一种活性无机硫物种双光子荧光探针及其合成方法和应用

摘要

本发明涉及一种活性无机硫物种双光子荧光探针，以1‑芘甲醛‑半花菁为母体，结构通式为：本发明提供活性无机硫物种双光子荧光探针是用于检测RISSs的出色传感器，细胞毒性小，可用于有关H2S和生物硫醇代谢的进一步潜在生物学研究。

说明书

技术领域

本发明具体涉及6个基于1-芘甲醛-半花菁骨架的活性无机硫物种双光子荧光探针及其合成方法和应用，属于生物分析检测技术领域。

背景技术

活性硫物种(Reactive Sulfur Species,RSSs)是内源性活性物质的一种，它是生命体内一类含硫生物分子的总称，包括生物硫醇、硫烷硫、谷胱甘肽、半胱氨酸等，它们都有着十分重要的生物功能，能够参与到生物体的各种生理和病理过程。活体中有机硫物种极易在一系列酶的催化下转变成硫化氢(H

RISSs在生命体中具有多种生理功能并担任重要的作用，已经得到越来越多的生物医学关注和研究。其中，适量的H

由于RISSs在生物系统中的重要性和对S

发明内容

为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明提供了一种活性无机硫物种双光子荧光探针及其合成方法，同时将其用于检测细胞中总RISSs水平。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种活性无机硫物种双光子荧光探针，以1-芘甲醛-半花菁为母体，结构通式为：

进一步地，所述活性无机硫物种双光子荧光探针选自化合物PH-RISSs-1、PH-RISSs-2、PH-RISSs-3、PH-RISSs-4、PH-RISSs-5和PH-RISSs-6；所述化合物PH-RISSs-1、PH-RISSs-2、PH-RISSs-3、PH-RISSs-4、PH-RISSs-5和PH-RISSs-6的化学结构式分别为：

本发明还提供了一种活性无机硫物种双光子荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)将2,3,3-三甲基吲哚1eq和CH

(2)将2,3,3-三甲基吲哚1eq和苄基溴4eq溶于甲苯中，将反应混合物在120℃下回流反应12h，旋干溶剂后，获得黄棕色油状化合物，用体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到中间体化合物1b；

(3)将2,3,3-三甲基吲哚1eq和C

(4)将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚1eq和CH

(5)将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚1eq和苄基溴4eq溶于硝基甲烷中，将反应混合物在120℃下回流反应12h，旋干溶剂后，获得黄棕色化合物，用体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到中间体化合物2b；

(6)将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚1eq和C

(7)取得经过上述步骤(1)至(6)获得的中间体化合物1a、1b、1c、2a、2b和2c和1-芘甲醛溶于无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠，将反应混合物在85℃下回流反应16h，冷却至室温后获得红色固体沉淀，过滤或旋干溶剂后得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，分别得到化合物PH-RISS-1、PH-RISSs-2、PH-RISSs-3、PH-RISSs-4、PH-RISSs-5和PH-RISSs-6。

其中，具体合成路线如下：

进一步地，本发明提供的一种活性无机硫物种双光子荧光探针可应用于检测活细胞中的RISSs，检测条件为激发波为800nm，发射波长为481-521nm和630-670nm。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISSs作为比率探针，所测得的荧光比值信号不受光源的强度和仪器灵敏度的影响，可以减少背景的干扰；同时PH-RISSs作为双光子探针，与单光子探针相比，具有近红外的发射波长，容易穿透细胞且对细胞毒性小；其中，PH-RISS-1和PH-RISS-4荧光探针能在1分钟内快速且强烈地响应H

2、本发明提供的活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISSs合成方法简单，反应步骤少，合成成本低，操作简便。

3、本发明提供的活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISSs细胞毒性小，即使将20μM高浓度的PH-RISS-1、PH-RISS-3、PH-RISS-4和PH-RISS-6荧光探针置于细胞悬液中对L929细胞活力的影响也很小，不影响L929细胞存活率。

附图说明

图1为根据本发明实施例1合成的PH-RISS-1荧光探针与NaHS响应的双光子细胞成像图；

图2为根据本发明实施例1至实施例3合成的PH-RISS-1、PH-RISS-2和PH-RISS-3荧光探针与RISSs(HS

图3为根据本发明实施例1合成的PH-RISS-1荧光探针加入不同分析物前后的紫外吸收光谱；

图4为根据本发明实施例1合成的PH-RISS-1荧光探针加入不同分析物前后的荧光光谱；

图5为根据本发明实施例4合成的PH-RISS-4荧光探针加入不同分析物前后的紫外吸收光谱；

图6为根据本发明实施例4合成的PH-RISS-4荧光探针加入不同分析物前后的荧光光谱；

图7为根据本发明实施例1合成的PH-RISS-1荧光探针与Na

图8为利用CCK-8分析法测定的本发明合成的PH-RISS-1、PH-RISS-3、PH-RISS-4和PH-RISS-6荧光探针对L929细胞活力的影响示意图。

具体实施方式

下面结合较佳实施例和附图1至5对本发明做进一步的说明。

实施例1活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-1的合成和表征

化合物PH-RISS-1合成方法，具体步骤如下：

(1)在250mL的圆底烧瓶中，将2,3,3-三甲基吲哚1eq(8.02mL，0.05mol)和CH

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物1a(0.09g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，冷却至室温后有红色固体沉淀，过滤得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-1，产率90.1％；合成的PH-RISS-1核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-1具体合成路线如下所示：

实施例2活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-2的合成和结构表征化合物PH-RISS-2合成方法，具体步骤如下：

(1)在在250mL的圆底烧瓶中，将2,3,3-三甲基吲哚1eq(4.01mL，0.025mol)和苄基溴4eq(11.89mL，0.1mol)溶于100mL甲苯中，将反应混合物在120℃下回流反应12h，旋干溶剂后，获得黄棕色油状化合物，用体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到中间体化合物1b，产率69.1％；

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物1b(0.10g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，旋干溶剂后，得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-2，产率91.3％；合成的PH-RISS-2核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-2具体合成路线如下所示：

实施例3活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-3的合成和结构表征化合物PH-RISS-3合成方法，具体步骤如下：

(1)在250mL的圆底烧瓶中，将2,3,3-三甲基吲哚1eq(8.02mL，0.05mol)和C

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物1c(0.14g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，旋干溶剂后，得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-3，产率88.7％；合成的PH-RISS-3核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-3具体合成路线如下所示：

实施例4活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-4的合成和结构表征化合物PH-RISS-4合成方法，具体步骤如下：

(1)在250mL的圆底烧瓶中，将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚1eq(5.23g，0.025mol)和CH

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物2a(0.10g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，冷却至室温后有红色固体沉淀，过滤得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-4，产率92.4％；合成的PH-RISS-4核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-4具体合成路线如下所示：

实施例5活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-5的合成和结构表征化合物PH-RISS-5合成方法，具体步骤如下：

(1)在250mL的圆底烧瓶中，将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚1eq(5.23g，0.025mol)和苄基溴4eq(11.89mL，0.1mol)溶于硝基甲烷中，将反应混合物在在120℃下回流反应12h，旋干溶剂后，获得黄棕色化合物，用体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到中间体化合物2b，产率63.2％；

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物2b(0.11g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，旋干溶剂后，得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-5，产率88.5％；合成的PH-RISS-5核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-5具体合成路线如下所示：

实施例6活性无机硫物种双光子荧光探针PH-RISS-6的合成和结构表征化合物PH-RISS-6合成方法，具体步骤如下：

(1)在250mL的圆底烧瓶中，将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(1eq)和C12H25I(3eq)溶于硝基甲烷中，将反应混合物在在120℃下回流反应18h，旋干溶剂后，获得白色化合物，用体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到中间体化合物2c，产率86.4％；

(2)在10mL的圆底烧瓶中，将经过步骤(1)获得的中间体化合物2c(0.15g，0.3mmol)和1-芘甲醛(0.069g，0.3mmol)溶于3mL无水乙醇中，再往圆底烧瓶中加入无水乙酸钠(0.024g，0.03mmol)，将反应混合物在85℃下回流反应16h，旋干溶剂后，得到红色化合物，再利用体积比为15:1的二氯甲烷/甲醇体系进行过柱分离纯化产物，得到化合物PH-RISS-6，产率92.7％；合成的PH-RISS-6核磁共振谱图数据为：

化合物PH-RISS-6具体合成路线如下所示：

实施例7双光子细胞成像实验：

使用实施例1合成的PH-RISS-1荧光探针；首先选取6cm细胞培养皿，除去细胞培养液，用Hank'S液洗两次，洗去残余的培养液，在细胞培养皿中加入PBS作为工作液；接着，在各细胞培养皿分别加入2ml的PH-RISS-1荧光探针、避光孵育一段时间，其中，PH-RISS-1荧光探针浓度为1.5μM，避光孵育15min，孵育完毕后用Hank'S液洗两次细胞培养皿，除去PH-RISS-1荧光探针；最后，往细胞培养皿中加入7mL Hank'S液，在40X水镜下进行观察拍照，再向细胞培养皿中加入不同浓度梯度的RISSs(HS

测试结果参见图1和图2，其中，图1(A)为细胞明场，图1(B)为PH-RISS-1荧光探针在L929细胞中的成像行为，图1(C)图为PH-RISS-1荧光探针在L929细胞中与NaHS响应后的成像行为；从图1中可看出在PH-RISS-1的双光子细胞成像中，PH-RISS-1对L929细胞染色后，在没有RISSs的情况下，细胞呈现弱绿色荧光(Em.449-511nm)和较强红色荧光(Em.623-660nm)，PH-RISS-1与RISSs作用后，绿色荧光变亮，红色荧光消失；依据本发明实施例2和实施例3合成的PH-RISS-2荧光探针和PH-RISS-2荧光探针参照上述方法进行双光子细胞成像实验，其中，PH-RISS-2荧光探针浓度为5μM，避光孵育25min，PH-RISS-3荧光探针浓度为10μM，避光孵育25min；从图2(A)中可以看出PH-RISS-1对HS-的响应最强烈，加入HS-测得PH-RISS-1的FL

实施例8PH-RISS-1和PH-RISS-4荧光探针加入不同分析物前后的紫外吸收光谱检测试验

首先，将PH-RISS-1荧光探针和PH-RISS-4荧光探针分别溶于DMSO溶液中，分别配制成10mM的PH-RISS-1荧光探针和PH-RISS-4荧光探针工作溶液；在比色皿中，取得3uL配制好的PH-RISS-1荧光探针工作溶液和PH-RISS-4荧光探针工作溶液分别加入3mL丙三醇中，利用紫外光谱仪和荧光光谱仪测定未加入分析物前PH-RISS-1荧光探针和PH-RISS-4荧光探针的紫外吸收光谱和荧光光谱；

接着，再向比色皿中分别加入不同浓度梯度的RISSs(HS

参见图3和图4，其中，图3(A)为PH-RISS-1荧光探针与RISSs(HS

参见图5和图6，图5(A)为PH-RISS-4荧光探针与RISSs(HS

参见图7，其中，图7(A)为为PH-RISS-1荧光探针与不同浓度梯度Na

综上所述，本发明合成的PH-RISS-2、PH-RISS-3、PH-RISS-5和PH-RISS-6荧光探针是PH-RISS-1、PH-RISS-4荧光探针的类似物，具有类似的光谱特性。

实施例9PH-RISSs荧光探针细胞毒性测试

测试方法：将L929细胞用胰酶消化，用培养基把细胞轻轻吹下，制成细胞悬液后把细胞铺至96孔板中；实验分为三组，对照组(有细胞、有CCK-8溶液、无探针)，空白组(有培养基、有CCK-8溶液、无细胞、无探针)，实验组(有细胞、有CCK-8溶液、有本发明合成的PH-RISSs荧光探针)；每孔的细胞量为5*103个，每孔培养基200μL，培养24h待细胞贴壁稳固、状态稳定，再向每孔中加入不同浓度(0.5μM、1μM、3μM、50μM、10μM、15μM和20μM)的荧光探针(PH-RISS-1、PH-RISS-3、PH-RISS-4、PH-RISS-6)，孵育20min后，每孔加入20μL CCK-8试剂，置于37℃反应3h后在振荡器上轻轻混匀，放入酶标仪后测定450nm波长吸光度A，检测波长450-490nm，参比波长600-625nm，每一个实验条件设置4个重复孔；

细胞存活率计算：细胞存活率(％)＝[A(实验组)–A(空白组)]/[A(对照组)–A(空白组)]*100％。

参见图8，结果表明PH-RISSs荧光探针细胞毒性小，即使20μM高浓度的PH-RISS-1、PH-RISS-3、PH-RISS-4、PH-RISS-6荧光探针对L929细胞活力的影响也很小。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为活细胞中RISSs水平检测是本发明新化合物的一种用途，不能认定为本发明的化合物仅用于活细胞中RISSs检测，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用于活细胞中RISSs检测的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他用途，都应当视为属于本发明的保护范围。