏损伤，因为KCs是ROS的重要 来源[36]，ROS可以激活NF-kB[13]。

HMGB 1是一种在系统性炎症中起关键作用的晚期炎症介质[29，30]，它参与酒精性肝损伤，肝细胞是HMGB 1的主要来源[32]。在本研究中，血循环中HMGB 1检 测不出，肝组织HMGB 1水平无明显变化，ELISA和肝组织免疫组化均证实了这一 点。提示HMGB 1在NASH的发病机制中可能没有发挥重要作用。

在目前的研究中，丙酮酸乙酯治疗显著降低了血清ALT，但未能显著降低血清AST，这有以下两种可能性：一是NASH主要引起血清ALT升高，AST变化小于 ALT，ALT/AST比值大于2；酒精性肝损伤主要引起血清AST升高，ALT变化小 于AST，AST/ALT比值大于2。第二种可能是AST商用试剂盒不常见的，正常对 照组的AST基线高达170u/L，ALT基线水平为30U/L。

本研究发现MCD喂养后2～3天后肝组织TNF-a和IL-6 mRNA表达增加，从那以后，早期炎性细胞因子(TNF-a和IL-6)和晚期炎症介质HMGB 1均未增加，提示TNF-a 和IL-6可能仅在发病早期才参与肝损伤；此后，早期或晚期炎症介质似乎在NASH 的发展中没有发挥重要作用

在本研究中，各组凋亡细胞数均小于5个/每个高倍镜视野，各组间无显着性差异。试剂盒提供的阳性对照片显示大量阳性染色凋亡细胞，说明染色试剂盒和方法是有 效的，在MCD饮食造成的NASH模型中，细胞凋亡在NASH的发病机制中可能没 有发挥重要作用。

总结：MCD饮食可引起明显的肠道菌群移位，后者可能引起肝脏的炎症细胞浸润。由于肝脏早期和晚期炎症介质的水平没有增加，这些炎症细胞不太可能通过释放炎 症介质来促进肝脏损伤，炎症细胞很可能通过作为ROS的来源而不是通过释放早期 和晚期的炎症介质来促进NASH的发展，ROS可诱导肝细胞脂质过氧化和活化NF- κB信号通路，从而参与NASH肝脏损伤的发生。EP通过降低肠道菌群移位、减 少肝脏炎症细胞浸润、减少肝脏脂质过氧化和抑制NF-κB激活这四种机制，来阻 止NASH的发展。

结论

在饮用水中添加EP可改善NASH预后，其治疗作用至少是部分地通过减少肝脂质氧化和减少肠道细菌移位来实现。EP可作为一种新疗法来治疗并延缓NASH的进 展，并且早期治疗比延迟治疗更有效。

附图说明

图1早期和晚期EP治疗对蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪浸润性肝炎血清ALT/AST的影响

C57BL/6雄性小鼠饲喂MCD饲料3周，诱导NASH，对照组饲喂正常饲料。正常 对照组动物和MCD组动物(仅有NASH)予以正常饮用水；早期EP治疗组从给予 MCD饮食的第一天起，开始饮用添加了3％(v/v)EP的正常饮水；晚期EP治疗组于 MCD喂养后10d开始饮用添加3％(v/v)EP的水。于MCD或正常饮食喂养3周后测 定血清ALT和AST(每组10例)。结果显示均值±标准差。*与对照组比较，P＜0.05；

图2早期和晚期EP治疗对NASH小鼠病理学的影响

在MCD饮食或正常饲料喂养3周后用苏木精-伊红染色来检测肝脏病理。方法和治疗与图1所描述的相同。典型的图片被呈现。(1＝对照组+正常饮食和正常饮水处理 组，2＝MCD+正常饮水处理组，3＝EP-10d，为MCD+10天EP延迟治疗组，4＝EP-1d， 为MCD+早期EP治疗组)。

图3早期和晚期EP对NASH小鼠肝组织丙二醛(MDA)的影响

在MCD饮食或正常饮食后3周测定肝组织MDA含量。方法和治疗与图1相同，(每 组10例)。结果显示为均值±标准差。*代表与对照组比较，P＜0.05；*代表与 MCD组相比P＜0.05。

图4早期和晚期EP对NASH小鼠肝组织NF-κB活化的影响

在MCD饮食或正常饮食后3周测定肝组织NF-kB浓度。方法和治疗与图1相同(每 组10例)。结果显示为均值±标准差。*代表与对照组相比p＜0.05；

图5早期和晚期EP治疗对NASH小鼠肠道细菌移位的影响

在MCD或正常饮食喂养3周后，检测肠系膜淋巴结的肠道细菌移位情况。方法和 治疗与图1相同(每组10例)。结果显示为均值±标准差。*代表与对照组相比p＜ 0.05；

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具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

片剂的制备

丙酮酸乙酯10ml，淀粉60g，羧甲基纤维素20g，微粉硅胶10g，取以上原辅料, 混合，加入润湿剂适量制粒，压片制成1000片片剂，每片片重100mg，含有丙酮酸 乙酯0.1ml。

也可以按照类似方法制备成口服颗粒剂，

丙酮酸乙酯50ml，加加入可溶性淀粉200g，糖粉200g、柠檬酸1.0g及糊精100g， 混匀，加入润湿剂适量制粒4目筛制粒，16目筛整粒，制成颗粒500g即得。

实施例2

口服液的制备

取丙酮酸乙酯10ml，20ml，30ml，40ml或50ml，加水到1000ml，混合制成1000ml 口服液，配制成不同浓度的口服液。

实施例3

实施例2口服液的服用方法

实施例2口服液，患者每日服用100-1000ml。

实施例4、饮料

丙酮酸乙酯20-40ml，EDTA 0.2g，香橙香精1g，蔗糖10g，蒸馏水到1000ml。

取以上原辅料，混合制成1000ml。

实施例5、饮料

丙酮酸乙酯30ml，EDTA 0.2g，香橙香精1g，蔗糖10g，蒸馏水到1000ml。

取以上原辅料，混合制成1000ml。