一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用

摘要

本申请涉及细胞培养领域，具体公开了一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用。ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：将肿瘤细胞接种于孔板中培养；转染细胞；细胞表面染色，通过流式细胞分选仪筛选出ROR1阴性细胞群，将筛选出的ROR1阴性细胞群接种到孔板中继续培养；再次表面染色，再次筛选，继续培养，即得ROR1基因敲除肿瘤细胞株。本申请构建的ROR1基因敲除肿瘤细胞株可用于验证ROR1‑CAR‑T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用。本申请中的构建方法可有效缩减构建ROR1基因敲除肿瘤细胞株的时间，同时也能够获得稳定遗传的ROR1基因敲除肿瘤细胞株，以用于进行靶向肿瘤细胞的杀伤分析。

说明书

技术领域

本申请涉及细胞培养领域，更具体地说，它涉及一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是Ⅰ型受体酪氨酸激酶家族中的重要成员，参与细胞间信号交流、胞内信号转导等过程，调节细胞增殖、分化和转移。ROR1在胚胎期组织中表达，成年正常组织中不表达，然而，当出现肿瘤时，ROR1则在肿瘤组织中高度表达，其在肿瘤细胞增殖、转移和耐药等方面发挥重要作用，已逐渐作为癌症治疗药物的靶标，尤其是靶向实体瘤的CAR-T细胞治疗中具有非常大的应用潜力。

利用CRISPR/Cas9技术敲除肿瘤细胞上的ROR1基因，通过比较ROR1-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力和对ROR1基因敲除的肿瘤细胞的杀伤能力，以判断ROR1-CAR-T细胞的杀伤能力，可为靶向肿瘤杀伤研究提供新的研究平台。

在构建ROR1基因敲除的肿瘤细胞株时，细胞的克隆化培养技术常采用有限稀释法，其原理为将需要克隆的细胞株自培养孔中吸出并作细胞计数，用HT培养液稀释后，接种于培养孔中，剩余的细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种到其余培养孔中；培养一定时间后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆，如此反复操作，直至到100%阳性孔率即可，此种方法也适用于细胞培养中细胞株的识别与分离。

针对上述中的相关技术，发明人认为采用有限稀释法进行筛选ROR1阴性细胞株，需要培养细胞株的时间长达2-3周，所用时间较长。

发明内容

为了提高筛选细胞株的效率，本申请提供一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用。

第一方面，本申请提供一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法，采用如下的技术方案：

一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：

S1、细胞培养：将肿瘤细胞接种于孔板中培养增殖；

S2、转染：使用转染试剂，利用Cas9蛋白与gRNA进行转染肿瘤细胞；

S3、第一次筛选：对转染后的细胞进行表面染色，通过流式细胞分选仪筛选出ROR1阴性细胞群，将筛选出的ROR1阴性细胞群接种到孔板中继续培养；

S4、第二次筛选：对S3中的细胞进行表面染色，通过流式细胞分选仪筛选ROR1阴性细胞群，按照单个ROR1阴性细胞/孔接种到孔板中继续培养45-50h，即得ROR1基因敲除肿瘤细胞株。

通过采用上述技术方案，将有限稀释和流式细胞分选的方法相结合，可有效缩减构建ROR1基因敲除肿瘤细胞株的时间，同时也能够获得稳定遗传的ROR1基因敲除肿瘤细胞株，以用于进行靶向肿瘤细胞的杀伤分析。

优选的，所述步骤S2中Cas9蛋白与gRNA的质量比为（4.8-5.3）:1。

通过采用上述技术方案，选用特定比例的Cas9蛋白与gRNA进行转染细胞，有利于gRNA引导Cas9蛋白对肿瘤细胞进行定向的切割ROR1基因，降低产生脱靶效应的可能性。

优选的，所述步骤S2中，孔板中的肿瘤细胞增殖至50-70%汇合度时再进行转染。

通过采用上述技术方案，转染试剂一般对细胞具有一定的毒性，汇合度较低时进行转染，细胞对转染试剂的耐受性较低，会影响细胞后续的培养扩增；汇合度过高时进行转染，虽然细胞对转染试剂的耐受性要高，但汇合度过高会影响后续的细胞筛选，同时还会降低转染效率。通过在细胞的汇合度达到一个特定范围值时进行转染，一定程度上可提高细胞对转染试剂的耐受性，同时可降低由于细胞过度生长而造成细胞活性损害的可能性。

优选的，所述步骤S2中，转染包括以下步骤：

（1）溶液Ⅰ制备：将1152-1272ng Cas9蛋白、240ng gRNA、2.4-2.6μL Plus™Reagent试剂和24-26μL转染培养基混匀，得到溶液Ⅰ；

（2）溶液Ⅱ制备：将24-26μL转染培养基和1.4-1.6μL转染试剂混匀，得到溶液Ⅱ；

（3）将溶液Ⅰ滴加至溶液Ⅱ中，混匀后于23-27℃下孵育8-12min，得溶液Ⅲ；

（4）将溶液Ⅲ加到孔板中，置于二氧化碳培养箱中孵育，二氧化碳培养箱含5%二氧化碳，温度为36-38℃。

通过采用上述技术方案，Plus™ Reagent试剂与转染试剂的结合可提升转染效率和转染效果；分别制备溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，在孵育前混合溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，可降低直接混合Cas9蛋白与转染试剂时，转染试剂对Cas9蛋白的影响，一定程度上可确保Cas9蛋白具有较好的活性；在特定的温度下进行孵育以制备溶液Ⅲ，有利于形成Cas9蛋白、gRNA和转染试剂的复合物；在特定温度下进行孵育细胞，有利于细胞吸收复合物，从而使得Cas9蛋白在gRNA的引导下能够对肿瘤细胞进行定向的切割ROR1基因。

优选的，所述步骤S3中，细胞表面染色包括以下步骤：

（1）用胰酶消化肿瘤细胞，进行细胞计数；

（2）取0.8*10

另取对照管，加入同型对照抗体小鼠IgG1，置于冰上进行孵育18-22min，然后用缓冲液清洗2-3次；

（3）向（2）中的流式细胞管和对照管中分别加入二抗山羊抗小鼠IgG（H+L）-FITC，置于冰上孵育18-22min后用缓冲液清洗2-3次；

（4）将（3）中孵育后的细胞利用流式分选细胞仪进行筛选，收集ROR1阴性细胞群并接种于孔板中进行培养扩增。

通过采用上述技术方案，小鼠抗人ROR1单克隆抗体能够特异性识别和结合肿瘤细胞上的ROR1基因，同时二抗山羊抗小鼠IgG（H+L）-FITC可以与小鼠抗人ROR1单克隆抗体特异性结合，FITC（异硫氰酸荧光素）可以与细胞中的Cas9蛋白结合，呈现出明亮的黄绿色荧光，从而利用流式细胞仪能够筛选出ROR1阴性细胞群。

第二方面，本申请提供一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株，采用如下的技术方案：

一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株，采用ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法进行构建。

第三方面，本申请提供一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的应用，采用如下的技术方案：

一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的应用，用于验证ROR1-CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请利用流式分选和有限稀释相结合的方式进行筛选ROR1基因敲除肿瘤细胞株，有效的节省了筛选ROR1基因敲除肿瘤细胞株的操作周期，能够获得稳定遗传的ROR1基因敲除肿瘤细胞株。

2、本申请得到的ROR1基因敲除肿瘤细胞株可以逃过CAR-T细胞的杀伤，为肿瘤杀伤研究提供了新的研究平台。

附图说明

图1是本申请实施例的实施例1的ROR1蛋白表达的流式细胞检测图；

图2是本申请实施例的实施例1的ROR1蛋白表达的免疫荧光图；

图3是本申请实施例的实施例1的野生型A549细胞和ROR1基因敲除A549细胞的增殖图；

图4是本申请实施例的实施例2的ROR1-CAR-T细胞对野生型A549细胞和ROR1基因敲除A549细胞的体外杀伤图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。A549细胞表面高度表达ROR1蛋白，是验证靶向ROR1蛋白的CAR-T细胞（即ROR1-CAR-T细胞）在体、内外杀伤能力很好的靶细胞或者工具细胞，本申请在此基础上探究如何快速有效的构建ROR1基因敲除A549细胞株。

本申请中各原料的来源如表1：

表1 各原料的来源

gRNA的制备例

参照《一种gRNA快速合成及检测方法的建立》（中国实验动物学报，2015年6月，第23卷第3期）记载的方法合成本申请中能够靶向ROR1基因的gRNA。gRNA由靶向ROR1基因sgRNA和tracrRNA合成，其中，靶向ROR1基因sgRNA的序列为AACCTCGACACCACAGACAC。

实施例

实施例1

一种ROR1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法，具体包括以下步骤：

S1、细胞培养：取状态健康的A549细胞，按2*10

S2、转染：待24孔板中的细胞增殖至汇合度为60%时开始转染，具体操作如下：

（1）溶液Ⅰ制备：取1250ng Cas9蛋白、240ng gRNA、2.5μL Plus™ Reagent试剂和25 μL Opti-MEM转染培养基，混匀后得到溶液Ⅰ；

（2）溶液Ⅱ制备：取25 μL Opti-MEM转染培养基和1.5 μL CRISPRMAX™ Reagent转染试剂，混匀后得到溶液Ⅱ；

（3）将溶液Ⅰ滴加到溶液Ⅱ中，混匀后于25℃下孵育10min，得到溶液Ⅲ；

（4）将溶液Ⅲ按照50μL/孔加到24孔板中，置于二氧化碳培养中孵育48h，二氧化碳培养箱的温度为37℃，二氧化碳含量为5%。

S3、第一次筛选：收集转染后的细胞进行细胞表面染色，具体操作如下：

（1）用胰酶消化A549细胞1min后进行细胞计数：

（2）按照1*10

（3）向BD流式细胞管和对照管中分别加入浓度为50ug/ml的二抗山羊抗小鼠IgG（H+L）-FITC，每管加入10μL，将BD流式细胞管和对照管置于冰上孵育20min，然后用D-PBS缓冲液清洗两次，得到染色后的细胞。

细胞表面染色完成后，通过流式细胞分选仪筛选出ROR1阴性细胞群，将ROR1阴性细胞按照2*10

S4、第二次筛选：重复第一次筛选中的（1）、（2）和（3）步骤，收集细胞，通过流式细胞分选仪筛选出ROR1细胞群，并按照单个ROR1阴性细胞/孔接种到96孔板中继续培养，得到ROR1基因敲除A549细胞株。

进一步的，确认ROR1基因敲除A549细胞株，待步骤S3中的细胞培养扩增48h后，随机挑选6个96孔板的细胞进行流式细胞鉴定确认，检测结果见图1。

进一步的，对ROR1阴性细胞再次确认，将ROR1阴性A549细胞移入6孔板，做细胞爬片进行免疫荧光检测，再次确认ROR1基因敲除，确认结果见图2。

进一步的，随机选取一个孔板的ROR1阴性A549细胞和野生型A549细胞通过细胞增殖试验进行对比，以观察ROR1阴性A549细胞的增殖能力，细胞增殖试验具体操作如下：

1）将A459细胞和ROR1基因敲除A549细胞按照1*10

2）接种后，分别于接种后的24h、48h、72h和95h，用胰酶消化细胞，并取50μL的细胞悬液与50μL 0.4%台盼蓝混匀，滴加到血球计数板进行活细胞计数，统计并分析细胞的增殖情况，分析结果见图3。

实施例2

一种ROR1基因敲除A549细胞株的应用，将ROR1基因敲除A549细胞株用于验证ROR1-CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用，利用乳酸脱氢酶释放法进行验证，具体验证方式如下：

1）收集对数生长期的野生型A549细胞、ROR1基因敲除A549细胞和ROR1-CAR-T细胞，分别计数备用；

2）将ROR1-CAR-T细胞与野生型A549细胞、ROR1-CAR-T细胞与ROR1基因敲除A549细胞均按照效靶比1:1、5:1和10:1接种到96孔细胞培养板中进行共培养，每组三个重复；对照孔按照相同比例接种对应的T细胞与野生型A549细胞、T细胞与ROR1基因敲除A549细胞进行共培养；

3）细胞共培养达到预定的检测时间前1h，取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%，加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育；

4）到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min，分别取各孔的上清液120μL，加入到新的96孔细胞培养板，然后进行样品测定，测定结果见图4。

参照图1，与同型对照相比，本申请获得的ROR1基因敲除A549细胞产生的峰与同型对照产生的峰基本重合，而A549细胞产生的峰与同型对照产生的峰相分离，表明本申请筛选得到的细胞为ROR1基因敲除A549细胞。

参照图2，图2中横向第一排为野生型A549细胞染色后的免疫荧光图，横向第二排为本申请获得的ROR1基因敲除A549细胞染色后的免疫荧光图，经DAPI工作液染色后，野生型A549细胞的细胞核和ROR1基因敲除A549细胞的细胞核均被染色；对ROR1蛋白进行染色后，野生型A549细胞表达出荧光，ROR1基因敲除A549细胞未表现出荧光，表明本申请获得的ROR1基因敲除A549细胞的ROR1蛋白已被敲除。

参照图3，在一定的培养时间内，野生型A549细胞的增殖速度和本申请获得的ROR1基因敲除A549细胞的增殖速度基本保持一致，表明本申请公开的构建方法可获得稳定遗传的ROR1基因敲除A549细胞株，对ROR1基因敲除A549细胞株的增殖能力没有较大的影响。

参照图4，不同效靶比下，与T细胞对野生型A549细胞的杀伤作用和T细胞对ROR1基因敲除A549细胞的杀伤作用相比，ROR1-CAR-T 细胞对野生型A549细胞的杀伤效果要高于T细胞对野生型A549细胞的杀伤效果，而ROR1-CAR-T 细胞对ROR1基因敲除A549细胞的杀伤效果与T细胞对ROR1基因敲除A549细胞的杀伤效果基本相同，即ROR1-CAR-T 细胞对ROR1基因敲除A549细胞基本没有杀伤作用，原因在于ROR1基因敲除A549细胞不存在被ROR1-CAR-T细胞识别的特异性抗原（ROR1基因），从而导致ROR1基因敲除A549细胞无法被激活而释放效应分子裂解成靶细胞，从而利用ROR1基因敲除A549细胞株可用于验证ROR1-CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用。

与相关技术中采用有限稀释法构建ROR1基因敲除肿瘤细胞株需要耗费2-3周相比，本申请只需要1周时间就能获得稳定遗传的ROR1基因敲除肿瘤细胞株，大大缩减了细胞株的构建时间。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于：将A459细胞替换为NCI-H1975细胞，并对获得的ROR1基因敲除NCI-H1975细胞进行流式细胞鉴定确认和免疫荧光检测。在流式细胞鉴定确认中，结果显示为获得的ROR1基因敲除NCI-H1975细胞产生的峰与同型对照产生的基本重合，而NCI-H1975细胞产生的峰与同型对照产生的峰相分离，表明本申请筛选得到的细胞为ROR1基因敲除NCI-H1975细胞。在免疫荧光检测中，野生型NCI-H1975细胞表达出荧光，ROR1基因敲除NCI-H1975细胞未表现出荧光，表明获得的ROR1基因敲除NCI-H1975细胞的ROR1蛋白已被敲除。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。