一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法

摘要

本发明公开了一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法，包括以下步骤：S1：将谷氨酸短肽对应的基因片段插入到M13噬菌体基因的特定位点处，得到连接有谷氨酸短肽的噬菌体；S2：对所述连接有谷氨酸短肽的噬菌体进行富集培养得到M13噬菌体气凝胶；S3：利用所述M13噬菌体气凝胶配制M13噬菌体溶液；S4：对所述M13噬菌体溶液和银离子溶液的混合液进行光照反应得到纳米银。本发明提供的纳米银制备方法具有绿色环保、安全高效、形貌可控、成本低廉的优点。

说明书

技术领域

本发明属于微纳功能材料制造技术领域，具体涉及一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法。

背景技术

随着科技水平的不断进步，纳米技术得到了很大的发展，目前已成功应用于包括医学、药学、化学及生物检测、制造业等多个领域。纳米银，即粒径尺寸为纳米级别的金属银单质，是利用纳米技术将银纳米化，使其具有很高的表面能和化学活性，在超导、光学、催化、传感、抗菌等方面具有广阔的应用前景。纳米技术的应用，使银在纳米状态下的杀菌抗菌性能产生了质的飞跃，极少量的纳米银便可产生强大的杀菌抑菌效果，在数分钟内可有效杀死650多种细菌，广谱、强效持久且无耐药性；另外，纳米银还能促进伤口的愈合、细胞的生长及修复，且对人体细胞无毒副作用，对皮肤也无刺激反应。随着研究的不断深入，纳米银作为最新一代的天然抗菌剂，在医疗器械、家居产品、化妆用品、消炎杀菌、抗菌包装、抗菌敷料等领域得到越来越广泛的应用。

目前，纳米银的合成方法主要有物理法、化学法和生物法三种。其中，物理法原理简单，产品杂质少；化学法成本低廉，技术相对成熟；生物法原料来源广泛，廉价易得，绿色环保，反应条件温和。

然而，物理法合成的纳米粒子尺寸和形貌不可控，且成本昂贵；化学法的合成纳米银的工艺复杂，多使用有毒化学试剂，纳米粒子易团聚，单分散、单一粒径的纳米银产量低；生物法合成纳米银的原理复杂，还原能力有待提高，影响合成效率。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法，包括以下步骤：

S1：将谷氨酸短肽对应的基因片段插入到M13噬菌体基因的特定位点处，得到连接有谷氨酸短肽的噬菌体；

S2：对所述连接有谷氨酸短肽的噬菌体进行富集培养得到M13噬菌体气凝胶；

S3：利用所述M13噬菌体气凝胶配制M13噬菌体溶液；

S4：对所述M13噬菌体溶液和银离子溶液的混合液进行光照反应得到纳米银。

在本发明的一个实施例中，步骤S1包括：

S11：将工程样菌M13的噬菌体质粒通过基因突变去除原有的PstI酶切位点；

S12：将所述工程样菌M13的噬菌体质粒通过基因突变，在编码PⅧ蛋白的基因N端构建PstI和BamHI两个新的酶切位点，得到噬菌体载体；

S13：利用PstI和BamHI双切酶将所述噬菌体载体切开，暴露出粘性末端；

S14：利用DNA连接酶将谷氨酸短肽对应的基因片段与切开的所述噬菌体载体连接，得到连接有编码谷氨酸短肽基因的噬菌体载体。

在本发明的一个实施例中，步骤S2包括：

S21：将所述连接有编码谷氨酸短肽基因的噬菌体载体导入到大肠杆菌感受态细胞内，进行初步扩增繁殖；

S22：对初步扩增繁殖后的大肠杆菌进行蓝白斑筛选，并挑选蓝色单斑接种至液体培养基中继续进行扩增繁殖，得到高浓度的能够展示谷氨酸短肽的噬菌体；

S23：收集所述能够展示谷氨酸短肽的噬菌体，进行冷冻干燥处理得到M13噬菌体气凝胶。

在本发明的一个实施例中，步骤S3包括：称取适量的所述M13噬菌体气凝胶，按照设定的摩尔浓度配制溶液，得到M13噬菌体溶液。

在本发明的一个实施例中，步骤S4包括：

S41：将所述M13噬菌体溶液和银离子溶液按照设定的比例混合，并进行超声水浴处理1min，得到混合溶液；

S42：对所述混合溶液进行光照反应得到纳米银。

在本发明的一个实施例中，所述M13噬菌体溶液和银离子溶液比例范围为1:1～1:5。

在本发明的一个实施例中，所述光照反应的光照强度为8000lux～100000lux。

本发明的有益效果：

1、本发明提供利用光照合成纳米银的方法具有绿色环保，安全高效，成本低廉等优势，同时可通过改变反应物浓度、光照强度以及光照时间来实现纳米银的形貌可控合成；

2、本发明基于M13噬菌体微生物模板实现纳米银的制备，由于M13噬菌体能够侵染带有性菌毛的大肠杆菌，对人体没有毒害，而且在短时间内特别容易大量获得，使得本发明的方法成本低廉，绿色环保；

3、本发明利用M13噬菌体PⅧ蛋白的独特优势，单个噬菌体便可提供2700多个银离子的结合位点，从而极大地提升了纳米银的合成效率。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的M13噬菌体的形貌结构示意图；

图3是本发明实施例提供的M13噬菌体的AFM图；

图4是本发明实施例提供的M13噬菌体的基因图谱；

图5是本发明实施例提供的利用噬菌体展示技术筛选特异性蛋白(多肽)原理示意图；

图6是本发明实施例提供的基因点突变合成载体噬菌体M13SK原理图；

图7是本发明实施例提供的基因重组技术制备连接有谷氨酸短肽的M13噬菌体原理图；

图8是本发明实施例提供的光照合成纳米银的实验装置模型图；

图9是本发明实施例提供的基于M13噬菌体光照条件下绿色合成纳米银原理流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一

请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法流程图。

M13噬菌体作为最常用的微生物模板，在微纳仿生矿化方面具有广泛的应用研究。21世纪初，已有大量学者以M13噬菌体为模板合成了众多纳米材料，并将其应用于锂离子电池、太阳能电池、压电换能器、光解水制氢、抗体合成等领域。

M13噬菌体是一种丝状噬菌体，长约880nm，直径约7nm，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。基因编码合成11种蛋白，其中PⅧ蛋白有2700多个拷贝，分布在噬菌体侧壁面；利用噬菌体展示技术很容易在PⅧ蛋白末端引入目标多肽，制备得到M13噬菌体微生物模板。由于M13噬菌体在基因修饰、蛋白表达等方面具有的独特优势，且M13噬菌体具有成熟的噬菌体展示系统文库，利用噬菌体展示技术很容易实现噬菌体的基因改造，得到噬菌体微生物模板。基于M13噬菌体仿生矿化技术合成的微纳材料已成功应用于锂离子电池、太阳能电池、光解水制氢、压电传感器等多个领域，并取得显著成效。请参见图2～4，图2是本发明实施例提供的M13噬菌体的形貌结构示意图；图3是本发明实施例提供的M13噬菌体的AFM图；图4是本发明实施例提供的M13噬菌体的基因图谱。

本发明提供的一种基于M13噬菌体微生物模板的纳米银绿色制备方法包括以下步骤：

S1：将谷氨酸短肽对应的基因片段插入到M13噬菌体载体基因的特定位点处，得到连接有谷氨酸短肽的噬菌体。

在本实施例中，利用噬菌体展示技术得到连接有谷氨酸短肽的噬菌体主要包括以下步骤：

选取工程化的M13噬菌体载体。

在本实施例中，选择M13KE噬菌体载体作为工程样菌，也可以选择其他的M13噬菌体载体。

请参见图5，图5是本发明实施例提供的利用噬菌体展示技术筛选特异性蛋白(多肽)原理示意图。

将工程样菌M13KE基因6250位点处的胸腺嘧啶(A)变为腺嘌呤(T)，突变去除原有的PstI酶切位点；

将工程样菌M13KE基因1371位点处的腺嘌呤(T)变为胸腺嘧啶(A)，并将1381位点处的胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G)，在编码PⅧ蛋白的基因N端形成BamHI和PstI两个新的酶切位点，得到噬菌体载体M13SK。请参见图6，图6是本发明实施例提供的基因点突变合成噬菌体载体M13SK原理图。

利用PstI和BamHI双切酶将所述噬菌体载体切开，暴露出粘性末端；

利用DNA连接酶将谷氨酸短肽对应的基因片段与切开的所述噬菌体载体连接，得到连接有编码谷氨酸短肽基因的噬菌体载体。请参见图7，图7是本发明实施例提供的基因重组技术制备连接有谷氨酸短肽的噬菌体载体原理图。

在本实施例中，谷氨酸短肽可以是三谷氨酸(3E)、四谷氨酸(4E)，或者其他谷氨酸(比如2E，5E等，E表示一个谷氨酸)。

S2：对所述连接有谷氨酸短肽的噬菌体进行富集培养得到M13噬菌体气凝胶；

由于M13噬菌体能够侵染带有性菌毛(即含有F质粒)的大肠杆菌，对人体没有毒害，而且特别容易在短时间内大量获得，一个300ml的烧瓶培养4小时左右就可得到上万亿个噬菌体，成本低廉，绿色环保，所以本发明选择利用大肠杆菌来完成连接有谷氨酸短肽的噬菌体的富集培养。

在本实施例中，先将步骤S1得到的连接有编码谷氨酸短肽的噬菌体载体导入到大肠杆菌感受态细胞内，进行初步扩增繁殖；然后对初步扩增繁殖后的大肠杆菌进行蓝白斑筛选，并挑选蓝色单斑接种至液体培养基中继续进行扩增繁殖，得到高浓度的能够展示谷氨酸短肽的噬菌体；最后收集所述能够展示谷氨酸短肽的噬菌体，进行冷冻干燥处理，得到M13噬菌体气凝胶并常温干燥保存。

S3：利用所述M13噬菌体气凝胶配制M13噬菌体溶液；

称取适量的所述噬菌体气凝M13噬菌体气凝胶，按照设定的摩尔浓度配制溶液，得到M13噬菌体溶液，并常温保存。

S4：对所述M13噬菌体溶液和银离子溶液的混合液进行光照反应得到纳米银。

在本实施例中，银离子溶液由可溶性银盐(如醋酸银、硝酸银等)制成。在配制银离子溶液时，需要根据所需的纳米银粒径尺寸来确定溶液的浓度。溶液的浓度越高，反应越快，相同的反应时间内，纳米银的粒径尺寸也相应越大。而改变了反应浓度，为了得到所需粒径尺寸的纳米银，则需要同时改变反应时间和光照强度。此外，银离子溶液的浓度选择还与银盐的溶解度有关。例如，醋酸银溶解度为10.2g/L(醋酸银分子量为166.91)，则其最大浓度为61mmol/L，只要不超过这个值，其他浓度均可以实现本发明，而硝酸银完全溶于水，其浓度可以更大，一般选取1mmol/L—100mmol/L的范围。

将M13噬菌体溶液和银离子溶液按照设定的比例混合，并进行超声水浴处理1min，得到均匀的混合溶液；

在本实施例中，不同的比例跟噬菌体的短肽长度有关，这个比例是根据溶液中银离子的浓度和短肽的物质的量来确定的。一般优选配比范围为1:1～1:5，在这个范围内，纳米银的反应速率比较快。其他配比也可以制备纳米银，不过反应速率会下降。

对混合溶液进行光照反应得到纳米银。

在光照反应过程中，光照强度对纳米银的制备有着决定性的影响。当光照强度越大时，反应速率越大，相同反应时间，纳米银的粒径尺寸会越大。本发明提供的方法在制备纳米银时，光照强度优选为8000lux～100000lux。

在本实施例中，光照反应的具体操作为：将混合溶液置于LED平板灯上方，并调整混合溶液的位置，确保溶液反应所需的光照强度，进行光照反应。请参见图8，图8是本发明实施例提供的光照合成纳米银的实验装置模型图。

控制光照反应的时间，观察混合溶液颜色的变化以及测试纳米银的吸收峰值。随着反应时间的增加，混合溶液由无色透明逐渐变为橙色，随后溶液颜色继续增加，变为红色，最终，在反应结束时，溶液呈棕红色。通过紫外分光光度计测试，可以得到纳米银的吸收峰值，吸收峰值大小对应纳米银的含量高低，至此完成纳米银的制备。

请参见图9，图9是本发明实施例提供的基于M13噬菌体光照条件下绿色合成纳米银原理流程图。在本实施例中，利用基因突变及重组克隆技术进行基因修饰，获得M13噬菌体载体，并将M13噬菌体溶液和银离子溶液混合，吸附银离子，最后利用光照合成纳米银，具有绿色环保，安全高效，成本低廉等优势，同时实现了纳米银的粒径尺寸可控制备。

实施例二

下面选择M13KE噬菌体作为工程样菌，以三谷氨酸和醋酸银为例对本发明的方法进行说明。

步骤一：利用噬菌体展示技术将三谷氨酸对应的基因片段(GAAGAGGAA)插入到M13噬菌体基因的特定位点处。

将工程样菌M13KE质粒基因6250位点处的胸腺嘧啶(A)变为腺嘌呤(T)，突变去除原有的PstI酶切位点；

将工程样菌M13KE质粒基因1371位点处的腺嘌呤(T)变为胸腺嘧啶(A)，将1381位点处的胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G)，形成PstI和BamHI两个新的酶切位点，得到M13SK噬菌体载体；

利用PstI和BamHI双切酶将M13SK噬菌体载体切开，暴露出粘性末端；

利用DNA连接酶将三谷氨酸对应的基因片段(GAAGAGGAA)与切开的M13SK噬菌体载体连接，得到噬菌体M13SK-3E。

步骤二：利用大肠杆菌完成噬菌体M13SK-3E的富集培养。

将步骤一得到的噬菌体M13SK-3E导入到大肠杆菌感受态细胞内，完成初步扩增繁殖；

对初步扩增繁殖的大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑选蓝色单斑，接种至液体培养基中继续进行扩增繁殖，提高噬菌体M13SK-3E的浓度；

收取噬菌体M13SK-3E，冷冻干燥处理得到噬菌体气凝胶，常温干燥保存。

步骤三：配制M13噬菌体溶液及醋酸银溶液。

称取适量噬菌体M13SK-3E气凝胶及醋酸银粉末，分别配制M13噬菌体溶液和醋酸银溶液。在本实施例中，M13噬菌体溶液和醋酸银溶液的摩尔浓度均设定为1mmol/L。

步骤四：控制反应条件制备纳米银。

将步骤三配制好的噬菌体M13SK-3E溶液与醋酸银溶液按照设定的比例混合，在本实施例中，选择摩尔比为1:3的比例混合，并进行超声水浴处理1min，使溶液混合均匀；

将混合好的溶液置于LED平板灯上，调整溶液位置，确保溶液反应所需的光照强度为10000lux；

光照2h后，关闭电源结束光照反应，溶液颜色变为橙红色，制备得到平均粒径尺寸为10nm的银纳米颗粒。

实施例三

下面选择M13KE噬菌体作为工程样菌，以四谷氨酸和硝酸银为例对本发明的方法进行说明。

步骤一：利用噬菌体展示技术将四谷氨酸对应的基因片段(GAGGAGGAGGAG)插入到M13噬菌体质粒基因的特定位点处。

将工程样菌M13KE质粒基因6250位点处的胸腺嘧啶(A)变为腺嘌呤(T)，突变去除原有的PstI酶切位点；

将工程样菌M13KE质粒基因1371位点处的腺嘌呤(T)变为胸腺嘧啶(A)，将1381位点处的胞嘧啶(C)变为鸟嘌呤(G)，形成PstI和BamHI两个新的酶切位点，得到M13SK噬菌体载体；

利用PstI和BamHI双切酶将M13SK噬菌体载体切开，暴露出粘性末端；

利用DNA连接酶将四谷氨酸对应的基因片段(GAGGAGGAGGAG)与切开的M13SK噬菌体载体连接，得到噬菌体M13SK-4E。

步骤二：利用大肠杆菌完成噬菌体M13SK-4E的富集培养

将步骤一得到的噬菌体M13SK-4E导入到大肠杆菌感受态细胞内，完成初步扩增繁殖；

对初步扩增繁殖的大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑选蓝色单斑，接种至液体培养基中继续进行扩增繁殖，提高噬菌体M13SK-4E的浓度；

收取噬菌体M13SK-4E，冷冻干燥处理得到噬菌体气凝胶，常温干燥保存。

步骤三：配制M13噬菌体溶液及硝酸银溶液

称取适量噬菌体M13SK-4E气凝胶及硝酸银粉末，分别配制M13噬菌体溶液和硝酸银溶液。在本实施例中，M13噬菌体溶液和硝酸银溶液的摩尔浓度均设定为1mmol/L。

步骤四：控制反应条件制备纳米银

将步骤三配制好的噬菌体M13SK-4E溶液与硝酸银溶液按照设定的比例混合，在本实施例中，选择摩尔比为1:3的比例混合，并进行超声水浴处理1min，使溶液混合均匀；

将混合好的溶液置于LED平板灯上，调整溶液位置，确保溶液反应所需的光照强度为12000lux；

光照2h后，关闭电源结束光照反应，溶液颜色为红色，制备得到平均粒径尺寸为20nm的银纳米颗粒。

本发明利用噬菌体展示技术，将谷氨酸短肽对应的基因片段插入到M13噬菌体的特定基因位点处，从而将谷氨酸短肽融合表达在M13噬菌体的PⅧ蛋白末端，得到用于合成纳米银的M13噬菌体微生物模板。随后，通过改变反应物浓度、光照强度以及光照时间来实现纳米银的尺寸可控合成。这种以M13噬菌体为微生物模板来制备纳米银的方法，利用M13噬菌体PⅧ蛋白的独特优势，单个噬菌体便可提供2700多个银离子的结合位点，从而极大地提升纳米银的合成效率，实现纳米银的绿色环保，安全高效、尺寸可控制备。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。